Name: Mens in-vivo Bioassay voor de weefsel-specifieke meting van nociceptieve en ontstekingsmediatoren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-12-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Leer microdialyse voor het meten van pijn- en ontstekingsmediatoren in menselijke huid. Deze methode verzamelt interstitiële vloeistof uit geïrriteerde huid voor biochemische analyse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Inductie van experimentele ontsteking: <ol><li> Een van de eerste graad zonnebrand is veroorzaakt in niet-gebruinde huid van een dij met behulp van een gekalibreerd, ultraviolet B bron (Saalmann multitester SBB LT 499, Saalmann GmbH, Hereford, Duitsland). De verbranding door de zon wordt veroorzaakt 24 uur vóór het begin van een microdialyse experiment door het toepassen van drie maal het bedrag van de UVB-licht nodig is om volledige roodheid van de blootgestelde huid, of drie keer de minimale erytheemdosis (MED) veroorzaken. De MED wordt bepaald in elk vak voor de aanvang van de studie. Accurate levering van energie is verzekerd met een UV-meter (RM 12, Dr Grobel UV-Electronic GmbH, Ettlingen, Duitsland). </li></ol> Katheter en sample collectie: <ol><li> Bereid een staging omgeving met steriele handschoenen, een steriele naald de houder, 1cc luer tip injectiespuit met een 23 gauge (G) naald, 1cc spuit met een 30G naald, 1% lidocaïne, in alcohol gedrenkte doekjes, 2x2 steriele gaasjes, microdialyse katheters bevestigd aan een einde aan een 4cm 23G naald (Dermal Dialyse, Erlangen, Duitsland), en 1,5 ml Microcent collectie tubes (E &amp; K Scientific, Santa Clara, CA.) met 4μl proteaseremmer oplossing per 100μl monster op droog ijs. proteaseremmer oplossing wordt gemaakt per instructie fabrikant en met gebruikmaking proteaseremmer cocktail tabletten (Roche Diagnostics, GmbH, Mannheim, Duitsland). </li><li> Bereid een 1% humaan albumine oplossing in Ringerlactaat en trek het in de 1cc luer tip spuit en zorg ervoor dat er geen luchtbellen die nog in de spuit. </li><li> Plaats de spuit met de 1% humaan albumine-verrijkte lactaat Ringer&#39;s in de houder (microdialyse multi-spuit rack, Harvard Apparatuur, Zuid-Natick, MA) gemonteerd op een hoge precisie infusiepomp (Pump 22, Harvard Apparatuur, Zuid-Natick, MA ). Zorg ervoor dat de bar van de infusiepomp het besturen van de spuit volledig in contact komt met de zuiger van de spuit. Stel de pomp tarief na bevestiging dat de injectiespuit diameter correct is ingevoerd in de pomp. Veelgebruikte infusiesnelheden variëren tussen 2 tot en met 4μl/min. </li><li> Definieer het gebied dat u van plan om je monster te verzamelen. Bij de bemonstering van een kunstmatig gecreëerde ontstoken gebied, zoals de zonnebrand hierboven beschreven, een plan op het inbrengen van de katheter aan de rand van de zonnebrand. </li><li> Schoon een klein gebied op tegenovergestelde randen van de laesie, of de site u van plan bent om je monster te verzamelen, met alcohol. Deze gereinigd gebieden zullen de beoogde inbrengen en exit punten voor de katheter worden. Injecteer net genoeg lidocaïne intra-cutaan (bewezen door bleking van de huid op de injectie) op deze sites een zeer kleine blaar (maximaal 2mm) te maken. Injectie van een dergelijke beperkte hoeveelheid van de intra-cutane lidocaïne bij de in-en uitgangen van de microdialyse catheter mag geen invloed op de resultaten van de bioassay maar het inbrengen van de katheter aanzienlijk minder pijnlijk voor proefpersonen te maken. </li><li> Met behulp van aseptische technieken, plaatst u de microdialyse katheters met behulp van bijgevoegde 23G naald over de lengte van de verkend huid. De diepte van inbrengen is op het snijvlak van cutis en subcutis. Invoegen op een adequaat diepte kan optisch worden gecontroleerd. Als de naald en de bijgevoegde katheter naar voren verplaatst de naald moet leiden tot een beetje up-vouwen van de huid evenals enkele bleking van de huid. Geen bloeden te voorkomen. Als bloeden optreden doet dit geeft aan dat de naald is dieper dan de bedoeling is gelegen en de diepte van het inbrengen moet worden aangepast. Zodra de naald werd geduwd door de uitgang van de huid, spoel de katheters met 1% albumine verrijkt lactaat Ringer&#39;s tot je druppels langs de lengte van de katheter. Dit wordt gedaan door het zorgvuldig inbrengen van de naald einde van een spuit (23G naald) in het distale uiteinde van de microdialyse catheter, en langzaam injecteren oplossing. </li><li> Na het spoelen van de katheter voorzichtig aan de naald om de bijgevoegde catheter voeden via de huid. Voorzichtige behandeling is nodig omdat de katheters zijn kleine diameter, en dus kwetsbaar. Trek de katheter totdat deze volledig schroefdraad door de huid, dat wil zeggen, de basis van de grotere plastic buis inbedding van het distale uiteinde van de katheter raakt de huid op de ingang. Zoals hierboven vermeld, weinig tot geen bloeden aan het einde van de procedure bevestigt optimale catheter plaatsing. </li><li> Bevestig het distale uiteinde van de katheter aan de top van de 23G naald van de spuit rusten in het rek van de infuuspomp. Zorg is nodig om te voorkomen dat aanprikken van de naald door de wand van de katheter, die zou leiden tot potentiële lekken. </li><li> Snijd de naald uit de proximale uiteinde van de katheter. </li><li> Met behulp van ¼ inch roze tape, sluit u de 1,5 ml bereid Microcent collectie tube op de huid dicht bij de afrit site van de katheter. Plaats de tip van de katheter in de collectie buis voor het verzamelen van microdialysate mogelijk te maken. Start de perfusie pomp op vooraf bepaalde rat en met tussenpozen controleren dat de geleverde en verzameld volume match-up. In het geval dat de volumes niet met elkaar overeenkomen, lekkage van de huid entry site moet worden uitgesloten (kan soms worden opgelost door te trekken het gedeelte van de katheter dat is ingesloten door de plastic buis meer stevig op de huid entry site). Als alternatief kan een katheter moet worden vervangen als geleverd en verzamelde volumes niet met elkaar overeenkomen. </li><li> Zodra bemonstering is voltooid, worden de monsters die op droog ijs tot opslag bij -80 º C. </li></ol>

<ol><li>Angst, M. S., Clark, J. D., Carvalho, B., Tingle, M., Schmelz, M., Yeomans, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+profile+in+human+skin+in+response+to+experimental+inflammation%2C+noxious+stimulation+and+administration+of+a+COX-inhibitor%3A+A+microdialysis+study%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Cytokine profile in human skin in response to experimental inflammation, noxious stimulation and administration of a COX-inhibitor: A microdialysis study.</a> Pain. 139, 15-27 (2008).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te melden.

Het gecombineerde gebruik van microdialyse technieken en multiplex immunoassay technologie is een waardevolle real-time, in-vivo menselijke bioassay inzicht te geven in biochemische gebeurtenissen in weefsel van belang. Gecombineerd met gedragstesten, zoals pijn tests, de methode maakt het mogelijk het bestuderen van de complexe interacties van biochemicaliën bemiddelen pijn en ontsteking. De methode is veelbelovend voor 1) het identificeren van weefsel-specifieke biomarkers bemiddelen pijn en ontsteking, 2) het verstrekken van mechanistisc...

<table><tbody><tr><td>Microdialysecatheter</td><td>Instrument</td><td>Dermal Dialysis</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Pump 22</td><td>Instrument</td><td>Harvard Apparatus</td><td>552219</td><td></td></tr><tr><td>Saalmann Multitester SBB LT 400</td><td>Instrument</td><td>Saalmann GmbH</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>RM-12 IP-65 Radiometer</td><td>Instrument</td><td>Dr. Grobel UV Elektronik GmbH</td><td>82120000/81112100</td><td></td></tr><tr><td>Complete Proteinase Inhibitor</td><td>Reagens</td><td>Roche Group</td><td>11836145001</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugebuisje</td><td>Instrument</td><td>E&amp;amp;K Scientific</td><td>380150-X</td><td></td></tr><tr><td>Albumine 5%</td><td>Reagens</td><td>ZLB Behring</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Ringer-lactaat</td><td>Reagens</td><td>Hospira Inc.</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Xylocaine-MPF</td><td>Overig</td><td>AstraZeneca</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Spuit 1mL</td><td>Instrument</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td></td></tr></tbody></table>

mens in-vivo bioassay voor de weefsel-specifieke meting van nociceptieve en ontstekingsmediatoren

Human In-Vivo Bioassay for the Tissue-Specific Measurement of Nociceptive and Inflammatory Mediators

Deze in-vivo menselijke bioassay kan worden gebruikt om menselijke vrijwilligers en patiënten te bestuderen. Monsters worden verzameld van relevante sites, zoals weefsel van de huid via aseptisch ingebracht microdialyse katheters (Dermal Dialyse, Erlangen, Duitsland). Geïllustreerd in dit voorbeeld is het verzamelen van interstitiële vocht uit experimenteel ontstoken huid in menselijke vrijwilligers. Monsterneming kan gecombineerd worden met andere experimentele tests. Bijvoorbeeld, de gelijktijdige beoordeling van lokaal vrijgegeven biochemicaliën en subjectieve gevoeligheid voor pijnprikkels in experimenteel ontstoken huid biedt de kritische biochemische-gedragsmatige link naar biomarkers van pijn en ontsteking te identificeren. Gepresenteerd assay in de levende menselijke organisme zorgt voor mechanistisch inzicht in de weefsel-specifieke processen die ten grondslag liggen pijn en / of ontsteking. De methode is ook zeer geschikt om de effectiviteit van bestaande of nieuwe interventies te onderzoeken - zoals de nieuwe kandidaat-geneesmiddelen - gericht op de behandeling van pijnlijke en / of ontstekingen. Dit artikel geeft een gedetailleerde beschrijving van het gebruik van microdialyse technieken voor het verzamelen van interstitiële vloeistof uit experimenteel ontstoken huid laesie van de menselijke proefpersonen. Interstitiële vloeistof monsters worden meestal verwerkt met behulp van multiplex bead array-immunoassays waardoor het testen van maximaal 100 analyten in monsters zo klein in volume als 50 microliter.

Een techniek wordt gepresenteerd voor de in-vivo collectie van interstitiële vloeistof monsters van weefsel relevante sites (hier, experimenteel ontstoken huid) voor het meten van biochemische bemiddelen pijn en ontsteking.

Mens in-vivo Bioassay voor de weefsel-specifieke meting van nociceptieve en ontstekingsmediatoren

Deze in-vivo humane bioassay kan worden gebruikt om menselijke vrijwilligers en patiënten te bestuderen. Monsters worden verzameld uit relevante weefselplaatsen, zoals de huid, via ...

Deze video begint 24 uur na de inductie van de experimentele zonnebrand op het dijbeen van een patiënt met behulp van een gekalibreerde UV-lichtbron. Na toediening van een lokale verdoving wordt een microdialysekatheter tussen de incisies en het subcutane weefsel ingebracht en vervolgens door de huid getrokken. Een perfusiespuit wordt aan het proximale uiteinde van de katheter bevestigd, en de activering van de perfusiepomp zal de stroom en collectie van microlysaat induceren.Na afname kunnen de monsters worden bewaard bij minus 80 graden Celsius tot de analyse van nociceptieve en inflammatoire mediatoren kan worden uitgevoerd. Hallo, ik ben Martin Angst van de afdeling Anesthesiologie van de Stanford University. En hallo, ik ben Martha Tingle, senior research nurse en manager van het Human Pain Laboratory, dat in 1995 door Dr. Angst werd opgericht hier aan de Stanford University.Vandaag laten we u een procedure zien voor het plaatsen van microdialysekatheters in experimenteel ontstoken huid van menselijke studieparticipanten voor het verzamelen van interstitiële vloeistof. We gebruiken deze techniek in ons laboratorium om de weefselspecifieke afgifte van biochemische stoffen te bestuderen die cruciaal zijn voor de bemiddeling van pijn en ontsteking. Laten we beginnen.Eén model voor experimentele huidontsteking is de kunstmatige zonnebrand. Een eerstegraads zonnebrand wordt geïnduceerd met behulp van een gekalibreerde ultraviolet B-bron. Nauwkeurige toediening van energie wordt gewaarborgd met een UV-meter.Zonnebrand wordt gewoonlijk opgewekt door twee tot drie keer de hoeveelheid UVB-licht toe te dienen die nodig is om roodheid te veroorzaken. Bereid vóór het verzamelen van de monsters een werkstation voor met steriele handschoenen, een steriele naaldhouder en 1 CC luer-tip spuiten met naalden van 23 gauge en 30 gauge; u heeft ook microdialysekathers nodig die aan één uiteinde zijn bevestigd aan een naald van 4 cm en 23 gauge. Monsters worden verzameld in 1,5 milliliter microcentrifugebuisjes die 4 µL protease-inhibitoroplossing per 100 µL monster bevatten. De protease-inhibitoroplossing wordt bereid volgens de instructies van de fabrikant met behulp van protease-inhibitorcocktailtabletten. Bereid een 1% menselijke albumine-oplossing in lactaat-Ringer-oplossing en trek deze op in de 1 CC luer-tip spuit, waarbij u erop let dat er geen luchtbellen in de spuit achterblijven. Plaats de spuit met de met 1% menselijk albumine verrijkte Ringer-lactaat-oplossing in de houder die is gemonteerd op een precisie-infusiepomp. Meerdere spuiten kunnen worden geladen om gelijktijdig interstitiële vloeistofmonsters van verschillende locaties te verkrijgen.Zorg ervoor dat de stang van de infusiepomp die de spuit aandrijft, volledig in contact staat met de zuiger van de spuit. Stel de pompsnelheid in nadat is bevestigd dat de diameter van de spuit nauwkeurig in de pomp is ingevoerd. Veelgebruikte infusiesnelheden liggen tussen de twee en vier µL per minuut.U bent nu klaar om de katheter te plaatsen. Bij het bemonsteren van een kunstmatig ontstoken gebied, zoals een experimenteel opgewekte zonnebrand, moet het gebied waaruit monsters worden genomen worden gedefinieerd. Plan de insertie van de katheter aan de rand van de zonnebrand.Reinig met alcoholgaasjes een klein gebied aan de tegenoverliggende randen van de laesie of C-site waarvan u het monster wilt afnemen; deze gereinigde gebieden dienen als de beoogde inbreng- en uitgangspunten voor de catheter. Injecteer met een spuit van 1 cc met een naald van 30 gauge 1% lidocaïne; injecteer op deze plaatsen, waarbij het wit worden van de huid bij injectie als bewijs dient, net genoeg lidocaïne om een zeer kleine bleb met een maximale grootte van 2 mm te creëren. Het injecteren van een kleine hoeveelheid lidocaïne bij de in- en uitgangspunten van de microdialysecatheter maakt de inbreng van de catheter minder pijnlijk voor de proefpersonen, maar mag de resultaten van de bioassay niet beïnvloeden. Gebruik hierbij aseptische technieken.Plaats de microdialysecatheters met behulp van de bijgevoegde 23 gauge naald over de lengte van het onderzochte huidgebied. De insertiediepte bevindt zich op de interface tussen de dermis en het subcutane weefsel. Adequate penetratie kan visueel worden geverifieerd terwijl de naald en de bevestigde catheter naar voren worden bewogen.De naald moet een lichte plooiing van de huid veroorzaken, evenals een zekere bleking van de huid. Er mag geen bloeding optreden; indien er wel bloeding optreedt, bevindt de naald zich dieper dan bedoeld en moet de insertiediepte worden aangepast.Zodra de naald door het uitgangspunt van de huid is geduwd, trek dan voorzichtig aan de naald om de vastgemaakte katheter door de huid te geleiden. Voorzichtige hantering is essentieel omdat de katheters een kleine diameter hebben en zeer fragiel zijn. Trek de katheter door totdat deze volledig door de huid is geregen tot aan de basis van de grotere plastic slang.Het distale uiteinde van de katheter moet de huid raken bij het insteekpunt. Er mag opnieuw weinig tot geen bloeding optreden, wat aangeeft dat de katheter correct is geplaatst. Om te beginnen met de monstername, spoelt u de katheters eerst met Ringerlactaatoplossing verrijkt met 1% albumine.Dit wordt gedaan door een spuit met een naald van 23 gauge voorzichtig in het distale uiteinde van de microdialysecatheter te plaatsen en langzaam de oplossing in te spuiten. Spoel de catheter door tot er druppels zichtbaar zijn over de gehele lengte van de catheter en aan de punt. Bevestig na het doorspoelen van de catheter het distale uiteinde van de catheter aan de punt van de 23 gauge naald van de spuit die in het rek van de infusiepomp rust.Voorkom dat de naald door de wand van de katheter wordt geprikt, wat zou kunnen leiden tot lekkage, door kwart inch roze tape te gebruiken. Bevestig de voorbereide 1,5 milliliter microcentrifugebuis op de huid dicht bij de uitgangszijde van de katheter. Plaats de punt van de katheter in de opvangbuis om de collectie van microlysaat mogelijk te maken.Start de perfusiepomp op de vooraf bepaalde snelheid en controleer tussentijds of het geleverde en het opgevangen volume overeenkomen, voor het geval de volumes niet overeenkomen. Controleer of er lekkage is bij de insteekplaats op de huid. Lekkages bij de insteekplaats kunnen soms worden verholpen door het deel van de katheter dat is ingebed in de plastic slang strakker tegen de insteekplaats op de huid aan te trekken.Als alternatief moet een katheter mogelijk worden vervangen als deze is ingebracht en weer is teruggehaald. De volumes komen niet overeen zodra de bemonstering is voltooid. De monsters worden op droogijs bewaard tot opslag bij -80 °C.We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u interstitiële vloeistof verzamelt uit experimenteel ontstoken huid met behulp van microdialysekatheters. We zijn nu klaar om de verkregen monsters te analyseren met immunoassays voor biochemische markers van pijn en ontsteking. Tijdens deze procedure is het belangrijk om de katheters zeer zorgvuldig te hanteren; voer de katheters langzaam in zonder spanning op de slangetjes uit te oefenen. Het kan nuttig zijn om de katheters vóór insertie te smeren met een kleine hoeveelheid van de steriele oplossing die u heeft klaargemaakt voor de infusiefase van de studie.Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

human-vivo-bioassay-for-tissue-specific-measurement-nociceptive

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een techniek voor het verzamelen en chirurgische wond biochemische mediatoren te meten op specifieke tijdstippen.

Het verzamelen en meten van nociceptieve en inflammatoire mediatoren in chirurgische wonden

Algoritmes het beoordelen van warmte en mechanische pijn drempels in experimenteel ontstoken huid van de menselijke proefpersonen worden weergegeven. De twee pijn het testen van paradigma's onafhankelijk van elkaar nociceptieve verwerking van onderzoeken door de twee grote perifere zenuw fiber populaties verzenden van pijn, dat wil zeggen, niet-gemyeliniseerde C-vezels en kleine gemyeliniseerde A-delta vezels.

Het bepalen van warmte en mechanische pijngrens in ontstoken huid van proefpersonen

This video demonstrates the quantification of inflammatory mediators during infection by incubating human lung-tissue-derived immune cells with Haemophilus influenzae. Flow cytometry is used to measure cytokine fluorescence in labeled lymphocytes, correlating with the production of pro-inflammatory cytokines in response to bacterial infection.

Quantification of Inflammatory Mediators in Infected Human Tissue-Derived Cells

Om de veranderingen van nociceptieve intraepidermal zenuwvezels (IENFs) in pijnlijke neuropathieën (PN) te bestuderen, ontwikkelden we protocollen die direct kon onderzoeken driedimensionale morfologische veranderingen waargenomen in nociceptieve IENFs. Drie-dimensionale analyse van IENFs heeft de potentie om de morfologische veranderingen van IENF in PN evalueren.

Driedimensionale beeldvorming van Nociceptieve Intraepidermal zenuwvezels in Menselijke huid Biopsieën

We beschrijven een niet-invasieve beeldvorming methode voor het onderscheiden van inflammatoire fasen. Systemische toediening van luminol onthult gebieden van acute ontsteking afhankelijk MPO-activiteit in neutrofielen. Daarentegen injectie lucigenine maakt visualisatie van chronische inflammatie afhankelijk Phox activiteit in macrofagen.

In vivo beeldvorming methode om acute en chronische ontsteking Onderscheid

We beschrijven een protocol bij de ontwikkeling van door opioïden veroorzaakte hyperalgesie en tolerantie in muizen te onderzoeken. Op basis van de meting van thermische en mechanische nociceptieve reacties van naïeve en morfine behandelde dieren, het mogelijk om de toename van gevoeligheid voor pijn (hyperalgesie) kwantificeren afname analgesie (tolerantie) geassocieerd met chronische opiaat toediening.

Beoordeling van de Morfine-geïnduceerde hyperalgesie en analgesietolerantie in Muizen middel van thermische en mechanische Nociceptieve modaliteiten

In dit artikel wordt de toepassing van fluorescerende beeldvorming beschreven met behulp van een activeerbare optische beeldsensor om de in vivo activiteit van belangrijke matrixmetalloproteinasen te visualiseren in twee verschillende experimentele modellen van ontsteking.

Niet-invasieve<em&gt; In Vivo</em&gt; Fluorescentie Optische Imaging van Inflammatorische MMP Activiteit Met behulp van een Activateerbare Fluorescerende Imaging Agent

Morfologische veranderingen optreden in immuun responsieve fibroblast cellen na activering en het bevorderen van veranderingen in cellulaire werving. Gebruik makend van 2-Photon Imaging in combinatie met een genetisch gemanipuleerde fibroblast-specifieke proteïne 1 (FSP1)-CRE; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) muis lijn en groene fluorescently gelabeld lipopolysaccharide-FITC, we kunnen zeer specifieke opname van lipopolysaccharide in dermale fibroblasten en morfologische veranderingen in...

In vivo tweekleurige 2-Fobe beeldvorming van genetisch gelabelde reporter cellen in de huid

Er wordt een standaardprotocol beschreven om de antitumoractiviteit en bijbehorende toxiciteit van IL-1α te bestuderen in een syngene muismodel van HNSCC.

Evaluatie van de in vivo antitumoractiviteit van polyanhydride IL-1α nanodeeltjes

Hier presenteren we een aangepast inflammatoir pijnmodel met de carrageeninjectie met beide achterpoten om het pijnstillende effect te evalueren.

Een gemodificeerd inflammatoir pijnmodel om het pijnstillende effect bij muizen te bestuderen

Het protocol beschrijft hoe kniehyperalgesie bij muizen kan worden gemeten. We laten voorbeelden zien in muismodellen van acute kniepijn en in modellen van artrose (OA).

Beoordeling van kniehyperalgesie bij muizen met behulp van drukmeting

Leer microdialyse voor het meten van pijn- en ontstekingsmediatoren in menselijke huid. Deze methode verzamelt interstitiële vloeistof uit geïrriteerde huid voor biochemische analyse.

Mens in-vivo Bioassay voor de weefsel-specifieke meting van nociceptieve en ontstekingsmediatoren

Meer video's verkennen