Name: Twee-foton axotomy en time-lapse confocale imaging in levende zebravis embryos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-16T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Leer twee-foton axotomie en time-lapse confocale imaging voor neurobiologisch onderzoek met levende Danio rerio embryo's. Deze methode maakt langdurige beeldvorming van axonale dynamica mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We bedanken Mark Terasaki voor een eerste advies over het gebruik van een twee-foton microscoop aan lokale weefselbeschadiging, Kathy Joubin voor advies over montage voor time-lapse imaging, en de Sagasti en portierster-Cailliau labs voor discussie te creëren. Eerste experimenten werden uitgevoerd door AS als een Grass Foundation Fellow aan het Marine Biological Labs in Woods Hole, Massachusetts. Werk in de Sagasti lab werd ondersteund door subsidies van de Whitehall Foundation, de Klingenstein Foundation, en een Burroughs Wellcome Fund Career Award in de biologische wetenschappen.

Deel 1: Montage zebravis embryo&#39;s voor de lange termijn imaging <ol><li> Bereid 1% een laag gesmolten agarose oplossing voor de inbedding. Los agarose in DI-water door verhitting in de magnetron, in kleine hoeveelheid buizen en op te slaan in een verwarmings-blok bij 42 graden Celsius. </li><li> Selecteren van embryo&#39;s voor imaging en verwijder hun chorions door voorzichtig te trekken van de chorion uit elkaar met een tang. Embryo&#39;s kunnen worden geplaatst in een 5% PTU Ringers-oplossing te 22-24 uur na de bevruchting (HPF) om de vorming van pigment te remmen. Dit verbetert de helderheid van imaging en is essentieel voor het uitvoeren van twee-foton axotomies van sensorische axonen. Als de natuurlijke pigment is toegestaan ​​om vorm, autofluorescentie verduistert axonen op de twee-foton microscoop. Ringers oplossing voor zebravis bevat 116 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, en 5mm HEPES, pH 7,2. </li><li> Verdoven embryo&#39;s door het toevoegen van ~ 0.02% tricaïne aan de PTU Ringers. Zorg ervoor dat dieren niet reageren op aanraken voordat u verder gaat. </li><li> Bereid de lange termijn imaging kamer door het toepassen van vacuum vet aan een kant van een glas of Teflon ring en de vaststelling van het op een glazen afdekplaat slip. </li><li> Overdracht een embryo in de 42 graden agarose-oplossing met een glazen pipet, zorg ervoor dat u veel van de PTU Ringers overdracht, vervolgens over het embryo met een druppel op een agarose voorbereide dekglas. </li><li> Positie van het embryo zoals gewenst als de agarose verhardt. Houd in gedachten dat de beeldvorming kamer wordt omgedraaid als u klaar bent, zodat het dekglas zal de bovenkant worden. </li><li> Als u een gemotoriseerde podium en kan afbeelding meerdere locaties tegelijk, herhaalt u de stappen 1,4-1,6 voor elke embryo. </li><li> Laat de agarose volledig stollen, vul dan de ring met 0,02% tricaïne PTU Ringers. </li><li> Van toepassing zijn vacuüm vet aan de andere kant van de ring (s), dan hebben betrekking op de ring (en) met een glasplaatje. Flip de verzegelde kamer (s) over. Deze kamers kunnen gebruikt worden voor beeldvorming over rechtop of omgekeerde microscopen. </li></ol> Deel 2: Twee-foton axotomy met behulp van een custom-built twee-foton microscoop met een Chameleon Ti-saffier-laser <ol><li> Bereid je voor op beeldvorming. Plaats de gemonteerde embryo (s) op een houder onder de microscoop. Focus op een embryo met een 40X (0.8 NA) water doelstelling. Zet de laser. Wij zijn in staat geweest om reproduceerbare visualiseren en GFP te drukken neuronen met behulp van de volgende parameters schade. Te visualiseren axonen op een niet-schadelijke power, zet laser met een golflengte van 910 nanometer (nm) en een vermogen van 30 milliwatt (mW vermeld, zijn de hoogte van vermogen bij de steekproef). Open de imaging-software. We maken gebruik van scanimage Software ontwikkeld in Karel Svoboda het laboratorium van 2, 3. </li><li> Druk op focus naar het embryo met de twee-foton laser scan, zoekt u de axon die u wilt axotomize, en vast te leggen een beeld van dit axon. Markeer de eerste en de laatste Z-posities, het verwerven van de afbeelding en maak een maximale projectie van de Z-stacks. </li><li> Zoom in 70X op de tak van het axon dat u wilt axotomize en te stoppen met scannen. Verhoog de mW bij het monster op de schadelijke kracht van 180 mW, en het uitvoeren van een scan met de laser. Wij doen dit door het instellen van het aantal Z plakjes op 1 en drukken op &quot;Grab&quot;. Dit moet voldoende zijn om de axon te verbreken. Zie de bespreking van methoden om deze procedure te optimaliseren voor uw microscoop en experimentele doel. </li><li> Zoom uit, verminderen het vermogen tot 30 mW en maak een opname. </li></ol> Deel 3: Twee-foton axotomy op Zeiss 510 confocale / twee-foton microscoop <ol><li> Plaats gemonteerd embryo&#39;s het podium op en breng het in beeld met behulp van een 25X objectief water of een andere geschikte doelstelling. </li><li> Zet de twee-foton (910 nm) en Argon (488 nm) lasers in een multi-track instelling, zodat het mogelijk is om te schakelen van de ene naar de andere. Hoewel beide lasers worden gebruikt voor het GFP te detecteren, de twee-foton emissie is gevisualiseerd met rode, en de argon laser emissie met groen om te differentiëren van de twee. </li><li> Gebruik de Argon laser om een ​​axon te verwonden te identificeren. Onder Z instellingen markeren de eerste en de laatste optische secties. Neem een ​​confocale beelden en een maximale uitval van de Z-stack. </li><li> Kies de regio van de axon te gewonden en breng deze regio in beeld. Schakel de Argon laser en zet de twee-foton laser. Scan de monster met de twee-foton met een laser intensiteit van ~ 9% transmissie om ervoor te zorgen dat de axon nog in focus. </li><li> Klik op de &quot;stop&quot;-knop, zodat de crop tool beschikbaar zal zijn. Gebruik gewas om in te zoomen op het gebied van belang. Meestal we inzoomen op ~ 70X (zoom kan worden gecontroleerd onder de &quot;mode&quot; tab). Onder de &quot;kanalen&quot; tab de intensiteit van de twee-foton van ~ 9% transmissie tot 15-20% transmissie. </li><li> Om sever een axon activeer de &quot;snelle XY&quot;-knop voor ongeveer 1 seconde en druk op de stop-knop om het overtollige schade te voorkomen. Het axon moet worden gezien als verstrooid vuil als de procedure gewerkt. </li><li> Om ervoor te zorgen dat de axonwas beschadigd terug te schakelen naar de 488 nm laser Argon, nog een confocale beeld, en een maximale projectie. </li></ol> Deel 4: Confocale time-lapse imaging op Zeiss LSM 510 <ol><li> Bereid je voor op beeldvorming. Als u gebruik maakt van een verwarmde stadium, moet u deze in te schakelen op ten minste 30 minuten voor het opzetten van uw time-lapse film. Plaats de gemonteerde embryo (s) op een houder onder de microscoop. Focus op een embryo met de gewenste lucht doel. We maken gebruik van een 20X, 0.5 NA doelstelling. Open Zeiss LSM 510 imaging software. Zet op de juiste lasers en het opzetten van de gewenste configuratie. We zullen nu beschrijven een gedetailleerd protocol voor de lange termijn beeldvorming met Zeiss LSM Multi Tijd software. Deze methoden kunnen worden aangepast voor gebruik op uw eigen microscoop met uw imaging software. </li><li> Bepaal de positie en de configuratie van uw eerste embryo in de Multi Time venster. Open de scan, toneel, en Multi Time ramen. Activeer snelle scan op de scan-venster. Verplaats de etappe naar de gewenste positie XY. Markeer de eerste en laatste Z-posities in het scanvenster. Druk op stop, dan Mid, ook in het scanvenster. Wachten op de scan van de middelste Z slice te voltooien, dan drukt u op Markeer positie op het podium venster. Als u slechts beeldvorming een embryo, klik dan op de &quot;Single Location&quot; tab in het Multi Time venster. Klik op &quot;Vervangen XYZ&quot; en vervolgens op &quot;Save Configuration&quot;. Akkoord toen hem gevraagd werd naar de vorige configuratie overschrijven. Ga verder met 4,4 stap. Als je een gemechaniseerd podium, kunt u meerdere locaties om de afbeelding meerdere embryo&#39;s. In dit geval moet u de &quot;Multiple Locations&quot; tab selecteren voordat het definiëren van de XYZ en de configuratie voor uw eerste locatie. Zorg er ook voor dat het pull-down menu net onder de &quot;Multiple Locations&quot; tab is op locatie 1, en dat het pull-down menu in de configuratie sectie zegt multi-loc 1, voordat u klikt op save configuratie. </li><li> Bepaal de positie en de configuratie van uw resterende embryo&#39;s in de Multi Time venster. Zoek uw volgende embryo, druk dan op een snelle scan, zet het podium in de gewenste positie XY, en markeer uw eerste en laatste Z-posities in het scanvenster. Druk op stop, dan Mid, ook in het scanvenster. Wachten op de scan van de middelste Z slice te voltooien, dan drukt u op Markeer positie op het podium venster. Klik op &#39;Vervang XYZ &quot;. Controleer of de pull-down menu net onder de &quot;Multiple Locations&quot; tab is op locatie 2, en dat het pull-down menu in de configuratie sectie zegt multi-loc 2, klik dan op &quot;Save Configuration&quot;. Akkoord toen hem gevraagd werd naar de vorige configuratie overschrijven. Herhaal dit proces voor de resterende embryo&#39;s. </li><li> Stel de parameters voor het imago van acquisitie in het Multi Loc venster. Kies de GR-GL-optie in de &quot;Lijst van Blokken&quot;-sectie, voer vervolgens het gewenste aantal van de groep herhalingen. Dit is het aantal keren dat de confocale zal een afbeelding te verkrijgen op elke locatie. Voer de gewenste wachten interval in het Parameters sectie. Dit is de hoeveelheid tijd vanaf de start van een imaging herhaling aan het begin van de volgende herhaling. Selecteer &quot;ZStackXY&quot; in de configuratie sectie. Geef je basis bestandsnaam in het onderste gedeelte. Klik op &quot;Selecteer Afbeelding DB&quot; en kies uw MDB. Klik op de knop &quot;Opties&quot;. Selecteer uw MDB map om tijdelijke bestanden op te slaan. Check &quot;houden uiteindelijke beeld open&quot;, &quot;save uiteindelijke beeld&quot; en &quot;midden in het z stack&quot;. Selecteer wachten interval. Klik op OK om het venster Opties te sluiten. Klik op &quot;Start Time&quot;. Laat Multi Tijd venster open voor de duur van imaging. </li><li> Analyseer uw gegevens. Als de time-lapse imaging is voltooid, zal de Multi Time software te compileren van al uw tijdelijke bestanden in een overzicht bestand voor elke locatie. Als u wilt dat de film te stoppen voordat deze is voltooid, moet u op &quot;Finish&quot; drukken in plaats van &quot;Stop&quot;, zodat een samenvatting bestand wordt aangemaakt. De tijdelijke bestanden en de samenvatting bestanden automatisch moeten worden opgeslagen in de aangewezen mdb map. Vanuit het LSM software menu, klik op &quot;3D-View&quot;, vervolgens &quot;Projectie&quot;. Met uw samenvatting bestand dat is geselecteerd in het pull-down menu, klik op &quot;Apply&quot;. Dit genereert een maximale projecties van de Z-stack voor elke confocale beeld. Op de LSM software menu, klik op &quot;File&quot; en vervolgens op &quot;Export&quot;. Sla de maximale projecties als een reeks tif-bestanden. U kunt dan een film maken uit de serie van tif-bestanden met behulp van ImageJ of QuickTime Pro. Axonen in de LSM beelden kunnen worden getraceerd in drie dimensies met behulp van beeldanalyse software (bijv. NeuroLucida van MicroBrightfield) om gedetailleerde kwantitatieve informatie over het axon morfologie te genereren. </li></ol> Deel 5: Representatieve resultaten Een succesvol experiment zal resulteren in een nauwkeurige weergave van de cellulaire dynamisches van het axon herstel van een blessure. Uw embryo&#39;s gezond zijn na beeldvorming, met geen zichtbare degeneratie en een sterke hartslag. Het axotomy zou moeten leiden tot nauwkeurige schade, alleen verbreken de gedefinieerde tak van de axon. Er mag geen schade aan omliggende axonen en minimale cel dood. Wij geloven dat zien we de dood van een enkele epidermale cel direct op de plaats van axotomy in ~ 50% van de experimenten. Als u goed kijkt meer schade, moet u het optimaliseren van uw twee-foton-protocol, zoals beschreven in de discussie.

<ol><li>Sagasti, A., Guido, M. R., Raible, D. W., Schier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repulsive+interactions+shape+the+morphologies+and+functional+arrangement+of+zebrafish+peripheral+sensory+arbors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Repulsive interactions shape the morphologies and functional arrangement of zebrafish peripheral sensory arbors.</a> Curr Biol. 15, 804-814 (2005).</li>
<li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScanImage%3A+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Eng+Online%22%5BJournal%5D)">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomed Eng Online. 2 (13), (2003).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li>
<li>Sacconi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+multiphoton+nanosurgery+on+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">In vivo multiphoton nanosurgery on cortical neurons.</a> J Biomed Opt. 12, 050502-050502 (2007).</li>
<li>Galbraith, J. A., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+damage+in+thick+specimens+by+multiphoton+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation.</a> Mol Biol Cell. 14, 1808-1817 (2003).</li>
<li>Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurosurgery%3A+functional+regeneration+after+laser+axotomy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy.</a> Nature. 432, 822-822 (2004).</li>
<li>Quinto-Su, P. A., Venugopalan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+laser+cellular+microsurgery%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of laser cellular microsurgery.</a> Methods Cell Biol. 82, 113-151 (2007).</li>
</ol>

Wij hebben gebruik gemaakt van de methoden beschreven om precies te axotomize perifere sensorische axonen en om direct herstel waarnemen in de levende zebravis embryo. Lange-termijn time-lapse confocale beeldvorming in de zebravis kan worden gebruikt om een groot aantal ontwikkelingsprocessen in vivo te observeren. De twee-foton beschreven axotomy procedure kan worden aangepast voor verschillende experimentele doelen. We hebben gebruik gemaakt van dezelfde algemene procedure om hele trigeminus sensorisch neuron...

twee-foton axotomy en time-lapse confocale imaging in levende zebravis embryo&#39;s

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebravissen zijn al lange tijd gebruikt om de cellulaire en moleculaire mechanismen van ontwikkeling studie van time-lapse beeldvorming van de levende transparante embryo. Hier beschrijven we een methode om de zebravis embryo&#39;s mount voor de lange termijn beeldvorming en demonstreren hoe de vangst van time-lapse beelden met behulp van een confocale microscoop te automatiseren. We beschrijven ook een methode om gecontroleerde, precieze schade aan de individuele vestigingen van perifere sensorische axonen in zebravis met behulp van de gerichte kracht van een femtoseconde laser gemonteerd op een twee-foton microscoop te creëren. De parameters voor succesvolle twee-foton axotomy moet worden geoptimaliseerd voor elke microscoop. We zullen aantonen twee-foton axotomy op zowel een op maat gemaakte twee-foton microscoop en een confocale Zeiss 510 / twee-foton om twee voorbeelden te geven. Zebravis trigeminale sensorische neuronen kunnen worden gevisualiseerd in een transgene lijn te drukken GFP aangedreven door een sensorisch neuron specifieke promoter 1. We hebben dit aangepast zebravis trigeminus model voor zintuiglijke regeneratie van axonen direct waarnemen in de levende zebravis embryo&#39;s. Embryo&#39;s worden verdoofd met tricaïne en gepositioneerd binnen een druppel agarose als het stolt. Geïmmobiliseerd embryo&#39;s worden afgesloten binnen een imaging kamer gevuld met phenylthiourea (PTU) Ringers. Wij hebben geconstateerd dat embryo&#39;s kan continu worden afgebeeld in deze kamers voor 12-48 uur. Een enkele confocale beeld wordt vervolgens opgeslagen op de gewenste plaats van axotomy te bepalen. De regio van belang is gelegen op de twee-foton microscoop door beeldvorming van de sensorische axonen onder lage, niet-beschadigende macht. Na het inzoomen op de gewenste plaats van axotomy, is de kracht verhoogd en een enkele scan van die bepaalde regio is voldoende om de axon te verbreken. Meerdere locatie time-lapse imaging wordt dan ingesteld op een confocale microscoop om direct waar te nemen axonale het herstel van een blessure.

Hier beschrijven we een methode voor het monteren van zebravis embryo&#39;s voor de lange termijn imaging, twee-foton beeldvorming en weefsel-schade technieken en time-lapse confocale beeldvorming.

Twee-foton axotomy en time-lapse confocale imaging in levende zebravis embryo&#39;s

Zebravissen worden al lang ingezet voor het bestuderen van de cellulaire en moleculaire mechanismen van ontwikkeling door middel van time-lapse-imaging van het levende, transparante embryo.

Om axonen door te snijden met in vivo tweefoton-beeldvorming, plaatst u geanestheseerde zebravissenembryo's in een druppel agar terwijl deze stolt in een gespecialiseerde kamer bestaande uit een TEFLON-ring en een dekglas. Een glasplaat wordt bovenop de kamer geplaatst, waarna deze ondersteboven wordt gekeerd voorafgaande aan de axotomie. Maak een beeld vóór de ingreep van het axon dat u wilt doorsnijden bij 40x vergroting en vervolgens bij 70x vergroting op de regio die u wilt axotomiseren.Verhoog de lasersterkte terwijl de laser is uitgeschakeld. Zet de laser kortstondig aan. In het nabeeld van het axon is verspreid axonaal puin zichtbaar als de exotomie succesvol is.Hoi, ik ben Georgia O'Brien. Hoi, ik ben Sandra Rigo. En ik ben Shauna Martin.Wij komen uit het laboratorium van Alvarez TI van de afdeling Moleculaire Cel- en Ontwikkelingsbiologie aan de University of California Los Angeles. Vandaag tonen we u een procedure voor tweefoton-exsomie en time-lapse confocale beeldvorming in levende zebravisembryo's. Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de degeneratie en regeneratie van perifere somatosensorische axonen te bestuderen.Laten we beginnen. Allereerst bereiden we een 1% low-melt agarose-oplossing voor het inbedden. We lossen de agarose op in dubbel gedestilleerd water door dit in een magnetron te verhitten, waarna we de oplossing in kleine buisjes overbrengen en bewaren in een warmteblok bij 42 °C.Eerst kunnen de embryo's na 22 tot 24 uur na bevruchting in een 5% PTU ringer-oplossing worden geplaatst om de vorming van pigment te remmen; dit pigment is helder autofluorescent en zou de axonen op de tweefotonenmicroscoop maskeren. Vervolgens selecteren we de embryo's voor beeldvorming en verwijderen we hun choon door ze voorzichtig met een pincet uit elkaar te trekken. Zodra de embryo's zijn geselecteerd, worden ze geanestheseerd door ongeveer 0,02% trica aan de PTU ringers toe te voegen.Controleer voordat u verder gaat of de dieren niet meer reageren op aanraking. Bereid de kamer voor langetermijnbeeldvorming voor door vacuümvet aan één zijde van een glazen of Teflon ring aan te brengen en deze te bevestigen op een glazen dekglas. Let erop dat er niet te veel van de PTU-ringers wordt overgebracht.Breng één embryo met een glazen pipet over naar de agro-oplossing van 42 graden. Verplaats het embryo vervolgens met één druppel agro naar een voorbehandeld dekglas. Zodra het embryo is overgebracht, kan het in de gewenste positie worden geplaatst terwijl de agro uithardt.Houd er rekening mee dat de beeldkamer aan het einde zal worden omgedraaid, zodat het koperen glaasje het bovenste oppervlak vormt. Als u beschikt over een gemotoriseerde tafel en meerdere locaties tegelijkertijd kunt afbeelden, herhaal dan deze stappen voor elk embryo. Laat de agarose volledig stollen.Vul de ring vervolgens met 0,02% tri canine PTU ringers. Breng ten slotte vacuümvet aan op de andere zijde van de ringen. Dek ze daarna af met een glazen plaatje.Draai de seal-kamers om. Nu zijn we klaar voor de vier ton exo tomy-beeldvorming. Plaats ter voorbereiding op de beeldvorming de gemonteerde embryo's in een objectglashouder onder de microscoop.Focus op één embryo met een 40 x 0,8 numerieke apertuur waterobjectief. Zet vervolgens de laser aan. Stel de laser in op een golflengte van 910 nanometers en een vermogen van 30 milliwatts.Open de beeldvormingssoftware. Wij maken gebruik van scanbeeldsoftware ontwikkeld in corals voor het laboratorium van Boar. Bij dit vermogen kan het veld worden gescand op zoek naar een kandidaat-axon dat zal worden doorgesneden.Zodra deze is gevonden, maakt u een afbeelding van het doelaxon. Markeer de eerste en laatste Z-posities, neem de afbeelding op en maak een maximale projectie van de Z-stacks. Zoom vervolgens 70x in op de vertakking van het axon die u wilt analyseren.Verhoog het vermogen naar 180 milliwatts en stel het aantal Z-doorsneden in op één. Start een enkele scan met de laser door op grab te drukken. Dit zou voldoende moeten zijn om het axon door te snijden, maar het is noodzakelijk om deze procedure te optimaliseren voor uw microscoop en experimentele doel.Zoom tot slot uit. Verminder het vermogen naar 30 milliwatts en maak een afbeelding van ons pas doorgesneden axon. Als er in uw laboratorium geen op maat gebouwde tweefotonenmicroscoop beschikbaar is, kan de Zes five 10 confocale tweefotonenmicroscoop ook worden gebruikt om axonen door te snijden.We beginnen door het gemonteerde embryo op de objecttafel te plaatsen en het in focus te brengen met een 25 x waterobjectief. Zet vervolgens de twee-fotonenlaser en de Argon-laser in een multi-track-instelling, zodat het mogelijk is om tussen beide te schakelen. Hoewel beide lasers worden gebruikt om GFP te detecteren, wordt de twee-fotonenemissie weergegeven in rood en de emissie van de Argon-laser in groen.Om de twee te kunnen onderscheiden, gebruikt u de Argonne-laser om een axon te identificeren dat bij de Z-instellingen behouden blijft. Markeer de eerste en laatste optische secties. Maak een confocale afbeelding en creëer een maximale projectie van de Zack.Schakel de argonlaser uit en zet de tweefoton laserscan aan bij een intensiteit van ongeveer 9% transmissie. Om te controleren of het axon nog steeds in focus is, klikt u op de stopknop zodat de uitsnijtool beschikbaar komt. Gebruik de uitsnijtool om in te zoomen op het gebied van interesse.Meestal zoomen we in tot ongeveer 70 x. Kies het gebied van het axon dat beschadigd moet worden en stel dit gebied scherp. De zoom kan worden gecontroleerd onder het tabblad 'mode'.Wijzig vervolgens, onder het tabblad kanalen, de intensiteit van de tweefoton-excitatie van ongeveer 9% transmissie naar 15 tot 30% transmissie. Klik om de nieuwe instellingen te activeren op de knop fast XY en klik daarna snel op stop. Om overmatige schade te voorkomen, moet het axon als verspreid debris zichtbaar zijn als de procedure succesvol was.Schakel ten slotte terug naar de 488 nanometer argonlaser om te bevestigen dat het axon inderdaad beschadigd is. Maak een volgende confocale afbeelding en creëer een maximale projectie van de z-stacks. Nu we twee manieren hebben gedemonstreerd om axonen door te snijden met behulp van tweefoton-lasermicroscopie, bekijken we de confocale time-lapse imaging van regeneratie met de Zeiss LSM 510.Om time-lapse imaging voor te bereiden, dient u de verwarmde tafel minimaal 30 minuten voordat u de time-lapse film instelt in te schakelen. Plaats de gemonteerde embryo's op een objectglashouder onder de microscoop. Stel scherp op één embryo met het gewenste luchtobjectief.We gebruiken een 20 x 0,5 numerieke apertuur objectief, openen de Zeiss LSM five 10 imaging-software en schakelen vervolgens de juiste lasers in en stellen de gewenste configuratie in. Open de scantraps en de multi-time vensters. Indien u over multi-time software beschikt, definieert u de positie en configuratie van uw eerste embryo in het multi-time venster.Activeer de snelle scan in het scanvenster en verplaats vervolgens de tafel naar de gewenste XY-positie. Markeer de eerste en laatste Z-posities in het scanvenster. Druk op stop en daarna op mid in het scanvenster, en wacht tot de scan van de middelste Z-doorsnede is voltooid.Klik vervolgens op mark position in het stage-venster. Als u slechts één embryo afbeeldt, klikt u op het tabblad single location in het multi-time-venster. Klik op replace X, y, Z. Klik vervolgens op save configuration.Bevestig wanneer u wordt gevraagd de vorige configuratie te overschrijven. Nu kunt u de parameters voor beeldacquisitie instellen in het multi lo-venster. Als u beschikt over een gemechaniseerde tafel, kunt u meerdere locaties instellen om meerdere embryo's te beeldvormen.In dit geval moet u het tabblad 'multiple locations' selecteren voordat u de X-, Y-, Z-coördinaten en de configuratie voor uw eerste locatie definieert. Zorg er daarnaast voor dat het uitklapmenu direct onder het tabblad 'multiple locations' op 'location one' staat en dat het uitklapmenu in het configuratiegedeelte op 'multi lo one' staat. Voordat u op 'save configuration' klikt, definieert u de positie en configuratie van de resterende embryo's in het venster 'multi-time'.Lokaliseer uw volgende embryo press fast scan, verplaats vervolgens de tafel naar de gewenste XY-positie en markeer uw eerste en laatste Z-posities in het scanvenster. Druk op stop. Druk vervolgens op mid in het scanvenster en wacht tot de scan van de middelste Z-slice is voltooid.Druk vervolgens op 'mark position'. Klik in het venster 'stage' op 'replace X, Y, Z'. Controleer of het uitklapmenu direct onder het tabblad 'multiple locations' op 'location two' staat en of het uitklapmenu in het configuratiegedeelte 'multi lobe two' aangeeft. Klik daarna op 'save configuration'. Bevestig dit. Wanneer er wordt gevraagd om de vorige configuratie te overschrijven, herhaal dit proces dan voor de resterende embryo's.Stel de parameters voor beeldacquisitie in het multi lo-venster in. Kies de optie GR GL in de lijst met bloksecties. Voer vervolgens het gewenste aantal groepsherhalingen in.Dit is het aantal keren dat de confocale microscoop een beeld per locatie zal vastleggen. Voer het gewenste wachttussenpoos in het parametergedeelte in. Dit is de tijd vanaf het begin van één beeldherhaling tot aan het begin van de volgende.Selecteer Zack XY in het configuratiegedeelte. Voer uw basisbestandsnaam in in het onderste gedeelte. Klik op select image db en kies uw database.Klik op de optiesknop en selecteer vervolgens uw MDB-map om ook tijdelijke bestanden op te slaan. Vink 'keep final image open' aan. Sla het definitieve beeld op, het midden van de Zack, en selecteer het gewichtsinterval.Klik op oké om het optiesvenster te sluiten en klik vervolgens op starttijd. Laat het venster voor meerdere tijdstippen openstaan gedurende de gehele imaging-procedure. Nu is het tijd om uw gegevens te analyseren.Wanneer de time-lapse imaging is voltooid, zal de multi-time software al uw tijdelijke bestanden samenvoegen tot één samenvattingsbestand voor elke locatie. Als u de opname wilt stoppen voordat deze is voltooid, zorg er dan voor dat u op 'finish' klikt in plaats van op 'stop', zodat er een samenvattingsbestand wordt aangemaakt.De tijdelijke bestanden en samenvattingsbestanden moeten automatisch worden opgeslagen in de aangewezen MDB-map. Hier is een representatief voorbeeld van een time-lapse confocale film na een exotomie op 54 uur na bevruchting. Het eerste frame toont een dorsaal aanzicht van het axon vóór de exotomie, waarbij een gele pijl wijst naar de plaats van de exotomie in het volgende tijdstip.De time-lapse movie begint binnen één uur na de exotomie en duurt 12 uur. Elke 20 minuten werd er één confocale stack verzameld. Deze time-lapse confocale movie is opgenomen met dezelfde parameters op 78 uur na fertilisatie.Het eerste frame toont een zijzicht van het axon vóór ex sodomie, met een gele pijl die naar de plek van de ex sodomie wijst. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u precieze weefselschade kunt veroorzaken en levende zebravisembryo's kunt visualiseren met behulp van tweefoton sodomie en time-lapse confocale beeldvorming. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de hoeveelheid vermogen van de tweefotonlaser voor ex sodomie te optimaliseren om overmatige schade te voorkomen.Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experiment.

two-photon-axotomy-time-lapse-confocal-imaging-live-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In deze video, demonstreren we een methode om de ontwikkeling van gewervelde hersenen te analyseren in levende zebravis embryo's bij enkele cel resolutie door confocale microscopie. Dit omvat de methode waarmee we injecteren van de single-cell zebravis embryo en vervolgens monteren en het imago van de zich ontwikkelende hersenen.

Live-Imaging van de zebravis embryonale Brain door confocale microscopie

Multifoton microscopie maakt de controle van een lage energetische fotonen met diepe penetratie optische en minder fototoxiciteit. We beschrijven het gebruik van deze technologie voor live cell etikettering in zebravis embryo's. Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast voor foto-inductie van diverse licht-responsieve moleculen.

Twee-foton-Based Fotoactivatie in de Live zebravis embryo&#39;s

In deze video worden de technieken voor multicolor confocale time-lapse imaging en gerichte cel ablatie verstrekt. Time-lapse imaging wordt gebruikt om het gedrag van meerdere celtypen van belang te...

Multicolor Time-lapse imaging van transgene zebravis: Visualizing netvlies Stem Cells geactiveerd door middel van gerichte neuronale cellen Ablation

De huidige video toont een methode die gebruik maakt van de combinatie van elektroporatie en confocale microscopie te leven imaging op individuele neurale stamcellen uit te voeren in de zich ontwikkelende zebravis voorhersenen.

Time-lapse Live-Imaging van klonaal verwante neurale progenitorcellen in de ontwikkelingslanden zebravis voorhersenen

Deze video beschrijft de methode om axonen in zebravisembryo's te verwonden met behulp van twee fotonlaseraxotomie en het observeren van axonale herstel van letsel.

Twee-Foton Laser Axotomie: Een methode om axonen in zebravisembryo's te verwonden en axonale herstel te observeren

Source: Williams, A. L., et al. Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (2017)This video showcases a multi-photon time-lapse imaging protocol to visualize the migration of neural crest cells in a zebrafish embryo in real-time with high resolution.

Visualizing Neural Crest Cell Migration in a Zebrafish Embryo Using Multi-Photon Time Lapse Imaging

Time-lapse confocale beeldvorming is een techniek nuttig voor het karakteriseren van embryonale ontwikkeling. Hier beschrijven we de methode karakteriseren craniofaciale morfogenese in wildtype en PDGFRA, Smad5 en SMO mutant embryo's.

Het analyseren Craniofacial Morphogenesis in zebravis behulp 4D confocale microscopie

Mitose is cruciaal voor elk levend organisme en defecten leiden vaak tot kanker en ontwikkelingsstoornissen. Met behulp van dit beeldvormingsprotocol en zebravissen als modelsysteem, kunnen onderzoekers mitose visualiseren in een levend gewerveld organisme en de veelvoud aan defecten die ontstaan wanneer mitotische processen defect zijn.

Observeren mitotische deling en Dynamiek in een live zebravis embryo

Een combinatie van de geavanceerde optische technieken van laser scanning microscopie met lange golflengte fluorescentie multi foton excitatie werd uitgevoerd om vast te leggen van real-time, hoge resolutie, driedimensionale beeldvorming van neurale crest migratie in GS (sox10:EGFP) en GS (foxd3:GFP) zebrafish embryo's.

Multi foton Time Lapse Imaging te visualiseren van ontwikkeling in realtime: visualisatie van migreren neurale kamcellen in Zebrafish embryo's

Dit protocol beschrijft een benadering voor in toto labeling en multidimensionale beeldvorming van zebravissen vroege oogontwikkeling. We beschrijven labeling, embedding en vierdimensionale (4D) beeldvorming met behulp van laserscannen confocale microscopie, en overwegingen voor het optimaliseren van de verwerving van datasets voor het ontleden van mechanismen van optische cupmorfogenese.

4-dimensionale beeldvorming van zebravis optic cup morfogenese

We demonstreren een methode die gebruik maakt van snelle confocale scanscopie om live beeldvorming uit te voeren van microgliacellen in het zich ontwikkelende optische tectum van zebravissen, waardoor de dynamiek van deze cellen in vivo kan worden geanalyseerd.

Live beeldvorming en karakterisering van de dynamiek van microglia in het zebravisembryo

Leer twee-foton axotomie en time-lapse confocale imaging voor neurobiologisch onderzoek met levende Danio rerio embryo's. Deze methode maakt langdurige beeldvorming van axonale dynamica mogelijk.

Twee-foton axotomy en time-lapse confocale imaging in levende zebravis embryo's

Meer video's verkennen