Name: Drosophila larven NMJ Dissection (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: Leer de dissectie van Drosophila larven voor neuromusculaire junctie-onderzoek. Deze methode maakt immunohistochemie en beeldvorming mogelijk voor synaptische ontwikkelingsstudies.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Voordat u begint <ol><li> Alle culturen moeten worden gekweekt bij 25 ° C. </li><li> HL3.1 dissectie buffer kunnen worden bereid op voorhand. Neem een ​​50 ml van HL3.1 en houd het op ijs. </li><li> Bereid 15 ml vers 3,5% Formaldehyde in HL3.1. Hou het op het ijs. </li></ol> Larvale Dissection <ol><li> Doe een druppel van koude HL3.1 op de dissectie plaat. Dit zorgt ervoor dat het dier uit drogen en stun het dier waardoor het makkelijker wordt om mee te werken. </li><li> Met behulp van de lange tang, selecteert u een zwervend derde instar larven en plaats deze in de daling van HL3.1. </li><li> Gebruik eerst kort een tang om een minutien pin te grijpen. Plaats de pin tussen de achterste siphonen. Het dier zal meestal proberen weg te kruipen van de pin rekken zich uit en maakt het makkelijker voor u om een ​​speld vierkant plaats in de kop van de larve in de buurt van de mond haken. Strek het dier uit de lengte. Dit zal u helpen maximaliseren van de hoeveelheid van de blootgestelde lichaam wand je kunt bereiken tijdens het snijden. Opmerking: Als u ervoor kiest om het hoofd eerste pin, het dier kan zijn lichaam wrap rond de pen of haar lichaam heen en weer zweep waardoor het moeilijk vast te pinnen. Kun je meestal dit tegen te gaan door het verwijderen van de HL3.1 en zetten een frisse koude druppel verbluffende het dier weer. De symmetrische wetenschapper kan ook gewoon grijpen het dier en zijn plaats te houden. </li><li> Met behulp van de lente schaar maken een horizontale snede net anterieur van de achterste pen op de dorsale zijde van de larve. Plaats een blad van de schaar in de incisie en maak een verticale snede langs de dorsale middellijn in de richting van de rostrale einde van de larve. Op het podium van het dier te maken horizontale incisies naar links en rechts van de pin. Let op: het uiteindelijke resultaat eruit moet zien als een I op de dorsale zijde van de larve langs de rostrocaudal as. </li><li> Verwijder de organen. Begin met het zetten een aantal extra druppels HL3.1 op de larve. Hierdoor kunnen de organen op te drijven uit het lichaam zodat u ze te verwijderen veel gemakkelijker. Verwijder eerst de tracheale systeem. Ten tweede, gebruik de tang om de rest van de organen te pakken en te verwijderen. </li><li> Bij stap 3 hebt gemaakt een linker en rechter flap flap in het lichaam muur. Speld de kleppen in een met de klok mee om en zorg ervoor dat het lichaam muur rekken zowel horizontaal als verticaal. </li></ol> Bevestiging Fix elk dier in 3,5% formaldehyde in HL3.1 voor 25 minuten. Was het dier tweemaal in HL3.1 gedurende 5 minuten. Opslagruimte Verwijder de pennen en de overdracht van de larven naar een 1,5 ml buis met 1X PBS. Als u van plan bent om het imago van de NMJ met gesmolten fluorescerende labels, moet u het imago van de dieren binnen twee dagen. U mag de ontleed larven gedurende maximaal een week bij 4 ° C. Representatieve resultaten Er zijn een aantal belangrijke componenten voor een goed ontleed Drosophila larve. Ten eerste moet men rekening extra zorg niet naar de spieren, in het bijzonder de spieren 4, 6 en 7 schade. Dit zijn de meest populaire spieren om te studeren en als ze beschadigd zijn gooi de filet prep en ontleden een ander dier. Ten tweede, moet men ervoor zorgen dat het dier maximaal is zo uitgerekt dat elke spier en NMJ kunnen worden onderscheiden.

<ol><li>Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+larval+neuromuscular+junction+in+Drosophila+Melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster.</a> J. Physiol. 262, 189-214 (1976).</li>
<li>Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotypic+morphology+of+glutamatergic+synapses+on+identified+muscle+cells+of+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae.</a> J Neurosci. 9, 710-725 (1989).</li>
<li>Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+neuromuscular+junction%3A+a+model+system+for+studying+synaptic+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function.</a> Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).</li>
<li>Vactor, D. V., Sink, H., Fambrough, D., Tsoo, R., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+that+control+neuromuscular+specificity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genes that control neuromuscular specificity in Drosophila.</a> Cell. , 73-1137 (1993).</li>
<li>Feng, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+minimal+hemolymph-like+solution%2C+HL3.1%2C+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).</li>
</ol>

De dissectie techniek gedemonstreerd in deze video kan worden gebruikt om Drosophila larven voor te bereiden op een verscheidenheid aan experimentele technieken. Als fluorescerend eiwit labels aanwezig zijn, kunnen de larven worden gemonteerd en direct afgebeeld. Anders kan immunokleuring worden uitgevoerd om bepaalde synaptische compartimenten te markeren. Daarnaast kan elektrofysiologie gemakkelijk worden uitgevoerd op de ontleed larven van de werking van neurotransmissie te evalueren. <p class="jove_cont...

HL3 Dissection Buffer: (in mm) 70 NaCl, 5 KCl, 0,2 CaCl2, 20 MgCl2, 10 NaHCO3, 5 trehalose, 115 sucrose, en 5 HEPES, pH 7,3.<br /<br /&gt; Sylgard ontleden van Plaat: Meng voorzichtig (om luchtbellen te vermijden) 10u01 in een bekerglas. Giet het mengsel in petrischaal (elk formaat). Laat Sylgard te genezen overnachting in 37C incubator.

drosophila larven nmj dissection

Drosophila Larval NMJ Dissection

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Neuromusculaire junctie (NMJ) is een gevestigd model dat wordt gebruikt voor de studie van synaptische plasticiteit en ontwikkeling. Het wijdverbreide gebruik van de<em&gt; Drosophila</em&gt; Motor systeem is te wijten aan de hoge toegankelijkheid. Het kan worden geanalyseerd met single-cell resolutie. Er zijn 30 spieren per hemisegment wiens afspraak binnen de perifere lichaam muur zijn bekend. Een totaal van 35 motorneuronen hechten aan deze spieren in een patroon dat high fidelity heeft. Met behulp van moleculaire biologie en genetica, kan men maken van transgene dieren of mutanten. Dan kan men de studie van de ontwikkeling gevolgen voor de morfologie en functie van de NMJ. Om toegang te krijgen van de NMJ om te studeren, is het noodzakelijk om zorgvuldig te ontleden elke larve. In dit artikel laten we zien hoe goed ontleden<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven voor studie van de NMJ door het verwijderen van alle interne organen, terwijl het verlaten van het lichaam muur intact. Deze techniek is geschikt om larven te bereiden voor de beeldvorming, immunohistochemie, of elektrofysiologie.

Dit protocol laat zien hoe om te ontleden<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven ter voorbereiding van immunohistochemie en / of beeldvorming van de neuromusculaire overgang.

Drosophila larven NMJ Dissection

De neuromusculaire junctie (NMJ) van Drosophila is een gevestigd modelsysteem dat wordt gebruikt voor de studie van synaptische ontwikkeling en plasticiteit. Het wijdverbreide gebruik...

Deze procedure begint met het plaatsen van een larve in het derde stadium op de dissectieplaat. Spelden worden in het posterieure en anterieure uiteinde van de larve geplaatst. Een schaar wordt gebruikt om de larve open te snijden en een pincet wordt gebruikt om de interne organen te verwijderen.Ten slotte worden er vier extra spelden in elke hoek van de lichaamswand van de larve geplaatst om deze tijdens de fixatie strak gespannen te houden. Hallo, ik ben Jonathan Brent van het laboratorium van Brian McCabe van de afdeling Fysiologie en solo-biofysica aan het Columbia University College of Physicians and Surgeons. Vandaag laten we u de procedure zien voor de dissectie van drosophila-larven en MJ.Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de synaptische ontwikkeling van de neuromusculaire overgang te bestuderen. Laten we beginnen. In drosophila-larven zijn er 30 spieren per hemisegment waarvan de schikking binnen de perifere lichaamswand bekend is.In totaal innerveren 35 motorneuronen deze spieren in een zeer stereotiep patroon. Om de neuromusculaire junctie of NMJ te bereiken, is het noodzakelijk om elke larve zorgvuldig te dissekeren met de juiste dissectietechniek. De NMJ kan worden gebruikt voor imaging, immunohistochemie of elektrofysiologie.Begin de procedure door een druppel HL 3.1-buffer op een dissectieplaatje te plaatsen. De buffer is vooraf bereid en op ijs gekoeld. Pak voorzichtig een rondzwemmende third end star-larve van de zijkant van het vial met een grote SS-pincet.De beweging geeft aan dat de larve nog niet is begonnen met de verpopping. Plaats de larve met de dorsale zijde naar boven in de bufferdruppel op de dissectieplaat. De koude buffer zal de larve anesthetiseren en stilhouden. Plaast met een pincet een insectennaald tussen de posterieure sferen, en plaats vervolgens een tweede naald dicht bij de donkere mondhaken, zodat de larve is uitgerekt en klaar is om open te worden gevouwen.Maak met veerschaartjes een kleine horizontale incisie richting het posterieure uiteinde van de larven. Steek één blad van de schaar in de incisie en maak een lengtesnede richting het anterieure uiteinde van de larve. Maak vervolgens horizontale incisies aan het anterieure uiteinde van de larven, links en rechts van de speld.Om organen zoals het darmstelsel te verwijderen, voegt u enkele druppels HL 3.1-buffer toe aan het dier; de darmen en andere organen zullen naar boven drijven in de oplossing en kunnen met een pincet van het lichaam worden weggetrokken. Verwijder tevens het tracheaalstelsel samen met de overige organen. Leg nu de interne lichaamspieren bloot door de flappen die door de incisies zijn gemaakt, met spelden terug te pinnen.Zorg ervoor dat de lichaamswanden horizontaal en verticaal worden opengetrokken. Wanneer de flappen worden vastgepind, dient u eventuele resterende organen te verwijderen en eenmaal te wassen.Door vers HL 3.1-buffer toe te voegen, is de larve nu klaar om gefixeerd te worden met vers bereid formaldehyde, verdund tot 3,5% in 1xPBS. Dompel de larven volledig onder in het fixeermiddel en wacht 25 minuten. Wanneer de fixatieperiode is verstreken, worden de larven twee keer gedurende drie minuten gewassen met HL 3.1-buffer. Verwijder voorzichtig de pinnen en breng de larven indien nodig over naar 1,5 ml buisjes met 1xPBS.De larven kunnen tot twee dagen worden bewaard bij vier graden Celsius. Gebruik de gedissecteerde larven voor optimale resultaten onmiddellijk. Er zijn verschillende sleutelcomponenten bij een correct gedissecteerde drosophila-larve.Zorg er allereerst voor dat de spieren niet beschadigd raken, in het bijzonder spier zes, zeven en vier. Ten tweede moet het dier correct worden uitgestrekt. Anders is de neuromusculaire overgang mogelijk niet toegankelijk of te onderscheiden.Hier ziet u een correct gedissecteerde larve. De NMJ is duidelijk zichtbaar en het systeem is nu klaar voor experimenten. We hebben u zojuist laten zien hoe u oesofageale larven disseceert om de neuromusculaire junctie te bestuderen.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de spieren intact te laten. Als de spieren beschadigd raken, zijn er geen neuromusculaire juncties meer om te bestuderen. Dat is alles.Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In dit artikel zullen we laten zien hoe het centrale zenuwstelsel ontleden uit derde instar Drosophila larven.

Dissectie van larvale CNS in Drosophila melanogaster

Dit protocol wordt beschreven hoe u immunohistochemie uit te voeren op ontleed Drosophila larve.

Drosophila larven NMJ Immunohistochemie

Drosophila melanogaster larven zorgen voor een ideaal modelsysteem om de mechanismen van het axonaal transport te onderzoeken binnen de larvale segmentale zenuwen. Met behulp van deze procedure, kan 3 e instar larven dragen verschillende mutaties worden vergeleken met wild-type larven.

Visualisatie van larvale Segmentale zenuwen in 3 Rd Instar Drosophila Larvale Voorbereidingen

Dit protocol beschrijft een betrouwbare methode voor verdoving en beeldvorming van...

In vivo beeldvorming van Intact Drosophila larven aan Subcellulaire resolutie

Dissectie en Imaging van Active Zones in de Drosophila Neuromusculaire Junction

In situ patch clamp opnamen worden gebruikt voor elektrofysiologische karakterisatie van neuronen in intacte circuits. In de Drosophila genetische model patch clamping is moeilijk omdat de CNS is klein en omgeven door een robuuste mantel. Dit artikel beschrijft de procedure om de schede en schoon neuronen voor latere patch clamp opnamen te verwijderen.

Bereiding van<em&gt; Drosophila</em&gt; Centraal Neuronen voor<em&gt; In situ</em&gt; Patch clamping

In this video, Drosophila larvae nerve fibers are immersed in FM dye, which binds to cell membrane lipids. Suction microelectrode and electrical pulses stimulate the endocytosis process, incorporating the FM dye into newly formed endocytic vesicles. This method, which visualizes presynaptic stages of neurotransmission, is useful for studying synaptic function and neurotransmitter release.

Microelectrode-Mediated FM Dye Loading and Unloading in Drosophila Larvae Nerve Cells

Morfologie, grootte en locatie van intracellulaire organellen zijn evolutionair geconserveerd en lijken hun functie direct te beïnvloeden. Het begrijpen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan deze processen is een belangrijk doel geworden van de moderne biologie. Hier laten we zien hoe deze studies kunnen worden vergemakkelijkt door de toepassing van kwantitatieve technieken.

Waarom kwantificering Matters: karakterisering van fenotypes bij de<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvale Neuromusculaire Junction

Hier beschrijven we een eenvoudige en breed toegankelijke methode om segmentale zenuwen in Drosophila larven te beschadigen om neurodegeneratie van motorische neuronen bij de neuromusculaire verbinding (NMJ) van derde instar larven te visualiseren en te kwantificeren.

Een eenvoudige neurologische mechanische letselmethode om te bestuderen<em&gt; Drosophila</em&gt; Motor Neuron Degeneration

We beschrijven een dissectietechniek die de architectuur van de neuromusculaire overgang behoudt en een gedetailleerde immunocytochemische studie van motorneuronen in het volwassen Drosophila-been mogelijk maakt.

Dissectie en immunohistochemie van het Drosophila adult been om veranderingen op de neuromusculaire overgang voor een geïdentificeerd motorneuron te detecteren

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol om de microtubuli-netwerken in neuromusculaire knooppunten en spiercellen te visualiseren. In combinatie met de krachtige genetische hulpmiddelen van Drosophila melanogaster, vergemakkelijkt dit protocol de genetische screening en de analyse van de microtubuli-dynamiek aanzienlijk voor de rol van regulerende eiwitten van het microtubuli-netwerk in het zenuwstelsel.

Drosophila-larvale neuromusculaire junctie en spiercellen gebruiken om het netwerk van microtubuli te visualiseren

Leer de dissectie van Drosophila larven voor neuromusculaire junctie-onderzoek. Deze methode maakt immunohistochemie en beeldvorming mogelijk voor synaptische ontwikkelingsstudies.

Drosophila larven NMJ Dissection

Meer video's verkennen