Name: Drosophila larven NMJ Immunohistochemie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Leer immunohistochemie op Drosophila-larven om eiwitten bij synapsontwikkeling te visualiseren. Deze methode helpt onderzoekers genetische regulatie van synapsvorming bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Voordat u begint <ol><li> Bereid de volgende oplossingen: PBT (0,1% Triton X100 in 1X PBS), PBTB (0,2% BSA in PBT), en PBTN (2% NGS in PBTB). </li><li> Ontleden Drosophila larven. Zie Drosophila larven NMJ Dissection. </li></ol> Immunohistochemie <ol><li> Verplaats de larven naar een 1,5 ml buisje met PBT. Twee keer was de larven gedurende 15 minuten in de PBT. Opmerking: om te wassen, de 1.5 ml buis op een nutator mixer. Verwijder de vloeistof met een pippetor en vervangen door verse vloeistof. </li><li> Verwijder de PBT. Twee keer wassen in PBTB gedurende 30 minuten. </li><li> Verwijder de PBTB. Twee keer wassen in PBTN gedurende 15 minuten. </li><li> Incubeer in primair antilichaam verdund in PBTN bij kamertemperatuur gedurende 1 uur of bij 4 º C gedurende de nacht. </li><li> Spoel tweemaal met PBTB. Opmerking: om toe te voegen oplossing spoelen en te verwijderen snel. </li><li> Was twee keer 15 minuten in PBTB. </li><li> Was in PBTN gedurende 30 minuten. </li><li> Incubeer in secundair antilichaam (en geconjugeerde primaire antilichaam als je een gebruikt) verdund in PBTN. </li><li> Dekking in aluminiumfolie en incubeer gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur. </li><li> Spoel tweemaal met PBTB. </li><li> Was twee keer 15 minuten met PBTB. </li><li> Ga verder naar de montage. </li></ol> Montage Let op: Mount in glycerol indien uit de monsters zal onmiddellijk worden afgebeeld. Mount in Verleng Gold indien uit de monsters zullen worden opgeslagen voordat beeldvorming (voor meer dan een week) of als monsters moeten worden afgebeeld meerdere keren. Om gebruik te maken, plaats een fles te verlengen in 65 º C waterbad gedurende 2-3 minuten. Neem een ​​hoeveelheid van Verleng Gold en te houden op een warmte-blok bij 45-50 º C. <ol><li> Giet gebeitst PREPS in PBT in om een ​​horlogeglas. </li><li> Doe wat glycerol op een schoon glasplaatje voor verwerking. </li><li> Verplaats de dieren de verwerking schuiven door het plukken van hen uit het horlogeglas met een hoek met pincet. Zorg ervoor dat ze naar beneden cuticula kant. </li><li> Verwijder de kop en staart met een frisse scheermes over de verwerking glaasje. Een Exacto-mes met lemmet # 16 werkt goed voor. </li><li> Op een andere dia (montage dia), zet een kleine daling van het glycerol / verlengen en te verspreiden met schone tang. </li><li> Verplaats de ontleedde dieren naar de montage schuiven door hun rand, zorg dat u ze niet omkeren. Probeer ze te monteren in rijen in dezelfde richting. Mount 6-8 dieren per slide. </li><li> Drop een dekglas op door het plaatsen van een rand in het glycerol / verlengen en langzaam los te laten. </li><li> Seal de dia met nagellak. Opmerking [Niet image totdat de lak droog is. Dit duurt meestal tien minuten. Voor monsters gemonteerd in verlengen goud, de dia&#39;s laten drogen gedurende ten minste drie uur voor sluiting of beeldvorming.] </li></ol>

<ol><li>Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+larval+neuromuscular+junction+in+Drosophila+Melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster.</a> J. Physiol. 262, 189-214 (1976).</li>
<li>Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotypic+morphology+of+glutamatergic+synapses+on+identified+muscle+cells+of+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae.</a> J Neurosci. 9, 710-725 (1989).</li>
<li>Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+neuromuscular+junction%3A+a+model+system+for+studying+synaptic+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function.</a> Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).</li>
<li>Collins, C. A., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+development%3A+insights+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Synaptic development: insights from Drosophila.</a> Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35-42 (2007).</li>
</ol>

Immunohistochemie (IHC) is van vitaal belang voor de studie van de NMJ biologie, omdat het in staat stelt visualisatie van de NMJ. Dit wordt bereikt door met behulp van antilichamen die de neuronale membraan (bijv. HRP), de presynapse (bijv., CSP, SYT), en / of de postsynapse (bijvoorbeeld DLG) te erkennen. Signaalmoleculen, structurele eiwitten, of nieuwe eiwitten van belang kunnen ook worden gekleurd. Dan kunnen genen worden gemuteerd of missexpressed, en IHC kan verstoring van synaptische structuur en / of neuronale ...

<table><tbody><tr><td>Stereomicroscoop &amp;#8220;Stemi&amp;#8221; 2000</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>495101-9804-000</td><td></td></tr><tr><td>Lichtbron KL 1500 LCD</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>000000-1063-181</td><td></td></tr><tr><td>Dumont SS pincet</td><td>Fine Science Tools</td><td>11200-33</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 pincet</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Adams&amp;#8482; nutatormenger</td><td>BD Biosciences</td><td>421105</td><td></td></tr><tr><td>Precisionmes nr. 1</td><td>X-Acto</td><td>3201</td><td></td></tr><tr><td>Messen nr. 16</td><td>X-Acto</td><td>216</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold antifade-reagens</td><td>Invitrogen</td><td>36930</td><td></td></tr></tbody></table>

drosophila larven nmj immunohistochemie

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Neuromusculaire junctie (NMJ) is een gevestigd model dat wordt gebruikt voor de studie van synaptische plasticiteit en ontwikkeling. Het wijdverbreide gebruik van de<em&gt; Drosophila</em&gt; Motor systeem is te wijten aan de hoge toegankelijkheid. Het kan worden geanalyseerd met single-cell resolutie. Er zijn 30 spieren per hemisegment wiens afspraak binnen de perifere lichaam muur zijn bekend. Een totaal van 31 motorneuronen hechten aan deze spieren in een patroon dat high fidelity heeft. Met behulp van moleculaire biologie en genetica, kan men maken van transgene dieren of mutanten. Dan kan men de studie van de ontwikkeling gevolgen voor de morfologie en functie van de NMJ. Immunohistochemie kan worden gebruikt om duidelijk het imago van de componenten van de NMJ. In dit artikel hebben we laten zien hoe je antilichaam vlekken te gebruiken om het te visualiseren<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvale NMJ.

Dit protocol wordt beschreven hoe u immunohistochemie uit te voeren op ontleed Drosophila larve.

Drosophila larven NMJ Immunohistochemie

De neuromusculaire junctie (NMJ) van Drosophila is een gevestigd modelsysteem dat wordt gebruikt voor de studie van synaptische ontwikkeling en plasticiteit. Het wijdverbreide gebruik ...

Dit protocol beschrijft hoe immunohistochemische kleuring moet worden uitgevoerd op gedissecteerde gsof-larven om eiwitten te visualiseren die betrokken zijn bij de synapsontwikkeling. Gedurende de hele procedure wordt een buisje van 1,7 ml gebruikt voor de incubatie van primaire en secundaire antilichamen, evenals voor de wasstappen. De larven worden vervolgens overgebracht naar een preparatieglas waar ze met een exactomesje worden getrimd; voor de observatie van de specimens worden deze verplaatst naar een druppel anti-fading reagens.Op een objectglas wordt tenslotte een dekglas met nagellak aan het glas vastgezet. Hallo, ik ben Jonathan Brent van het laboratorium van Brian McCade van de afdeling Fysiologie en Cellulaire Biofysica aan het Columbia University College of Physicians and Surgeons. Wij gebruiken deze procedure om de genetische regulatie van synapsvorming bij de neuromusculaire overgang en de ontwikkeling van de knoop te bestuderen.Laten we beginnen. Voordat u immunohistochemie uitvoert op de gsof-larve n MJ, moet u de larven eerst correct dissekeren. Om deze procedure te leren, kunt u het bijbehorende video-artikel bekijken met de titel Drosophila Larva N MJ Dissection.Om de procedure te starten, bereidt u drie verse oplossingen. Maak eerst de PBT-oplossing door detergent toe te voegen aan vers bereide PBS. Neem vervolgens een aliquot van runder serumalbumine en voeg dit toe aan een PBT-oplossing.Om PBTB te maken, neemt u normaal geiten serum in aqua en voegt u dit toe aan de PB TB-oplossing om de PBTN-oplossing te maken. Nadat deze oplossingen zijn bereid, brengt u de larven over naar een 1,5 ml buisje met 1 ml PBT. Dit is de eerste wasstap.Elke wasbeurt houdt in dat de oplossing waarin de larven zijn ondergedompeld wordt vervangen, waarna de larven worden geïncubeerd op een langzaam roterende mutator-mixer. Verplaats de larven niet van buis naar buis, omdat dit hen kan beschadigen. Deze eerste wasbeurt duurt 15 minuten bij kamertemperatuur.Vervang na 15 minuten mengen de PBT door verse PBT met behulp van een pipet en was de larven nog eens 15 minuten. Wees bij het wisselen van de wasoplossingen altijd voorzichtig om beschadiging van de larven te voorkomen. Wanneer de wasbeurten met PBT zijn voltooid, was de larven gedurende 30 minuten in PBTB.Herhaal deze wasstap met een verse oplossing gedurende nog eens 30 minuten. Hiermee is de wasstap met PBTB voltooid. Was tweemaal met PBTN gedurende 15 minuten per wasbeurt.Tijdens de tweede wasstap kan het primaire antilichaam worden verdund in PBTN tot de gewenste werkconcentratie. Incubeer na het wassen de larven gedurende één uur in dit antilichaammengsel bij kamertemperatuur met voorzichtig mengen, of overnacht bij vier graden Celsius. Wanneer de incubatie is voltooid, wordt de primaire antilichaamoplossing weggezogen en worden de larven snel meerdere keren gespoeld met PBTB om alle resterende antilichamen te verwijderen.Om de larven voor te bereiden op de volgende antilichaamincubatie, wast u ze eenmaal in PBTB gedurende 15 minuten en tweemaal met PBTN gedurende 30 minuten. Verdun het secundaire antilichaam in PBTN tot de gewenste werkconcentratie en incubeer de larven in dit mengsel gedurende anderhalve uur. Zorg ervoor dat de larven bij kamertemperatuur worden afgedekt om blootstelling aan licht te voorkomen en bleaching van floor four te minimaliseren.Verwijder na anderhalf uur de secundaire antilichaamoplossing en spoel de larven nog enkele keren met PBTB. Was de larven vervolgens twee keer gedurende 15 minuten in PBTV. Alle resterende wasstappen en de bewaring van de larven moeten plaatsvinden met minimale blootstelling aan licht, dus zorg ervoor dat ze bedekt blijven.Breng de larven over vanuit de 1,5 ml buis naar PBT in een glazen bewerkingspreparaat. De larven zijn nu klaar voor het mounten; monteer de gekleurde larven in een Prolong Gold-oplossing in een waterbad bij 65 °C gedurende twee tot drie minuten. Neem vervolgens een Eloqua en plaats deze op een heatblock die is ingesteld op 50 °C.Breng wat PB TB aan op een preparaatglas. Breng de larven over naar de PB tb. Draai de larven zo dat de cuticula naar beneden wijst met een exactomesje met blad nummer 16, en trim de koppen en staarten van de larven.U kunt voor deze stap ook een scheermesje gebruiken. Bereid nu het montagepreparaat voor door 40 µL Prolong Gold uit het verwarmde aliquot op een schoon objectglas aan te brengen en dit met een schone pincet te verspreiden. Gebruik hiervoor een pincet.Breng voorzichtig zes tot acht van de voorbereide larven over van de bewerkingsglasplaat naar de montageglasplaat. Probeer ze in dezelfde oriëntatie te houden en zorg dat de zijde van de cuticula naar beneden gericht is om de larven te monteren. Plaats een dekglas over de uitgerekte oplossing.Plaats het op één rand aan de periferie van de verlengde druppel en laat het dekglas voorzichtig zakken om de monsters te bedekken. Kit de randen van het dekglas aan het objectglas vast met een dikke, goedkope nagellak in uw favoriete kleur. Laat het objectglas minimaal drie uur drogen.Indien de objectglazen slechts één keer en direct na de preparatie worden afgebeeld, kan de langdurige goudoplossing worden vervangen door glycerol. In dat geval is de droogtijd van de nagellak en glycerol slechts ongeveer 10 minuten, in tegenstelling tot de drie uur bij elk kleuringsprotocol. Het doel is een hoog specifiek signaal in combinatie met een lage achtergrond.Dit wordt bereikt door het gebruik van hoogwaardige antilichamen en door het zorgvuldig uitvoeren van de blokkerings- en wasstappen. Deze afbeeldingen tonen wild-type synapsen alsofals die van een vliegenstam die een gemuteerde BMP-receptor type twee tot expressie brengt, bekend als de wishful thinking of witch mutant. Het neuronale membraan is blauw gekleurd met een antilichaam tegen horse radish peroxidase.Synaptische blaasjes, in het rood weergegeven, zijn gekleurd met een anti-synaptisch antilichaam. De postsynaps, in het groen weergegeven, is gekleurd met een antilichaam tegen discs large. Deze resultaten toonden aan dat het muteren van de type twee BMP-receptor een fenotype van synaptische ondergroei produceert.Deze mutant was van cruciaal belang voor het vaststellen van BMP's als retrograde signalen die het aantal synaptische terminale boutons reguleren. We hebben zojuist laten zien hoe immunohistochemie moet worden uitgevoerd op een neuromusculaire junctie van de slokdarm van een larve. Bij het uitvoeren van deze procedure.Het is belangrijk om de procedure met de juiste timing uit te voeren om maximale reproduceerbaarheid en een lage achtergrond te garanderen. Dat was het. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

drosophila-larval-nmj-immunohistochemistry

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Drosophila larven NMJ Dissection

Dit protocol beschrijft een betrouwbare methode voor verdoving en beeldvorming van...

In vivo beeldvorming van Intact Drosophila larven aan Subcellulaire resolutie

Dissectie en Imaging van Active Zones in de Drosophila Neuromusculaire Junction

De dendritische arborization sensorische neuronen van...

Morfologische Analyse van de Drosophila Larvale Perifere sensorische neuron dendrieten en axonen het gebruik van genetische Mozaïeken

Drosophila popstadium Buik Immunohistochemie

Om te begrijpen hoe complex cel vormen, zoals neuronale dendrieten, worden bereikt tijdens de ontwikkeling, is het belangrijk om nauwkeurig te kunnen assay microtubuli organisatie. Hier beschrijven we een robuuste immunohistologische etikettering methode om microtubule organisatie van de dendritische arborization neuron zintuiglijke dendrieten, de luchtpijp, spier-onderzoeken en...

Immunohistologische Etikettering van microtubuli in Sensory Neuron Dendrieten, luchtpijp, en de spieren in de Drosophila Larve Body Muur

De Drosophila neuromusculaire verbinding (NMJ) wordt gebruikt als model om de morfologie en functie van synapsen te bestuderen. Deze video beschrijft belangrijke kenmerken die onderzoekers kwantificeren om de NMJ te karakteriseren. Het voorbeeldprotocol demonstreert een software die de kwantificering automatisch kan uitvoeren.

Drosophila Neuromusculaire junction (NMJ) kwantificering: een methode om synaptische morfologie en functie te beoordelen

Dit protocol toont hoe Proximity Ligatie Assay kunnen worden toegepast voor aantonen in situ eiwit-eiwit interacties bij de Drosophila larven neuromusculaire junctie. Met deze techniek worden Schijven grote en Hu-li tai Shao aangetoond dat een complex in het postsynaptische gebied, een associatie eerder geïdentificeerd door middel co-immunoprecipitatie vormen.

Detectie van In Situ Eiwit-eiwit complexen in de Drosophila Larvale Neuromusculaire Junction Met behulp van Proximity ligatiebepaling

Morfologie, grootte en locatie van intracellulaire organellen zijn evolutionair geconserveerd en lijken hun functie direct te beïnvloeden. Het begrijpen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan deze processen is een belangrijk doel geworden van de moderne biologie. Hier laten we zien hoe deze studies kunnen worden vergemakkelijkt door de toepassing van kwantitatieve technieken.

Waarom kwantificering Matters: karakterisering van fenotypes bij de<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvale Neuromusculaire Junction

Dit rapport biedt een nieuwe procedure voor de voorbereiding van monsters voor het visualiseren van neuromusculaire juncties in Drosophila-larven . Deze methode is effectiever in het voorkomen van het krullen van de monsters in vergelijking met de traditionele methode en is met name nuttig voor de ultrastructurele analyse van de neuromusculaire junctie van Drosophila .

Optimalisatie van het monstervoorbereidingsproces voor transmissie-elektronenmicroscopie van neuromusculaire juncties in Drosophila-larven

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol om de microtubuli-netwerken in neuromusculaire knooppunten en spiercellen te visualiseren. In combinatie met de krachtige genetische hulpmiddelen van Drosophila melanogaster, vergemakkelijkt dit protocol de genetische screening en de analyse van de microtubuli-dynamiek aanzienlijk voor de rol van regulerende eiwitten van het microtubuli-netwerk in het zenuwstelsel.

Drosophila-larvale neuromusculaire junctie en spiercellen gebruiken om het netwerk van microtubuli te visualiseren

Leer immunohistochemie op Drosophila-larven om eiwitten bij synapsontwikkeling te visualiseren. Deze methode helpt onderzoekers genetische regulatie van synapsvorming bestuderen.

Drosophila larven NMJ Immunohistochemie

Meer video's verkennen