Twee-foton axotomy en time-lapse confocale imaging in levende zebravis embryo's

Om axonen door te snijden met in vivo tweefoton-beeldvorming, plaatst u geanestheseerde zebravissenembryo's in een druppel agar terwijl deze stolt in een gespecialiseerde kamer bestaande uit een TEFLON-ring en een dekglas. Een glasplaat wordt bovenop de kamer geplaatst, waarna deze ondersteboven wordt gekeerd voorafgaande aan de axotomie. Maak een beeld vóór de ingreep van het axon dat u wilt doorsnijden bij 40x vergroting en vervolgens bij 70x vergroting op de regio die u wilt axotomiseren.

Verhoog de lasersterkte terwijl de laser is uitgeschakeld. Zet de laser kortstondig aan. In het nabeeld van het axon is verspreid axonaal puin zichtbaar als de exotomie succesvol is.

Hoi, ik ben Georgia O'Brien. Hoi, ik ben Sandra Rigo. En ik ben Shauna Martin.

Wij komen uit het laboratorium van Alvarez TI van de afdeling Moleculaire Cel- en Ontwikkelingsbiologie aan de University of California Los Angeles. Vandaag tonen we u een procedure voor tweefoton-exsomie en time-lapse confocale beeldvorming in levende zebravisembryo's. Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de degeneratie en regeneratie van perifere somatosensorische axonen te bestuderen.

Laten we beginnen. Allereerst bereiden we een 1% low-melt agarose-oplossing voor het inbedden. We lossen de agarose op in dubbel gedestilleerd water door dit in een magnetron te verhitten, waarna we de oplossing in kleine buisjes overbrengen en bewaren in een warmteblok bij 42 °C.

Eerst kunnen de embryo's na 22 tot 24 uur na bevruchting in een 5% PTU ringer-oplossing worden geplaatst om de vorming van pigment te remmen; dit pigment is helder autofluorescent en zou de axonen op de tweefotonenmicroscoop maskeren. Vervolgens selecteren we de embryo's voor beeldvorming en verwijderen we hun choon door ze voorzichtig met een pincet uit elkaar te trekken. Zodra de embryo's zijn geselecteerd, worden ze geanestheseerd door ongeveer 0,02% trica aan de PTU ringers toe te voegen.

Controleer voordat u verder gaat of de dieren niet meer reageren op aanraking. Bereid de kamer voor langetermijnbeeldvorming voor door vacuümvet aan één zijde van een glazen of Teflon ring aan te brengen en deze te bevestigen op een glazen dekglas. Let erop dat er niet te veel van de PTU-ringers wordt overgebracht.

Breng één embryo met een glazen pipet over naar de agro-oplossing van 42 graden. Verplaats het embryo vervolgens met één druppel agro naar een voorbehandeld dekglas. Zodra het embryo is overgebracht, kan het in de gewenste positie worden geplaatst terwijl de agro uithardt.

Houd er rekening mee dat de beeldkamer aan het einde zal worden omgedraaid, zodat het koperen glaasje het bovenste oppervlak vormt. Als u beschikt over een gemotoriseerde tafel en meerdere locaties tegelijkertijd kunt afbeelden, herhaal dan deze stappen voor elk embryo. Laat de agarose volledig stollen.

Vul de ring vervolgens met 0,02% tri canine PTU ringers. Breng ten slotte vacuümvet aan op de andere zijde van de ringen. Dek ze daarna af met een glazen plaatje.

Draai de seal-kamers om. Nu zijn we klaar voor de vier ton exo tomy-beeldvorming. Plaats ter voorbereiding op de beeldvorming de gemonteerde embryo's in een objectglashouder onder de microscoop.

Focus op één embryo met een 40 x 0,8 numerieke apertuur waterobjectief. Zet vervolgens de laser aan. Stel de laser in op een golflengte van 910 nanometers en een vermogen van 30 milliwatts.

Open de beeldvormingssoftware. Wij maken gebruik van scanbeeldsoftware ontwikkeld in corals voor het laboratorium van Boar. Bij dit vermogen kan het veld worden gescand op zoek naar een kandidaat-axon dat zal worden doorgesneden.

Zodra deze is gevonden, maakt u een afbeelding van het doelaxon. Markeer de eerste en laatste Z-posities, neem de afbeelding op en maak een maximale projectie van de Z-stacks. Zoom vervolgens 70x in op de vertakking van het axon die u wilt analyseren.

Verhoog het vermogen naar 180 milliwatts en stel het aantal Z-doorsneden in op één. Start een enkele scan met de laser door op grab te drukken. Dit zou voldoende moeten zijn om het axon door te snijden, maar het is noodzakelijk om deze procedure te optimaliseren voor uw microscoop en experimentele doel.

Zoom tot slot uit. Verminder het vermogen naar 30 milliwatts en maak een afbeelding van ons pas doorgesneden axon. Als er in uw laboratorium geen op maat gebouwde tweefotonenmicroscoop beschikbaar is, kan de Zes five 10 confocale tweefotonenmicroscoop ook worden gebruikt om axonen door te snijden.

We beginnen door het gemonteerde embryo op de objecttafel te plaatsen en het in focus te brengen met een 25 x waterobjectief. Zet vervolgens de twee-fotonenlaser en de Argon-laser in een multi-track-instelling, zodat het mogelijk is om tussen beide te schakelen. Hoewel beide lasers worden gebruikt om GFP te detecteren, wordt de twee-fotonenemissie weergegeven in rood en de emissie van de Argon-laser in groen.

Om de twee te kunnen onderscheiden, gebruikt u de Argonne-laser om een axon te identificeren dat bij de Z-instellingen behouden blijft. Markeer de eerste en laatste optische secties. Maak een confocale afbeelding en creëer een maximale projectie van de Zack.

Schakel de argonlaser uit en zet de tweefoton laserscan aan bij een intensiteit van ongeveer 9% transmissie. Om te controleren of het axon nog steeds in focus is, klikt u op de stopknop zodat de uitsnijtool beschikbaar komt. Gebruik de uitsnijtool om in te zoomen op het gebied van interesse.

Meestal zoomen we in tot ongeveer 70 x. Kies het gebied van het axon dat beschadigd moet worden en stel dit gebied scherp. De zoom kan worden gecontroleerd onder het tabblad 'mode'.

Wijzig vervolgens, onder het tabblad kanalen, de intensiteit van de tweefoton-excitatie van ongeveer 9% transmissie naar 15 tot 30% transmissie. Klik om de nieuwe instellingen te activeren op de knop fast XY en klik daarna snel op stop. Om overmatige schade te voorkomen, moet het axon als verspreid debris zichtbaar zijn als de procedure succesvol was.

Schakel ten slotte terug naar de 488 nanometer argonlaser om te bevestigen dat het axon inderdaad beschadigd is. Maak een volgende confocale afbeelding en creëer een maximale projectie van de z-stacks. Nu we twee manieren hebben gedemonstreerd om axonen door te snijden met behulp van tweefoton-lasermicroscopie, bekijken we de confocale time-lapse imaging van regeneratie met de Zeiss LSM 510.

Om time-lapse imaging voor te bereiden, dient u de verwarmde tafel minimaal 30 minuten voordat u de time-lapse film instelt in te schakelen. Plaats de gemonteerde embryo's op een objectglashouder onder de microscoop. Stel scherp op één embryo met het gewenste luchtobjectief.

We gebruiken een 20 x 0,5 numerieke apertuur objectief, openen de Zeiss LSM five 10 imaging-software en schakelen vervolgens de juiste lasers in en stellen de gewenste configuratie in. Open de scantraps en de multi-time vensters. Indien u over multi-time software beschikt, definieert u de positie en configuratie van uw eerste embryo in het multi-time venster.

Activeer de snelle scan in het scanvenster en verplaats vervolgens de tafel naar de gewenste XY-positie. Markeer de eerste en laatste Z-posities in het scanvenster. Druk op stop en daarna op mid in het scanvenster, en wacht tot de scan van de middelste Z-doorsnede is voltooid.

Klik vervolgens op mark position in het stage-venster. Als u slechts één embryo afbeeldt, klikt u op het tabblad single location in het multi-time-venster. Klik op replace X, y, Z. Klik vervolgens op save configuration.

Bevestig wanneer u wordt gevraagd de vorige configuratie te overschrijven. Nu kunt u de parameters voor beeldacquisitie instellen in het multi lo-venster. Als u beschikt over een gemechaniseerde tafel, kunt u meerdere locaties instellen om meerdere embryo's te beeldvormen.

In dit geval moet u het tabblad 'multiple locations' selecteren voordat u de X-, Y-, Z-coördinaten en de configuratie voor uw eerste locatie definieert. Zorg er daarnaast voor dat het uitklapmenu direct onder het tabblad 'multiple locations' op 'location one' staat en dat het uitklapmenu in het configuratiegedeelte op 'multi lo one' staat. Voordat u op 'save configuration' klikt, definieert u de positie en configuratie van de resterende embryo's in het venster 'multi-time'.

Lokaliseer uw volgende embryo press fast scan, verplaats vervolgens de tafel naar de gewenste XY-positie en markeer uw eerste en laatste Z-posities in het scanvenster. Druk op stop. Druk vervolgens op mid in het scanvenster en wacht tot de scan van de middelste Z-slice is voltooid.

Druk vervolgens op 'mark position'. Klik in het venster 'stage' op 'replace X, Y, Z'. Controleer of het uitklapmenu direct onder het tabblad 'multiple locations' op 'location two' staat en of het uitklapmenu in het configuratiegedeelte 'multi lobe two' aangeeft. Klik daarna op 'save configuration'. Bevestig dit. Wanneer er wordt gevraagd om de vorige configuratie te overschrijven, herhaal dit proces dan voor de resterende embryo's.

Stel de parameters voor beeldacquisitie in het multi lo-venster in. Kies de optie GR GL in de lijst met bloksecties. Voer vervolgens het gewenste aantal groepsherhalingen in.

Dit is het aantal keren dat de confocale microscoop een beeld per locatie zal vastleggen. Voer het gewenste wachttussenpoos in het parametergedeelte in. Dit is de tijd vanaf het begin van één beeldherhaling tot aan het begin van de volgende.

Selecteer Zack XY in het configuratiegedeelte. Voer uw basisbestandsnaam in in het onderste gedeelte. Klik op select image db en kies uw database.

Klik op de optiesknop en selecteer vervolgens uw MDB-map om ook tijdelijke bestanden op te slaan. Vink 'keep final image open' aan. Sla het definitieve beeld op, het midden van de Zack, en selecteer het gewichtsinterval.

Klik op oké om het optiesvenster te sluiten en klik vervolgens op starttijd. Laat het venster voor meerdere tijdstippen openstaan gedurende de gehele imaging-procedure. Nu is het tijd om uw gegevens te analyseren.

Wanneer de time-lapse imaging is voltooid, zal de multi-time software al uw tijdelijke bestanden samenvoegen tot één samenvattingsbestand voor elke locatie. Als u de opname wilt stoppen voordat deze is voltooid, zorg er dan voor dat u op 'finish' klikt in plaats van op 'stop', zodat er een samenvattingsbestand wordt aangemaakt.

De tijdelijke bestanden en samenvattingsbestanden moeten automatisch worden opgeslagen in de aangewezen MDB-map. Hier is een representatief voorbeeld van een time-lapse confocale film na een exotomie op 54 uur na bevruchting. Het eerste frame toont een dorsaal aanzicht van het axon vóór de exotomie, waarbij een gele pijl wijst naar de plaats van de exotomie in het volgende tijdstip.

De time-lapse movie begint binnen één uur na de exotomie en duurt 12 uur. Elke 20 minuten werd er één confocale stack verzameld. Deze time-lapse confocale movie is opgenomen met dezelfde parameters op 78 uur na fertilisatie.

Het eerste frame toont een zijzicht van het axon vóór ex sodomie, met een gele pijl die naar de plek van de ex sodomie wijst. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u precieze weefselschade kunt veroorzaken en levende zebravisembryo's kunt visualiseren met behulp van tweefoton sodomie en time-lapse confocale beeldvorming. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de hoeveelheid vermogen van de tweefotonlaser voor ex sodomie te optimaliseren om overmatige schade te voorkomen.

Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experiment.