Name: Homemade plaatsgerichte mutagenese van Whole Plasmids (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-11T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Leer een eenvoudige en kosteneffectieve methode voor plaatsgerichte mutagenese van hele plasmiden. Deze techniek maakt het mogelijk om specifieke basissubstituties in plasmiden te introduceren voor moleculair biologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Principe van de methode: De site mutagenese van hele plasmiden uitgelegd in deze video is een mutagenese methode die stelt u in staat te veranderen een gekloond target-gen door substitutie, deletie of insertie van een paar bases direct in een plasmide. Het werkt door het versterken van de hele plasmide, in een niet PCR-gebaseerde thermocycling reactie. Tijdens de reactie mutagene primers, het dragen van de gewenste mutatie in de vorm van mismatches op de oorspronkelijke plasmide, zijn geïntegreerd in de nieuw gesynthetiseerde plasmide. Na verwijdering van de oorspronkelijke plasmide uit de reactie van het gemuteerde plasmide wordt getransformeerd in E. coli. De volgende stappen zijn voor screening doeleinden, omdat de mutatie efficiëntie van deze methode is niet 100%. De hele procedure duurt drie dagen, maar het grootste deel kan worden gedaan binnen een dag. 1,0 Dag een: 1.1 thermocycling reactie: Originele Plasmide: Deze site mutagenese protocol werkt het beste met plasmiden tot 10KB. Grotere Plasmiden zijn een beetje moeilijk te muteren met deze methode en kan wat geduld en aanpassing van de thermocycling voorwaarden en / of de bevoegde cellen nemen. Verder is de plasmide waarin u werkt met een moet worden geïsoleerd van een dam + bacterie stam. Voor de thermocycling reactie moet u 10 tot 60 NGS van het plasmide dat u wilt muteren. Primers: Voordat u kunt uw reactie thermocycling u uw primers bij de hand. Je hebt ongeveer 150 ng van elke mutagene primer. Het is ok als je 1,5 pi van een 1:10 verdunde 100 pM voorraad. Er zijn een paar eenvoudige richtlijnen die je moet overwegen bij het ontwerpen van uw mutagene primers: <ul><li> De primers moet complementair zijn aan elkaar </li><li> De primers moet tussen de 25 en 45 nucleotiden in lengte </li><li> De mutaties in de vorm van mismatches op de oorspronkelijke plasmide moet worden opgenomen in beide primers </li><li> De mismatches moet in het midden in de primer en geflankeerd door ten minste 8 nucleotiden aan elke kant </li><li> De primers moet een GC-gehalte van ten minste 40% </li><li> De primers moet eindigen 5 prime en prime 3 met een of meer Gs of CS </li><li> De primers hoeven niet te worden gefosforyleerd, noch hebben ze te worden FPLC of PAGE gezuiverd, alleen ontzout ze zouden moeten zijn. </li><li> Voor de berekening van Tm je hebt geen formule, maar Tm op de verzendkosten certificaat moet hoger dan 60 ° C. </li><li> Voor de screening is het handig om te voegen of een beperking site te verwijderen met uw mutatie. Door de degeneratie van de genetische code zijn er vele mogelijkheden om een ​​beperking website invoegen met de gewenste mutatie. De website van de New England Biolabs is een hulpmiddel om zo&#39;n geschikte restrictie-site te vinden. Voer uw primer sequentie die codeert voor de aminozuursequentie die u wenst, het gebruik van de dubbelzinnigheid code voor DNA. Het enzym finder tool zal u vertellen welke restrictie sites kunnen parallel worden geïntroduceerd om de gewenste mutatie. Als u alle mogelijke beperking of praktisch site niet te vinden door op deze manier, kun je elk nieuwe beperking website plaatsen, zonder met betrekking tot de genetische code op de plaats van mutatie. Daarna kunt u dit plasmide als sjabloon voor een reeks van mutaties waarin deze beperking site zal worden verwijderd door het inbrengen van de nieuwe mutagene primers. Deze benadering kan erg handig zijn als je van plan bent om een ​​reeks van mutaties doen op dezelfde locatie van het plasmide. </li></ul> DNA-polymerase: Voor deze methode moet je een thermostabiel DNA-polymerase dat 3&#39;-5 &#39;exonuclease activiteit vertoont en creëert stompe uiteinden. Wij gebruiken altijd recombinant Pfu-polymerase van Fermentas. Als je hebt problemen met de versterking stappen die u kunt proberen een hogere kwaliteit polymerase, maar voor de meeste doeleinden de standaard Pfu zal genoeg zijn. Vul de reactie met dNTPs, polymerase buffer en water. 1.2 thermocycling voorwaarden De thermocycler moet worden ingesteld op de volgende manier. De initiële en terugkerende denaturatie fase is ingesteld op 30 seconden bij 95 ° C. De annealing temperatuur van de primers mag niet worden berekend met ingewikkelde formules. We meestal zet de annealing temperatuur tot 55 ° C en de annealing tijd om een ​​minuut. Voor de primers van 25 tot 30 nucleotiden die je meestal gebruikt, dit werkt voor ons 95% van de tijd. Hoe dan ook als dit niet zou werken, probeer dan alleen het variëren van de annealing temperatuur tussen 50 - en 60 ° C. De rek temperatuur hangt af van de polymerase die u gebruikt. In deze demonstratie gebruiken we de Pfu-polymerase van Fermentas, waarin wordt opgeroepen tot een verlenging temperatuur van 72 ° C. De rek varieert volgens de grootte van het plasmide. We hebben altijd rekenen 1 min per kb, en voeg een extra minuten om dattijd. Bijvoorbeeld, voor een 9KB plasmide we zouden kiezen voor 10min als rek de tijd. 18 cycli voldoende zijn om aan voldoende plasmide gemuteerd voor het verder gebruik. Houden van het aantal cycli laag is, ook bespaart u tijd. <img src="/files/ftp_upload/1135/figure1.png" alt="Figuur 1" width="600" height="287" /> 1.3 Gelcheck na thermocycling reactie De succesvolle versterking moet worden gecontroleerd door het uitvoeren van een elektroforese. Direct na het fietsen klaar is, belasting 5 ul van de reactie op een 1% TAE agarose gel. Als de versterking succesvol was, moet u een aparte band. Maar als de nieuw gesynthetiseerde DNA is niet duidelijk zichtbaar op de gel, kunt u proberen het neerslaan van de hele reactie en het gebruiken voor transformatie in de volgende stap. Voor ons heeft dit zelden gewerkt, maar het is de moeite waard om een ​​poging te geven. Het beste wat te doen als de reactie niet werkt is het aanpassen van de annealing temperatuur. 1.4 DpnI spijsvertering: Voor de transformatie van de oorspronkelijke plasmide die diende als een mal moet worden verwijderd uit de reactie op sterke achtergrond te voorkomen. Dit wordt gedaan door restrictievertering met DpnI. Deze beperking endonuclease snijdt alleen plasmide gemethyleerd. De erkenning en de beperking site is de volgorde GATC terwijl A moet worden gemethyleerd. Bij het verteren met DpnI alleen de originele ongemuteerde plasmide dat werd geïsoleerd uit een dam + stam wordt gesneden, de nieuw gesynthetiseerde gemuteerde plasmide die niet gemethyleerd niet beïnvloed door DpnI. Voeg eenvoudig 1-2 pl DpnI om de reactie en incubeer het minstens een uur bij 37 °. Bij het gebruik van de Fast verteren DpnI de incubatietijd kan worden verminderd tot ongeveer 15 minuten. De kwaliteit van uw DpnI en de incubatietijd van deze beperking vertering bepaalt sterk hoe sterk je achtergrond met gemuteerde plasmide zal zijn. 1.5 Transformatie: Na DpnI spijsvertering het plasmide is klaar voor transformatie naar de bevoegde E. coli-cellen. Voeg gewoon 5 pi van de DpnI spijsvertering reactie in de competente cellen en het uitvoeren van de transformatie, zoals aanbevolen in uw lab. In ons geval gebruiken we de warmte shock procedure door het incuberen van de bacterie-plasmide mengsel op ijs gedurende 30 minuten en daarna heat shock is bij 42 ° C gedurende 90 sec. Na het toevoegen van 200 pi SOC-oplossing, zijn de bacteriën geïncubeerd, krachtig schudden, bij 37 ° C gedurende 1 uur Na 1 uur zijn de bacteriën uitgeplaat op het selecteren van agar media. 2,0 Dag twee 2.1 Screening van klonen deel 1: Selectie van klonen Omdat de mutatie rendement is niet 100% je nodig hebt om het scherm voor uw mutanten. We doen dit door restrictievertering waarin we controleren op de aanwezigheid of afwezigheid van de beperking site die we toegevoegd of verwijderd door middel van primer integratie. Voor dit doel hebben we meestal halen acht kolonies en groeien ze over &#39;s nachts voor plasmide voorbereiding op de volgende dag. 3,0 Dag drie 3.1 Screening van klonen deel 2: Beperking knippen met marker enzym Op de derde dag het uitvoeren van een Mini-Prep en de daaropvolgende restrictievertering met je marker enzym. Op de gel je dan kunt zien welke van je klonen dragen de gewenste mutatie en welke niet degenen. De screening methode met restrictievertering werkt erg goed. Toch moet u uw succesvolle mutatie te bevestigen door sequentiebepaling.

<ol><li>Papworth, C., Bauer, J. C., Braman, J., Wright, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QuikChange+site-directed+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Strategies%22%5BJournal%5D)">QuikChange site-directed mutagenesis.</a> Strategies. 9, 3-4 (1996).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te melden.

Plaatsgerichte mutagenese is een mutagenese-methode die een snelle manier om een ​​gen gedragen door een plasmide muteren biedt. De hele reactie kan worden gedaan in slechts een dag. Met deze methode, zal het nodig hebben alleen maar een paar gratis primers het dragen van de gewenste mutaties en een proeflezen polymerase zoals Pfu-Polymerase. De nieuw gesynthetiseerde plasmide kan worden gescheiden van het ouderlijk plasmide door verteren de reactie met het restrictie-enzym DpnI. Dit enzym verteert alleen de gemethyleer...

<table><tbody><tr><td>Pfu polymerase (recombinant of natief)</td><td>Fermentas</td><td>EP0571 of EP0501</td><td></td></tr><tr><td>dNTP-mix 10 mM </td><td>Fermentas</td><td>R0191</td><td></td></tr><tr><td>DpnI of DpnI Fast digest</td><td>Fermentas</td><td>ER1701</td><td></td></tr><tr><td>primers</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>ontzout</td></tr></tbody></table>

homemade plaatsgerichte mutagenese van whole plasmids

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Plaatsgerichte mutagenese van hele plasmiden is een eenvoudige manier om iets verschillende varianten van een origineel plasmide te creëren. Met deze methode wordt de gekloonde doelwitgen kan worden gewijzigd door substitutie, deletie of insertie van een paar bases direct in een plasmide. Het werkt door simpelweg het versterken van de hele plasmide, in een niet PCR-gebaseerde thermocycling reactie. Tijdens de reactie mutagene primers, het dragen van de gewenste mutatie, zijn geïntegreerd in de nieuw gesynthetiseerde plasmide. In deze video tutorial tonen we aan een eenvoudige en kosteneffectieve manier om de base substituties introduceren in een plasmide. Het protocol werkt met standaard reagentia en is onafhankelijk van commerciële kits, die vaak erg duur. Toepassing van dit protocol kan de totale kosten van een reactie op een achtste van wat het kost met behulp van enkele van de commerciële kits. In deze video hebben we ook commentaar geven op kritische stappen tijdens het proces en geeft gedetailleerde instructies over hoe de mutagene primers te ontwerpen.

Plaatsgerichte mutagenese van hele plasmiden is een eenvoudige manier om iets verschillende varianten van een origineel plasmide te creëren. Hier laten we zien op een eenvoudige en kosteneffectieve manier om de base substituties te introduceren in een plasmide met behulp van standaard reagentia.

Homemade plaatsgerichte mutagenese van Whole Plasmids

Site-gerichte mutagenese van volledige plasmiden is een eenvoudige manier om licht variërende versies van een oorspronkelijk plasmide te creëren. Met deze methode wordt het gekloonde ...

Hallo. Mijn naam is Mark Blo. Ik ben een promovendus biologie aan de University of Mines in Duitsland. Vandaag willen mijn vriend Kajo en ik u laten zien hoe u een zelfgemaakte site-directed neurogenese uitvoert.De methode werd oorspronkelijk ontwikkeld door Ethal en is door velen anderen aangepast. Wanneer u vandaag de dag op het internet zoekt, vindt u dan ook talrijke verschillende protocollen die op enkele meer of minder significante punten van elkaar verschillen. Vandaag willen we u een eenvoudige en kostenefficiënte manier laten zien die voor ons goed werkt.Laten we beginnen. Voor dit experiment heeft u een thermostabiele proofreading DNA-polymerase nodig. Wij gebruiken hiervoor altijd PFU-polymerase van Fermentas.U heeft ook de polymerasebuffer, dNTP-mix en water nodig. Daarnaast heeft u het restrictie-enzym DpnI, competente E. coli-cellen, een agarplaat, bacteriële kweekbouillon en een aantal tandenstokers nodig. Het meest essentiële en kritische onderdeel van deze methode is het ontwerp van de mutagenen primera.Er zijn enkele eenvoudige richtlijnen die u in acht moet nemen bij het ontwerpen van uw primerpaar. De primers moeten complementair aan elkaar zijn en een lengte he

homemade-site-directed-mutagenesis-of-whole-plasmids

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier laten we zien een eenvoudig protocol om een ​​willekeurige mutant bibliotheek te creëren voor een bepaalde doelsequentie. We laten zien hoe deze methode, die in vivo uitgevoerd in Escherichia coli, kan worden gecombineerd met functionele selecties van nieuwe enzymatische activiteiten evolueren.

Mutagenese en functionele selectie Protocollen voor Gerichte ontwikkeling van eiwitten in E. coli</em

Source: Tomás, J. M., et al. Generation of Null Mutants to Elucidate the Role of Bacterial Glycosyltransferases in Bacterial Motility. J. Vis. Exp. (2022).This video demonstrates the initiator-dependent amplification of a suicide plasmid in E. coli. The plasmid, which carries an antibiotic resistance gene, replicates only in the presence of an initiator protein encoded by the host. After electroporation and incubation in recovery medium, the mixture is plated on antibiotic-containing agar.

Amplification of a Suicide Plasmid in a Bacterial Host

Source: Lea-Smith, D. J., et al. Generation of Marked and Markerless Mutants in Model Cyanobacterial Species. J. Vis. Exp. (2016)The video demonstrates a method for generating antibiotic-marked mutants in cyanobacteria. The protocol begins with culturing cyanobacteria, followed by centrifugation and washing steps that preserve surface pili. A plasmid carrying an antibiotic resistance gene flanked by homologous sequences is then introduced. During incubation, the plasmid is internalized via pili...

Generation of Antibiotic-Marked Mutants in Cyanobacteria via Homologous Recombination

We presenteren een protocol voor de functionele beoordeling van de uitgebreide single-site verzadigingsmutagenese bibliotheken van eiwitten met behulp van high-throughput sequencing. Belangrijk is dat deze aanpak maakt gebruik van orthogonale primer paren bibliotheek bouw en sequencing multiplexen. Representatieve resultaten met behulp van TEM-1 β-lactamase gekozen klinisch relevante dosering van ampicilline wordt verschaft.

Een protocol voor Functionele Evaluatie van Whole-Protein verzadigingsmutagenese Bibliotheken Met behulp van High-throughput sequencing

Uitbreiding van de genetische code dient als een krachtig hulpmiddel om te bestuderen van een breed scala aan biologische processen, met inbegrip van eiwit acetylation. Hier tonen we een facile protocol misbruiken van deze techniek voor het genereren van homogeen geacetyleerd eiwitten op specifieke sites in Escherichia coli cellen.

Een Facile Protocol voor het genereren van Site-Specifically geacetyleerd eiwitten in Escherichia Coli

Dit artikel beschrijft een gedetailleerde methodologie voor willekeurige mutagenese van een target-gen in kernsplijting gist. Als voorbeeld, wij de doelstelling van rpt4 +, die codeert een subeenheid van de 19S proteasoom, en het scherm voor mutaties die heterochromatin te destabiliseren.

Gen-gerichte willekeurige mutagenese Heterochromatin-destabiliserende proteasoom mutanten in Fission gist selecteren

Plaats-geleide mutagenese is een techniek die wordt gebruikt om specifieke mutaties in deoxyribonucleic acid (DNA). Dit protocol beschrijft hoe het te doen plaats-geleide mutagenese met een 2-step en 3-staps polymerase-kettingreactie (PCR) gebaseerde benadering, die is van toepassing op elk fragment van DNA van belang.

Plaats-geleide mutagenese voor In Vitro en In Vivo experimenten wordt geïllustreerd met RNA interacties in Escherichia Coli

De endonucleases van de beperking met nieuwe opeenvolgingsspecificiteit kunnen van enzymen worden ontwikkeld die een gedeeltelijk gedegenereerde opeenvolging erkennen. Hier bieden we een gedetailleerd protocol dat we met succes gebruikt om de volgorde specificiteit van NlaIV enzym te veranderen. De belangrijkste ingrediënten van het protocol zijn de in vitro compartimentering van de transcriptie/vertaalreactie en selectie van varianten met nieuwe sequentiespecifiekekenmerken.

In Vitro Gerichte Evolutie van een beperking Endonuclease met strengere specificiteit

Het huidige protocol beschrijft nieuwe hulpmiddelen voor SPR-bindingstests om CV-N-binding aan HA, S-glycoproteïne, gerelateerde hybride-type glycanen en oligosacchariden met een hoog mannosegehalte te onderzoeken. SPR wordt gebruikt om de KD te bepalen voor het binden van dimerische of monomere CV-N aan deze glycanen.

Engineering antivirale middelen via Surface Plasmon Resonance

Hier presenteren we een protocol om DNA-modificaties in bacteriofagen te verminderen met behulp van het NgTET-enzym, waardoor efficiënte en littekenloze CRISPR-Cas-mutagenese mogelijk wordt. Deze methode vergemakkelijkt de genetische manipulatie van fagen voor toepassingen in de biotechnologie en faagtherapie.

Nauwkeurige faagmutagenese met NgTET-geassisteerde CRISPR-Cas-systemen

Leer een eenvoudige en kosteneffectieve methode voor plaatsgerichte mutagenese van hele plasmiden. Deze techniek maakt het mogelijk om specifieke basissubstituties in plasmiden te introduceren voor moleculair biologisch onderzoek.

Homemade plaatsgerichte mutagenese van Whole Plasmids

Meer video's verkennen