Name: Dissectie van Saccharomyces Cerevisiae Asci (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-19T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 57 s
Description: Leer micromanipulatietechnieken voor gistcellen om meiotische genetische analyse uit te voeren met Saccharomyces cerevisiae. Deze methode helpt onderzoekers bij de selectie van diploïde zygoten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Werk in het laboratorium van de auteur wordt gefinancierd door de Canadese Institutes of Health Research, de Canada Foundation for Innovation, het Natural Sciences and Engineering Research Council en Concordia University.

Bouw van diploïde stammen Protocol voor de productie van diploïden door voortplanting <ol><li> De initiële stammen moeten worden geslagen op YPD, of selectief medium, indien nodig, om enkele kolonies te produceren. De twee haploïde stammen moeten zijn van tegengestelde mating type (dwz Mata en MATα). </li><li> Met behulp van een steriele enting lus kies een klein deel van een kolonie van een van de twee haploïde stammen. Op een nieuwe plaat YPD streep de lus een keer in een rechte lijn over de plaat. Markeer de richting van de streep met een pijl op de onderzijde van de plaat. </li><li> Herhaal dit voor de tweede stam op dezelfde YPD plaat. Dit keer streak de kolonie loodrecht op de eerste, kruising de eerste streep met de tweede. Markeer de richting van de tweede streep en let op het gebied waar de tweede streep passeert de eerste. Dit gebied zal zijn waar diploïden zullen worden geproduceerd. </li><li> Incubeer de plaat YPD bij 30 ° C gedurende de nacht. </li><li> Replica bord van de YPD plaat op selectieve media die selectief zal het mogelijk de groei van de pas gevormde diploïden. </li><li> Kies een enkele kolonie indien mogelijk, of een klein deel van de diploïde streep en streep op dezelfde selectieve medium om enkele kolonies te genereren. </li></ol> Sporulatie en de vertering van ASCI Protocol <ol><li> Pick enkele kolonies van de plaat boven en maak kleine (1 cm x 1 cm) vlekken op sporulatie (SPO) platen en incubeer bij 30 ° C voor 3-7 dagen naar sporulate. </li><li> Sporulatie kan worden gecontroleerd door te kijken naar cellen van elke patch onder een lichtmicroscoop. Plaats cellen op een objectglaasje 5-10 ul van water, plaats een dekglaasje op de top van de druppel, en zoek naar de aanwezigheid van ASCI. Als ASCI zijn niet gemakkelijk te vinden dan weer in de incubator. </li><li> Als er effectief sporulatie in een van de patches, bereiden een steriele 15 ml conische buis met 100μL van tetrade sap. </li><li> Pick up van deze cellen sporulatie patch met een steriele 3mm enting lus (cellen moet ¼ van de loop te dekken) en plaats in het viertal sap. Zwenk de lus om de cellen te vallen uit de lus en meng met de oplossing. </li><li> Laat in tetrade sap (met zymolyase) voor 4-10 minuten (afhankelijk van de concentratie en activiteit van zymolyase en de stam zelf). Dit maakt voor de spijsvertering van de celwand rond de ascosporen. </li><li> Markeer de boven-en onderkant van het inoculum regio op een YPD plaat. </li><li> Optioneel. Reactie kan worden gestopt door toevoeging van 1 ml van ijs koude steriele dH 2 O. Laat de cellen om zich te vestigen voor 5mins. Verwijder 1 ml van het supernatant dan licht mengen met de hand te houden en op ijs. </li><li> Neem 5μL van verteerd cellen van stap 5 en voorzichtig plaats druppels in een lijn in het inoculum gebied van de pre-gemarkeerde YPD plaat. </li><li> Gebruik een steriele 3mm enting lus om heel voorzichtig verspreiding van de druppels 1-3 maal in een lijn, terwijl nauwelijks contact maken met de agar. </li><li> Laat de vloeistof te absorberen in de agar (Als stap 7 is weggelaten, dit is wanneer de spijsvertering van de buitenste celwand zal worden verlaagd stoppen of). Ga verder naar de dissectie microscoop. </li></ol> Dissectie van Asci Protocol Merk op dat de volgende protocol wordt beschreven voor een Singer MSM System 200 micromanipulatie microscoop. Dit protocol kan worden gevolgd met lichte wijzigingen bij gebruik van een handmatige micromanipulator, zoals een Zeiss micromanipulator MR. <ol><li> Focus op een gebied van de plaat waar de helft van het veld bevat cellen en half leeg is. Langzaam breng de naald in beeld zodanig dat het de lege gebied van het veld raakt. Dit zal ervoor zorgen dat de naald geen cellen van een eerder gebruik bevatten. Contact tussen de naald en de agar wordt gezien als een donkere zwarte cirkel die langzaam komt in beeld. </li><li> Ga naar de matrix op positie A1 en maak een merk door het doorboren van de agar opnieuw. Dit is om de oriëntatie van de plaat te bepalen of het wordt genomen uit de microscoop voor de voltooiing. </li><li> Schakel over naar de zoekmodus. Zoek een ASCI. Kies bij voorkeur ASCI die in gebieden waar de cellen goed verspreid. Vermijd gebieden met cel-clusters. De vier ascosporen van een asci moet nog steeds worden aan elkaar bevestigd. Twee ascosporen kan iets groter dan de andere twee. Vermijd plukken ASCI waar een ascospore is los en niet verbonden met de rest van de ascosporen. </li><li> Pick-up een ASCUS met de naald. Langzaam breng de naald tot aan de plaat. Wanneer de schaduw van de microneedle wordt gezien, lijn deze met de ASCUS om geplukt te worden. Opnieuw aanpak van de naald tot de zwarte omtrek van een cirkel (de punt van de naald) wordt gezien. Raak het viertal met deze cirkel en vervolgens snel weg te trekken van de naald. Zorg ervoor dat alle vier de ascosporen van een ASCUS hebben gehandeld op grond van de naald en dat er geen extra cellen werden verzameld op de microneedle die geen deel uitmaken van deze ASCUS. </li><li> Trek de microneedle ver weg van de plaat en ga naar de matrix (voor de eerste ASCUS, ga naarpositie A1). Kennis te nemen van elke positie waar een ASCUS is verplaatst. Plaats de ASCUS door het aanraken van de plaat met de microneedle en wegrijden totdat alle vier de ascosporen komen uit de microneedle. Zachte tikken van de naald arm of het platform die de YPD plaat is vaak handig bij deze stap. </li><li> Herhaal stappen 3-5 en plaats asci neer op opeenvolgende posities op de matrix totdat het gewenste aantal asci zijn geplukt. </li><li> Ga terug naar elke ASCUS en los te breken van de vier cellen van plagen met de naald, het aanboren van het platform voorzichtig of een combinatie van beide. Pak de cellen het verlaten van een achter op een nieuwe positie in de matrix tot elke ascospore in elk ASCUS wordt gescheiden in rijen van vier. </li><li> Plaats de YPD plaat in een incubator bij 30 ° C gedurende enkele dagen om de groei patroon te observeren. </li><li> Replica bord van de ontleed cellen selectief medium indien nodig. </li></ol> Verhuizing van Zygoten Protocol <ol><li> Streak uit twee haploïde stammen met een tegengestelde voortplantingstypes op het geschikte medium om enkele kolonies te krijgen. </li><li> Mate van deze twee stammen zoals hierboven beschreven en laten groeien van 4 tot 6 uur (of &#39;s nachts indien nodig). </li><li> Controleer of er zygoten onder een lichtmicroscoop. Zygoten zal verschijnen als halter-vormige cellen met of zonder een knop. </li><li> Pick-cellen met een 3mm enting lus (cellen moet ¼ van de loop te dekken) en plaats zachtjes in 100μL van steriele dH 2 O. </li><li> Markeer de boven-en onderkant van het inoculum regio op een YPD plaat. </li><li> Neem 5μL en voorzichtig plaats druppels in een lijn in het inoculum gebied van de pre-gemarkeerde YPD plaat. </li><li> Gebruik een 3mm enting lus om de druppels in een lijn zich heel voorzichtig, terwijl nauwelijks contact maken met de agar. </li><li> Laat de vloeistof te absorberen in de agar. Ga verder naar de dissectie microscoop. </li><li> Focus op een gebied van de plaat waar de helft van het veld bevat cellen en half leeg is. Langzaam breng de naald in beeld zodanig dat het de lege gebied van het veld raakt. Dit zal ervoor zorgen dat de naald geen cellen van een eerder gebruik bevatten. Contact tussen de naald en de agar wordt gezien als een donkere zwarte cirkel die langzaam komt in beeld. </li><li> Ga naar de matrix op positie A1 en maak een merk door het doorboren van de agar opnieuw. Dit is om de oriëntatie van de plaat te bepalen of het wordt genomen uit de microscoop voor de voltooiing. </li><li> Schakel over naar de zoekmodus. Zoek een zygote. </li><li> Pick-up een zygote met de naald. </li><li> Plaats zygoten individueel op de matrix. </li><li> Laat zygoten te groeien voor meerdere dagen. </li><li> Replica bord van de zygoten op het geschikte selectieve voedingsbodem. </li></ol> Representatieve resultaten <img src="/files/ftp_upload/1146/1146fig1.jpg" alt="" /> Figuur 1: De paring van twee haploïde stammen van tegengestelde voortplantingstypes genereert een diploïde stam. <img src="/files/ftp_upload/1146/1146fig2.jpg" alt="" /> Figuur 2: (A) Een YPD plaat met thre de resultaten van een paring tussen een temperatuur gevoelige stam (met een leu2 auxotrofie) en een wild-type stam (LEU2). Verteerd cellen zijn verspreid in de regio inoculum aan de linkerkant waar de dichte groei tussen de twee zwarte lijnen wordt gezien. ASCI die zijn ontleed groeien gelijkmatig in de matrix aan de rechterkant. (B) De plaat (A) werd gerepliceerd op een SD-Leucine drop-out plaat. Let op de 2:02 groei voor de LEU2 marker wijst op een gevalideerd ascospore werd ontleed. (C) De plaat (A) werd gerepliceerd op een YPD plaat en geïncubeerd bij 37 ° C. Let op de 2:02 groei die verder valideert, dat een ascospore werd ontleed.

<ol><li>Sherman, F., Hicks, J. Micromanipulation and Dissection of Asci. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSherman%2C+F+%22Guide+to+Yeast+Genetics+and+Molecular+Biology%22">Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology</a>. Guthrie, C., Fink, G. R. , Academic Press. San Diego. 21-37 (1991).</li>
</ol>

Gist dissectie is een nuttig instrument om nieuwe stammen te selecteren met de gewenste markers. Bij het bepalen van de theoretische groeipatroon van vier ascosporen is het belangrijk om te kijken naar het genotype van het vegetatieve cel. Als er een plasmide aanwezig is, moet men weten of het is single, laag of hoog te kopiëren, omdat dit zal invloed hebben op die ascospore (s) het plasmide ontvangen en zullen van invloed zijn voorspellingen en de conclusies ten aanzien van de stammen wordt gemanipuleerd. <p class=...

<table><tbody><tr><td>Singer MSM System 200</td><td>Microscoop</td><td>Singer Instruments</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>D-sorbitol</td><td>Reagens</td><td>BioShop Canada</td><td>SOR508</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Reagens</td><td>BioShop Canada</td><td>TRS001</td><td></td></tr><tr><td>Zymolyase 100T</td><td>Reagens</td><td>Seikagaku Corporation</td><td>120493</td><td></td></tr><tr><td>Gistextract</td><td>Reagens</td><td>BioShop Canada</td><td>YEX401</td><td></td></tr><tr><td>Peptonen</td><td>Reagens</td><td>BioShop Canada</td><td>PEP 403</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Reagens</td><td>BioShop Canada</td><td>GLU501</td><td></td></tr><tr><td>Yeast nitrogen base</td><td>Reagens</td><td>BioShop Canada</td><td>YNB406</td><td></td></tr><tr><td>Bio-tryptonen</td><td>Reagens</td><td>BioShop Canada</td><td>TRP402</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Reagens</td><td>BioShop Canada</td><td>SOD002</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumacetaat</td><td>Reagens</td><td>BioShop Canada</td><td>POA 301</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Reagens</td><td>BioShop Canada</td><td>AGR003</td><td></td></tr><tr><td>Adeninesulfaat</td><td>Reagens</td><td>BioShop Canada</td><td>ADS201</td><td></td></tr><tr><td>L-uracil</td><td>Reagens</td><td>BioShop Canada</td><td>URA 241</td><td></td></tr><tr><td>L-tryptofaan</td><td>Reagens</td><td>BioShop Canada</td><td>TRP 100</td><td></td></tr><tr><td>L-histidine</td><td>Reagens</td><td>BioShop Canada</td><td>HIS 200</td><td></td></tr><tr><td>L-arginine</td><td>Reagens</td><td>Amresco</td><td>0877-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-methionine</td><td>Reagens</td><td>BioShop Canada</td><td>MET 222</td><td></td></tr><tr><td>L-tyrosine</td><td>Reagens</td><td>BioShop Canada</td><td>TYR 333</td><td></td></tr><tr><td>L-isoleucine</td><td>Reagens</td><td>BioShop Canada</td><td>ISO 910</td><td></td></tr><tr><td>L-valine</td><td>Reagens</td><td>BioShop Canada</td><td>VAL 201</td><td></td></tr><tr><td>L-lysine</td><td>Reagens</td><td>BioShop Canada</td><td>LYS 101</td><td></td></tr><tr><td>L-phenylalanine</td><td>Reagens</td><td>BioShop Canada</td><td>PHA 302</td><td></td></tr><tr><td>L-glutaminezuur</td><td>Reagens</td><td>BioShop Canada</td><td>GLU 202</td><td></td></tr><tr><td>L-threonine</td><td>Reagens</td><td>BioShop Canada</td><td>THR002</td><td></td></tr><tr><td>L-leucine</td><td>Reagens</td><td>BioShop Canada</td><td>LEU 222</td><td></td></tr></tbody></table>

dissectie van saccharomyces cerevisiae asci

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Gist is een zeer soepel model systeem dat wordt gebruikt om veel verschillende cellulaire processen te bestuderen. De gemeenschappelijke stam laboratorium<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Bestaat in ofwel een haploide of diploïde staat. De mogelijkheid om allelen combineren van twee haploiden en de mogelijkheid om wijzigingen aan te brengen van het genoom vergt de productie en de ontleding van ASCI. ASCI productie van haploïde cellen begint met de paring van twee gist haploïde stammen met compatibele voortplantingstypes tot een diploïde stam te produceren. Dit kan worden bereikt op een aantal manieren, hetzij op vast medium of in de vloeistof. Is het voordelig om te kiezen voor de diploïden in medium dat selectief hun groei bevordert ten opzichte van een van de haploïde stammen. De diploïden worden dan toegestaan ​​om sporulate op voedselarme medium om ASCI, een bundel van vier haploïde dochtercellen als gevolg van meiotische reproductie van de diploïde vorm. Een mengsel van vegetatieve cellen en asci wordt vervolgens behandeld met het enzym zymolyase te verteren weg het membraan zak rond de ascosporen van de ASCI. Met behulp van micromanipulatie met een microneedle onder een microscoop een dissectie kan ophalen individuele ASCI en aparte en verplaats de vier ascopores. ASCI ontleed worden gekweekt voor meerdere dagen en getest voor de markers of allelen van een belang door replica uitplaten op geschikte selectieve media.

Micromanipulatie van de gistcellen is nodig voor de meiose genetische analyse of om diploïde zygoten te selecteren. Deze micromanipulations worden uitgevoerd met behulp van de microneedle van een dissectie microscoop. De microneedle wordt gebruikt om de cellen te verplaatsen en wordt gecontroleerd door een micromanipulator die beschikbaar zijn met een verschillende mate van automatisering.

Dissectie van Saccharomyces Cerevisiae Asci

Gist is een zeer hanteerbaar modelsysteem dat wordt gebruikt om vele verschillende cellulaire processen te bestuderen. De gangbare laboratoriumstam Saccharomyces cerevisiae ...

Deze procedure begint met de paring van twee genetisch verschillende haid-gistcellen. Diploiden worden geselecteerd via replica-plating op een medium dat uitsluitend de groei van diploiden toestaat. De diploiden worden vervolgens overgebracht naar sporulatieplaten of asci-vorm.De asci worden gedisseceerd waarbij de haploïden op een bepaalde locatie op de plaat worden geplaatst. Zodra de resulterende haploïden zijn uitgegroeid tot een zichtbare kolonie, wordt de plaat gerepliceerd naar een selectief medium om het genotype van de individuele cellen te identificeren. Hallo, ik ben Adrian Morris.En ik ben Audrey Mahe. Wij komen uit het laboratorium van Dr. Michael Satcher aan de Universiteit Concordia in Montreal. Vandaag laten we u een procedure zien voor de dissectie van gistcellen, die gewoonlijk worden aangeduid als ra.Gebruik deze procedure in ons laboratorium om haploïde D-stammen met nieuwe genotypen te instrueren en om de effecten van het combineren van twee mutaties te bestuderen. Laten we beginnen. Om een diploïde stam te construeren, worden twee haploïde stammen van tegengestelde paringstypen gepaard. De haploïde stammen worden eerst uitgeplaatst op geschikte media, in ons geval YPD, om enkelvoudige kolonies te produceren. Gebruik een steriele inoculatielus om een klein gedeelte van een kolonie van een van de twee haploïde stammen op een nieuwe YPD-plaat over te brengen en strijk de lus uit.Zodra er een rechte lijn over de plaat is getrokken, markeert u de richting van de uitstrijk met een pijl op de onderkant van de plaat. Neem vervolgens een klein gedeelte van een kolonie van de andere haploïde stam op dezelfde YPD-plaat. Strijk de kolonie loodrecht op de eerste stam uit, waarbij de eerste uitstrijk wordt gekruist met de tweede markering, de richting van de tweede uitstrijk.En let op het gebied waar de tweede uitstrijklijn de eerste kruist. In dit gebied zullen de diploïden worden gevormd.Incubeer de YPD-plaat gedurende de nacht bij 30 °C. Replicaat na de nachtelijke incubatie de YPD-plaat op een selectief medium dat specifiek de groei van de nieuw gevormde diploïden toestaat. Incubeer de plaat gedurende de nacht bij 30 °C.Zodra de diploïden op de plaat zijn gegroeid, pik dan indien mogelijk een enkele kolonie, of een klein gedeelte van de diploïde uitstrijk, en strijk dit uit op hetzelfde selectieve medium om enkelvoudige kolonies te genereren. Zodra de diploïde stam is verkregen, worden enkelvoudige kolonies gepikt om kleine patches op sporulatieplaten te maken. Incubeer gedurende drie tot zeven dagen bij 30 °C om sporulatie te induceren.Om de sporulatie te controleren, worden cellen van elke plek onder een lichtmicroscoop bekeken. Plaats de cellen op een objectglas in vijf tot 10 µL water.Plaats een dekglas op de druppel en controleer op de aanwezigheid van asci. Als deze afwezig zijn of niet gemakkelijk worden gevonden, plaats de plaat dan terug in de incubator. Indien er in een van de plekken effectieve sporulatie is, bereid dan een steriele conische buis van 15 milliliter voor met 100 µL tetra-sap.Neem cellen van deze sporulatieplek met een steriele inoculatielus van drie millimeter en plaats deze in het tetradensap. Draai de lus voorzichtig rond om de cellen van de lus te laten vallen en te mengen met de oplossing. Laat de cellen vier tot 10 minuten in het tetradensap staan.Dit maakt de digestie van de celwand rondom de ASCO-sporen mogelijk. Om een plaat voor te bereiden voor de dissectie van asci, markeert u de boven- en onderkant van het inoculatiegebied op een YPD-plaat. Wanneer de cellen voldoende zijn gedigesteerd, neemt u vijf µL van de gedigesteerde cellen en plaatst u met een steriele inoculatielus van drie millimeter voorzichtig druppels in een lijn in het vooraf gemarkeerde inoculatiegebied van de YPD-plaat.Spreid de druppels zeer voorzichtig één tot drie keer in één lijn terwijl u de boor nauwelijks aanraakt. Laat de vloeistof in de boor trekken. U kunt nu beginnen met de dissectie van de asci.Om met de dissectie van de asci te beginnen, plaatst u de dissectieplaat onder de singer MSM system 200 micromanipulatiemicroscoop. Focus op een regio van de plaat waar de helft van het gezichtsveld cellen bevat en de andere helft leeg is. Breng de naald langzaam in focus, zodanig dat deze het lege gedeelte van het gezichtsveld raakt.Het contact tussen de naald en de agar is zichtbaar als een donkerzwarte cirkel die langzaam in focus komt. Nadat de naald de agar heeft geraakt, wordt deze een klein stukje teruggetrokken om te controleren of er geen cellen zijn afgezet in het gebied waar de naald de agar heeft geraakt. Dit garandeert dat de naald geen cellen bevat van een eerder gebruik.Ga naar de matrix op positie A1 en maak een markering door met de boor door te prikken. Opnieuw is dit bedoeld om te helpen bij het bepalen van de oriëntatie van de plaat. Als deze wordt verwijderd, is de dissectie voltooid.Schakel over naar de zoekmodus. Zoek een ascus. De vier ASCUS-sporen van een ASCUS zouden nog aan elkaar verbonden moeten zijn.Twee ASCUS-sporen kunnen iets groter zijn dan de andere twee. Vermijd het kiezen van asci waarbij één ASCA-spoor loszit en niet verbonden is met de rest van de ASCA-sporen. Om een ascus op te pakken, brengt u de naald langzaam naar de plaat toe.Zodra de schaduw van de micronaald zichtbaar is, lijnt u deze uit met de ascus die moet worden opgepikt. Beweeg de naald tot de zwarte omtrek van een cirkel zichtbaar is. Raak de tetrade met deze cirkel aan en trek de naald vervolgens snel terug.Controleer of alle vier de ascospores uit een ascus aan de naald zijn gehecht en dat er geen extra cellen die geen deel uitmaken van deze ascus door de micronaald zijn opgepikt. Zodra de ascus door de micronaald is opgepikt, trekt u de micronaald ver van de plaat af en gaat u naar de matrix. Ga voor de eerste ascus naar positie a1.Plaats de ascus door de plaat met de micronaald aan te raken en deze weg te trekken totdat alle vier de ascussporen van de micronaald loskomen; het voorzichtig tikken tegen de naaldarm of het platform waarop de YPD-plaat rust is in deze stap vaak nuttig.Ga door met het lokaliseren, oppikken en plaatsen van asci op opeenvolgende posities op de matrix totdat het gewenste aantal asci is verkregen. Noteer elke positie waar een ASCUS naar is verplaatst. Wanneer het gewenste aantal asci is opgepikt, keert u terug naar elke ascus en scheidt u de vier cellen door voorzichtig met de naald te manoeuvreren, zachtjes op het platform te tikken of een combinatie van beide.Pak de cellen op en laat er één achter. Verplaats de overige. Verplaats E naar een nieuwe positie in de matrix en herhaal dit totdat elke ask is voltooid.De APO in elke ascus wordt gescheiden in rijen van vier. Eén dissectie van asci is voltooid. Plaats de YPD-plaat in een incubator bij 30 °C gedurende enkele dagen om het groeipatroon te observeren.Zodra de gedissecteerde asci zijn uitgegroeid, worden ze via replica-plating overgezet naar een selectief medium. Indien nodig is dit een plaat die is gereplica-plat en waarbij zowel de oorspronkelijke dissectieplaat als de selectieve plaat een nacht zijn uitgegroeid. De resultaten op de selectieve plaat moeten worden gescoord, waarna de juiste haploïde cel wordt geïdentificeerd en geselecteerd.In gevallen waarin diploïden niet kunnen worden geïdentificeerd op selectieve platen, moet men handmatig gepaarde haploïden selecteren, genaamd zygotes, die in een vroeg stadium na de paring gemakkelijk te identificeren zijn. De procedure voor het prepareren van de haploïde cellen en de paring is identiek aan de reeds beschreven methode, behalve dat het gebied waar de diploïde zich zou moeten bevinden, wordt onderzocht na kortere incubatietijden bij 30 °C. Wij hebben vastgesteld dat vier tot zes uur een goed startpunt is, maar de exacte tijdsduur moet uiteindelijk empirisch worden bepaald.Controleer onder een lichtmicroscoop op de aanwezigheid van zygoten; zygoten verschijnen als haltervormige cellen, met of zonder knop. Neem de cellen op met een inoculatielus van drie millimeter en plaats ze voorzichtig in 100 µL steriel water. Nadat de cellen naar een vooraf gemarkeerde YPD-plaat zijn overgebracht, gebruikt u een inoculatielus van drie millimeter om de druppels zeer voorzichtig in een lijn uit te spreiden, waarbij u de agar nauwelijks aanraakt. Laat de vloeistof in de agar trekken.Ga naar de dissectiemicroscoop. Focus op een gebied van de plaat waarbij de helft van het gezichtsveld cellen bevat en de andere helft leeg is. Breng de naald langzaam in focus, zodat deze het lege gebied van het gezichtsveld raakt.Zoals eerder aangetoond. Controleer of de naald geen cellen bevat van een vorig gebruik. Ga naar de matrix op positie A1 en maak een markering door de boor te doorboren.Om opnieuw te helpen bij het bepalen van de oriëntatie van het plaatje, schakelt u over naar de zoekmodus en lokaliseert u een zygote. Pak de zygote op met de naald.Plaats de zygoten individueel op de matrix. Laat de zygoten enkele dagen groeien. Transfereer de diploïde cellen naar sporulatieplaten en ga verder zoals beschreven in deel drie.De paring van twee haploïde stammen met tegenovergestelde paringstypen genereert een diploïde stam. Deze YPD-plaat toont de resultaten van een paring tussen een temperatuurgevoelige stam met een lu two ox atrofie en een wildtype-stam. De uitgeplaatte stammen zijn verspreid in het inoculumgebied aan de linkerzijde, waar dikke groei tussen de twee zwarte lijnen zichtbaar is.De gedissecteerde asci groeien met gelijke tussenruimtes in de matrix aan de rechterkant. Toen deze YPD-plaat werd gerepliceerd op een SD-leucine-dropoutplaat, zien we een twee-op-twee groei voor de LU2-marker, wat aangeeft dat er een geldige ASCO-spore is gedissecteerd. De oorspronkelijke YPD-plaat werd ook gerepliceerd op een andere YPD-plaat en geïncubeerd bij een hogere temperatuur van 37 °C, waarbij de twee-op-twee groei verder bevestigt dat er een ASCO-spore is gedissecteerd.We hebben zojuist laten zien hoe u twee haid-cellen maakt en selecteert op diploiden. Dit is gebaseerd op twee verschillende methoden: één maakt gebruik van tropische markers en de andere is gebaseerd op celmorfologie. Bij het gebruik van deze procedure is het zeer belangrijk om te onthouden de nieuw geconstrueerde haid-cellen te selecteren via een tetra-dissectie, waarbij de atrofische markers worden weergegeven zoals voorspeld.Het is ook belangrijk om eraan te denken niet te veel of te weinig te verteren. De tetra-asci vielen uit elkaar wanneer ze overmatig waren verteerd, terwijl ze juist moeilijk te scheiden waren in tetraden bij een onvoldoende vertering. Dat is alles.Veel succes met uw experimenten.

dissection-of-saccharomyces-cerevisiae-asci

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Beschrijven we een kwalitatieve analyse voor gist hechting en agar invasie als een maat voor invasieve en pseudohyfale differentiatie. Deze eenvoudige test kan gebruikt worden om de invasieve fenotype van verschillende mutanten, alsmede de effecten omgevingsfactoren te beoordelen en signaalwegen op gist differentiatie.

Test voor Adhesie en Agar invasie in S. cerevisiae

De studie van de ontwikkelingsprocessen van de ascosporen in Gibberella zeae, een procedure voor de collectie onder steriele omstandigheden wordt gefilmd om het hoogste niveau van informatie voor protocol beschrijving te genereren. Dit moet de reproduceerbaarheid van het experiment, een cruciaal aspect bij het volledige genoom expressie profiel testen worden uitgevoerd.

Gibberella zeae Ascospore Productie en collectie voor microarray experimenten.

Een methode voor het inbedden gistkolonies waardoor snijden voor licht-en elektronenmicroscopie. Dit protocol maakt de bepaling van de verdeling van gesporuleerde cellen en pseudohyfale cellen in kolonies die een nieuwe tool in de richting van het begrijpen van de organisatie van de celtypen in een schimmel gemeenschap.

Gist Colony integratiemethode

Microarray analyse voor Saccharomyces cerevisiae</em

Seksuele kruisen en isolatie van recombinante nakomelingen zijn belangrijke onderzoeksinstrumenten voor de filamenteuze...

Seksuele ontwikkeling en Ascospore Lozing in Fusarium graminearum</em

We presenteren een protocol voor het invriezen en cryosectioning gist gemeenschappen om interne patronen van fluorescerende cellen te observeren. De methode is gebaseerd op methanol-fixing en OCT-inbedding van de ruimtelijke verdeling van cellen te behouden zonder het inactiveren van fluorescerende eiwitten binnen een gemeenschap.

Cryosectioning Gist Gemeenschappen is voor de behandeling Fluorescentie Patterns

Er wordt een methode gepresenteerd voor het oppervlaktespreiden van chromosomen uit knoppende gist. Deze methode is afgeleid van een methode die eerder werd beschreven door Loidl en Klein. Bovendien demonstreren we een procedure voor immunokleuring van gespreide chromosomen.

Surface Het verspreiden en Immunokleuring van Gist Chromosomen

Hier presenteren we gedetailleerde verwerkingsprotocollen voor Imaging delicate weefselmonsters met behulp van scanning elektronenmicroscopie (SEM). Drie verschillende verwerkingsmethoden, namelijk hexamethyl disilazana (HMDS) chemisch drogen, eenvoudige lucht drogen en het drogen van kritische punten worden beschreven voor het bereiden van stijve eierschalen, embryo's in vroege ontwikkelingsstadia en schimmel culturen respectievelijk.

Verwerking van embryo-, eierschaal-en schimmel cultuur voor het scannen van elektronenmicroscopie

We presenteren een protocol voor lamellenpreparaat van diepgevroren biologische monsters door cryo-gerichte ionenbundelmicromachining voor structurele studies met hoge resolutie van macromoleculen in situ met cryo-elektronentomografie. Het gepresenteerde protocol biedt richtlijnen voor de bereiding van hoogwaardige lamellen met een hoge reproduceerbaarheid voor structurele karakterisering van macromoleculen in de Saccharomyces cerevisiae.

Bereiding en Cryo-FIB microbewerking van Saccharomyces cerevisiae voor Cryo-Elektronen Tomografie

Deze studie beschrijft hoe de endolymfatische zak op verschillende leeftijden uit het binnenoor van de muis kan worden ontleed. Het resultaat van een soortgelijke dissectie wordt getoond in een Slc26a4-null muismodel van vergroting van de endolymfatische zak. Een transgene muis met een fluorescerende reporter uitgedrukt in de endolymfatische zak wordt gepresenteerd als een model om de endolymfatische zak gemakkelijk te visualiseren en een educatief hulpmiddel.

Dissectie van de endolymfatische zak van muizen

Dit protocol is een effectieve, snelle methode om gisten en de schimmel Aspergillus fumigatus uit grote sets bodemmonsters te kweken in slechts 7 dagen. De methoden kunnen eenvoudig worden aangepast om een reeks incubatiemedia en temperaturen te accommoderen als dat nodig is voor experimenten.

Isolatie van kweekbare gisten en schimmels uit bodems om de structuur van schimmelpopulaties te onderzoeken

Leer micromanipulatietechnieken voor gistcellen om meiotische genetische analyse uit te voeren met Saccharomyces cerevisiae. Deze methode helpt onderzoekers bij de selectie van diploïde zygoten.

Dissectie van Saccharomyces Cerevisiae Asci

Meer video's verkennen