Drosophila larven NMJ Dissection
4 februari 2009
Dit protocol laat zien hoe om te ontleden Drosophila Larven ter voorbereiding van immunohistochemie en / of beeldvorming van de neuromusculaire overgang.
Deze procedure begint met het plaatsen van een larve in het derde stadium op de dissectieplaat. Spelden worden in het posterieure en anterieure uiteinde van de larve geplaatst. Een schaar wordt gebruikt om de larve open te snijden en een pincet wordt gebruikt om de interne organen te verwijderen.
Ten slotte worden er vier extra spelden in elke hoek van de lichaamswand van de larve geplaatst om deze tijdens de fixatie strak gespannen te houden. Hallo, ik ben Jonathan Brent van het laboratorium van Brian McCabe van de afdeling Fysiologie en solo-biofysica aan het Columbia University College of Physicians and Surgeons. Vandaag laten we u de procedure zien voor de dissectie van drosophila-larven en MJ.
Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de synaptische ontwikkeling van de neuromusculaire overgang te bestuderen. Laten we beginnen. In drosophila-larven zijn er 30 spieren per hemisegment waarvan de schikking binnen de perifere lichaamswand bekend is.
In totaal innerveren 35 motorneuronen deze spieren in een zeer stereotiep patroon. Om de neuromusculaire junctie of NMJ te bereiken, is het noodzakelijk om elke larve zorgvuldig te dissekeren met de juiste dissectietechniek. De NMJ kan worden gebruikt voor imaging, immunohistochemie of elektrofysiologie.
Begin de procedure door een druppel HL 3.1-buffer op een dissectieplaatje te plaatsen. De buffer is vooraf bereid en op ijs gekoeld. Pak voorzichtig een rondzwemmende third end star-larve van de zijkant van het vial met een grote SS-pincet.
De beweging geeft aan dat de larve nog niet is begonnen met de verpopping. Plaats de larve met de dorsale zijde naar boven in de bufferdruppel op de dissectieplaat. De koude buffer zal de larve anesthetiseren en stilhouden. Plaast met een pincet een insectennaald tussen de posterieure sferen, en plaats vervolgens een tweede naald dicht bij de donkere mondhaken, zodat de larve is uitgerekt en klaar is om open te worden gevouwen.
Maak met veerschaartjes een kleine horizontale incisie richting het posterieure uiteinde van de larven. Steek één blad van de schaar in de incisie en maak een lengtesnede richting het anterieure uiteinde van de larve. Maak vervolgens horizontale incisies aan het anterieure uiteinde van de larven, links en rechts van de speld.
Om organen zoals het darmstelsel te verwijderen, voegt u enkele druppels HL 3.1-buffer toe aan het dier; de darmen en andere organen zullen naar boven drijven in de oplossing en kunnen met een pincet van het lichaam worden weggetrokken. Verwijder tevens het tracheaalstelsel samen met de overige organen. Leg nu de interne lichaamspieren bloot door de flappen die door de incisies zijn gemaakt, met spelden terug te pinnen.
Zorg ervoor dat de lichaamswanden horizontaal en verticaal worden opengetrokken. Wanneer de flappen worden vastgepind, dient u eventuele resterende organen te verwijderen en eenmaal te wassen.
Door vers HL 3.1-buffer toe te voegen, is de larve nu klaar om gefixeerd te worden met vers bereid formaldehyde, verdund tot 3,5% in 1xPBS. Dompel de larven volledig onder in het fixeermiddel en wacht 25 minuten. Wanneer de fixatieperiode is verstreken, worden de larven twee keer gedurende drie minuten gewassen met HL 3.1-buffer. Verwijder voorzichtig de pinnen en breng de larven indien nodig over naar 1,5 ml buisjes met 1xPBS.
De larven kunnen tot twee dagen worden bewaard bij vier graden Celsius. Gebruik de gedissecteerde larven voor optimale resultaten onmiddellijk. Er zijn verschillende sleutelcomponenten bij een correct gedissecteerde drosophila-larve.
Zorg er allereerst voor dat de spieren niet beschadigd raken, in het bijzonder spier zes, zeven en vier. Ten tweede moet het dier correct worden uitgestrekt. Anders is de neuromusculaire overgang mogelijk niet toegankelijk of te onderscheiden.
Hier ziet u een correct gedissecteerde larve. De NMJ is duidelijk zichtbaar en het systeem is nu klaar voor experimenten. We hebben u zojuist laten zien hoe u oesofageale larven disseceert om de neuromusculaire junctie te bestuderen.
Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de spieren intact te laten. Als de spieren beschadigd raken, zijn er geen neuromusculaire juncties meer om te bestuderen. Dat is alles.
Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol demonstreert hoe Drosophila-larven worden gedisseceerd ter voorbereiding op immunohistochemie en/of beeldvorming van de neuromusculaire junctie. De procedure omvat het zorgvuldig plaatsen van spelden en het gebruik van scharen en pincetten om de larven voor verdere analyse voor te bereiden.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Ontwikkelingsbiologie
- Immunohistochemie
Achtergrond
- Drosophila-larven worden veelvuldig gebruikt in neurobiologisch onderzoek.
- De neuromusculaire overgang is een cruciaal gebied voor het bestuderen van synaptische transmissie.
- Correcte dissectietechnieken zijn essentieel voor succesvolle beeldvorming en analyse.
- Dit protocol biedt een gestandaardiseerde methode voor larvale dissectie.
Doel van de studie
- Om Drosophila-larven voor te bereiden voor immunohistochemische analyse.
- Om de beeldvorming van de neuromusculaire overgang te faciliteren.
- Om dissectietechnieken te standaardiseren voor reproduceerbaarheid in onderzoek.
Gebruikte methoden
- Plaatsing van spelden om de larven tijdens de dissectie te stabiliseren.
- Gebruik van een schaar om de larven te openen.
- Verwijdering van de interne organen met een pincet.
- Fixatie van de lichaamswand voor beeldvormingsdoeleinden.
Belangrijkste resultaten
- Een succesvolle dissectie maakt een duidelijke visualisatie van de neuromusculaire overgang mogelijk.
- Gestandaardiseerde methoden verbeteren de consistentie tussen experimenten.
- Faciliteert verdere studies naar synaptische functie en ontwikkeling.
- Biedt een basis voor toekomstig onderzoek in de neurobiologie van Drosophila.
Conclusies
- De dissectie van Drosophila-larven is een cruciale stap voor neurobiologisch onderzoek.
- Correcte technieken verbeteren de kwaliteit van de immunohistochemische analyse.
- Dit protocol dient als een waardevolle bron voor onderzoekers in dit vakgebied.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
De neuromusculaire junctie (NMJ) van Drosophila-larven dient als een genetisch hanteerbaar model voor het bestuderen van synaptische ontwikkeling en plasticiteit, waarbij een hoge toegankelijkheid en resolutie op single-celniveau worden geboden. Dit dissectieprotocol maakt een reproduceerbare preparatie van de NMJ mogelijk voor downstream-toepassingen zoals imaging, immunohistochemie en elektrofysiologie, wat bijdraagt aan targetvalidatie en mechanistische risicoreductie in vroege discovery-fasen. Door een gestandaardiseerde methode te bieden voor het isoleren en visualiseren van synaptische structuren, verhoogt deze techniek het voorspellende vertrouwen bij de beoordeling van neurobiologische targets en de verduidelijking van signaalpaden.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen met betrekking tot synaptische functies en neuro-ontwikkelingspaden te onderzoeken.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door middel van getrouwe visualisatie van innervatiepatronen tussen motorneuronen en spieren.
- Voorspellende waarde: Faciliteert de beoordeling van genetische of farmacologische interventies op de morfologie en functie van de NMJ.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheidsgraad van de assay: Bereidt gestandaardiseerde biologische systemen voor op compound-screening met consistente toegankelijkheid van de NMJ.
- Kwantitatieve outputs: Maakt meting van het aantal synaptische boutons, de grootte en de proteinlokalisatie mogelijk als fenotypische read-outs.
- Schaalbaarheid: Ondersteunt parallelle verwerking van larven voor screeningcampagnes met een medium throughput.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Modelleert geconserveerde synaptische mechanismen die toepasbaar zijn op de validatie van targets voor neurodegeneratieve en neuromusculaire aandoeningen.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen genetische bevindingen in Drosophila en de synaptische biologie van zoogdieren via geconserveerde pathways.
- Mechanische risicoreductie: Maakt vroege evaluatie mogelijk van target-interactie en pathway-modulatie in een levend, intact systeem.
Integratie van Pipeline & Workflow
De dissectieworkflow integreert in de vroege ontdekkingsfase door hypothesetoetsing mogelijk te maken, gaat over tot lead-identificatie via kwantificeerbare synaptische fenotypes en ondersteunt preklinische validatie via fenotypische screening die relevant is voor de ziekte.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt de verduidelijking van synaptische paden en functionele targetvalidatie door middel van directe visualisatie van de NMJ.
- Screening: Levert assay-klare preparaten met reproduceerbare structurele en fluorescerende read-outs voor de evaluatie van verbindingen.
- Analytica: Genereert kwantitatieve morfologische en immunohistochemische gegevens voor vergelijkende analyse van condities.
- Translationeel onderzoek: Verbindt synaptische mechanismen van Drosophila met preklinische modellen via geconserveerde moleculaire paden.
- Herbruikbaarheid binnen de organisatie: Vestigt een herbruikbaar platform voor de beoordeling van neurotargets over meerdere ontdekkingscampagnes heen.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in doelvalidatie door mechanische ambiguïteit in synaptische studies te verminderen.
- Operationele waarde: Waarborgt standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van NMJ-preparaties tussen laboratoria.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroege detectie van synaptische toxiciteit of target engagement mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van neurotargets op basis van functionele synaptische resultaten.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in de hantering van Drosophila, microchirurgie en fluorescentiemicroscopie.
- Afhankelijk van dissectieplaten, insectenspelden, veerscharen, pincetten en HL 3.1-buffer.
- Vereist standaardisatie van de speldspanning en buffercondities tussen verschillende gebruikers.
- Overwegingen bij aanpassing omvatten variërende larvale stadia en genetische achtergronden die de integriteit van de spieren beïnvloeden.
- Praktische beperkingen omvatten eisen aan handbehendigheid en mogelijke beschadiging van spieren bij onnauwkeurige dissectie.
