Name: Het meten van Caenorhabditis elegans Levensduur over Solid Media (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-12T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: Leer een betrouwbare methode om de levensduur van Caenorhabditis elegans te meten op vast medium met UV-gedode bacteriën als voedselbron.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<p class="jove_content"> Dit werk werd ondersteund door een Glenn / verre Doorbraken in Gerontologie Award en NIH Grant 1R01AG031108-01 naar MKGS wordt ondersteund door NIH training te verlenen P30AG013280. MK is een Ellison Medical Foundation New Scholar in Aging. </p>

<p class="jove_title"> Deel 1: Bereid nematode groei media (NGM) platen </p><p class="jove_content"> Deze paragraaf beschrijft de bereiding van het vaste NGM platen voor gebruik in de levensduur experiment. Een basis levensduur experiment zijn twee types van platen: standaard NGM platen, die geen additieven, en Amp / FUDR platen, die zowel ampicilline (Amp) en fluorodeoxyuridine (FUDR) toegevoegd aan de NGM hebben bevatten. Ampicilline wordt gebruikt om buitenlandse bacteriële besmetting te voorkomen. FUDR remt de celdeling, vermindert de productie van eieren, en voorkomt dat eieren van uitkomen. Het gebruik van FUDR voor een lange levensduur analyse heeft geen invloed op volwassen levensduur en verwijdert de noodzaak om de wormen overdragen om de paar dagen om ze te scheiden van groeiende larve. Beide types van platen zijn bezaaid met <em>E. coli</em> OP50 bacteriën, die vervolgens wordt gedood door blootstelling aan UV. </p><ol><li> Bereid NGM (zie hoofdstuk 5 voor recept en opslag noten) en label petri platen. U moet een 60 mm petri plaat per 10 ml NGM. Als je begint met de eerder bereid solide NGM, blijven 1,2 stap. Als u begint met vers geautoclaveerd NGM, ga dan naar stap 1.4. </li><li> Volledig smelten solide NGM door de magnetron op hoog in de 30 seconden pulsen. Swirl media tussen de pulsen te druk gasbellen te voorkomen dat de opbouw. </li><li> Plaats vloeistof NGM in 55 ° C water bad of op de bank om af te koelen. </li><li> Zodra NGM bereikt 55 ° C toe te voegen 33 pi van 150 mm FUDR en 100 pi van 100 mg / ml ampicilline per 100 ml NGM (voor Amp / FUDR platen) en zwenk om te mengen. Voor NGM platen zonder extra medicijnen gaan rechtstreeks naar 1,5 stap. </li><li> Met behulp van steriele techniek, pipet 10 mL NGM in elkaar 60 mm petri-plaat. Vermijd de vorming van luchtbellen indien mogelijk. Als luchtbellen vormen wel, kunnen ze worden geknald met behulp van een pipet tip. </li><li> Laat platen op de bank met de deksels op om NGM stollen en droog. Indien mogelijk, laat platen bank voor 2 dagen voor het toevoegen van bacteriën, maar 1 dag zal werken als platen zijn eerder nodig zijn. </li><li> Op de dag voordat de platen af te drogen, zaad vloeibaar LB cultuur met een enkele kolonie vanuit een nieuw streak van <em>E. coli</em> bacterie OP50 op LB-agar. U moet zich voorbereiden op zijn minst 1 mL van een overnachting OP50 cultuur per 60 mm plaat. </li><li> Plaats OP50 cultuur in 37 ° C mogelijk maakt shaker en bacteriën om te groeien &#39;s nachts (cultuur moet komen verzadiging). </li><li> Pellet OP50 bacteriën door het draaien bij 3.500 g gedurende 10 minuten. </li><li> Verwijder 90% van de supernatant en resuspendeer bacteriën om zich te concentreren cultuur 10x. </li><li> Pipetteer 100 ul van 10x geconcentreerde OP50 cultuur in het centrum van gestolde NGM platen. Swirl platen voorzichtig te spreiden bacteriën cultuur als dat nodig is (idealiter bacteriën moeten het centrale gebied van de NGM te dekken zonder dat de buurt van de plaat wanden). Probeer te vermijden dat het aanraken van de pipet tip om het oppervlak van de NGM, zoals gebreken in het oppervlak van de media zodat de wormen te graven in de NGM. </li><li> Laat platen op de bank &#39;s nachts, zodat bacteriën cultuur te drogen op de vaste NGM (meestal duurt ongeveer 24 uur). </li><li> Eenmaal droog, bloot het oppervlak van de platen om een ​​UV-dosis voldoende is om de groei van de bacteriën te arresteren. Als u gebruik maakt van een Stratagene UV Stratalinker 2400: <ul><li> Plaats platen in de Stratalinker en verwijder de deksels </li><li> Sluit de deur en zet de Stratalinker </li><li> Druk op &#39;Energie&#39; </li><li> Geef &#39;9999 &#39;met behulp van het toetsenbord </li><li> Druk op &#39;Start&#39; </li><li> De platen zullen worden blootgesteld aan UV voor ongeveer 5 minuten </li></ul></li><li> Platen met UV-gedode bacteriën kunnen ondersteboven worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende maximaal 1 maand. </li></ol><p class="jove_title"> Deel 2: Voer een getimede eileg tot een leeftijd-gesynchroniseerde populatie van de dieren te verwerven </p><p class="jove_content"> In deze paragraaf geven we het genereren van een populatie van wormen met een gemeenschappelijke luik-date is. Dit wordt bereikt door te Reproductief actieve volwassenen om eieren te leggen op een bord voor een bepaalde periode van tijd en waardoor die eieren te ontwikkelen. </p><ol><li> (Optioneel) Breng circa 20 jonge volwassen wormen om een ​​frisse NGM plaat zonder FUDR. Laat platen bij 25 ° C, zodat de wormen te verspreiden en te eten door alle van de bacteriële voedsel. Nadat de bacteriën voedsel is geconsumeerd pas uitgekomen wormen zullen in de groei gearresteerd Dauer podium. Je zult om te Dauer larve zien rond te starten binnen een week, afhankelijk van het aantal wormen u in eerste instantie over te dragen aan de plaat. Dauer larve kan gebruikt worden voor de volgende stappen voor maximaal 1 maand. </li><li> (Optioneel) Transfer 20 tot 30 Dauer larve een nieuwe NGM plaat zonder FUDR. In de aanwezigheid van voedsel Dauer larve zal Reproductief actieve volwassenen worden binnen 2 dagen en blijven voor de voortplanting actief voor een paar dagen daarna bij 25 ° C. </li><li> Overdracht 10-15 Reproductief actieve volwassenen een nieuwe NGM plaat zonder FUDR. Deze plaat wordt aangeduid als de getimede eileg (TEL) plaat. </li><li> Laat de TEL plaat bij 25 ° C gedurende 6 uur, om t makenhij wormen tijd om eieren te leggen. </li><li> Verwijder de volwassen wormen uit TEL plaat. Plaat kunnen visueel worden geïnspecteerd voor eieren voordat u volwassenen. Als de wormen nog niet gelegd een voldoende aantal eieren die de TEL plaat kan worden achtergelaten bij 25 ° C tot een totaal van 24 uur voor het verwijderen van volwassen wormen. </li><li> Plaats TEL plaat bij 20 ° C tot de eieren zijn uitgekomen en de wormen hebben ontwikkeld om de L4 larvale stadium (in het algemeen 2 dagen voor wild-type C. elegans, maar kan langer duren voor de stammen met langzame ontwikkeling fenotypes). </li></ol><p class="jove_title"> Deel 3: Score dieren voor de levensduur </p><p class="jove_content"> In deze paragraaf volgen we de leeftijd-gesynchroniseerde bevolking van wormen uit deel 2 tot ze sterven. Wormen zijn bijgehouden op Amp / FUDR platen ei-productie en bacteriële besmetting te voorkomen en worden geacht dood als ze niet reageren op prikkels van buitenaf. </p><ol><li> Overdracht L4 larve tot gezaaid Amp / FUDR platen. Voor iedere stam of conditie worden getest, is het typisch op te zetten 2-3 borden met 25-30 wormen per plaat. Beelden van de <em>C. elegans</em> levensfasen zijn bedoeld voor referentie (Figuur 1) <sup>1.</sup> </li><li> Plaats Amp / FUDR platen bij 20 ° C gedurende 24 uur. </li><li> Na 24 uur, visueel te beoordelen wormen, media, en bacteriën. Overdracht wormen in de frisse Amp / FUDR platen als een van de volgende wordt waargenomen: <ul><li> Wormen hebben gegeten het grootste deel van de bacteriële voedsel. Vroeg in de levensduur van wormen experiment zal moeten worden overgebracht 1 tot 2 keer een week om de bacteriën te voorkomen dat uitgeput. </li><li> Een groot aantal van de larven aanwezig zijn. Dit is meestal een indicatie dat de wormen werden overgebracht naar de Amp / FUDR platen als jonge volwassenen in plaats van L4S en waren in staat om enkele eieren te leggen voordat de FUDR van kracht werd. De FUDR zal de larven in het algemeen te voorkomen groeien in volle volwassenen, maar af en toe een paar zal uitgroeien tot volwassenen en worden verward met de proefdieren. </li><li> Live / groeiende bacteriën worden waargenomen. In het algemeen zal de combinatie van Amp-en UV-doden ervoor te zorgen dat er geen levende bacteriën het experiment worden besmet, maar af en toe het zich voordoet. </li><li> Schimmelgroei is waargenomen op de media. Als vroeg genoeg bij bent, kan schimmelgroei meestal worden gesneden met behulp van een pipet tip of spatel. Als het eenmaal groeit groter te zijn dan een paar millimeter in diameter is het meestal makkelijker om de wormen te dragen aan een nieuwe plaat. </li><li> Met behulp van de dissectie bereik, bepalen of elke worm is levend of dood. </li><li> Tik voorzichtig de plaat. De worm is levend als het beweegt in reactie op de tikken. </li><li> Als de worm niet reageert op het aanboren van de plaat, zoom in op het hoofd regio. </li><li> Tik voorzichtig de worm het hoofd met platina overdracht te plukken. De score van de worm als dood als het niet reageert door het bewegen van zijn hoofd. </li><li> Dode wormen kunnen worden verwijderd uit de plaat. </li></ul></li><li> Noteer de datum en het aantal wormen die zijn levend en dood. </li><li> Keer terug platen tot 20 ° C. </li><li> Herhaal stap 3.3 tot 3.6 om de 2 tot 3 dagen totdat alle wormen zijn gestorven. </li></ol><p class="jove_title"> Deel 4: Representatieve resultaten. </p><p class="jove_content"> De ruwe gegevens die door een nematode levensduur experiment is een lijst van data met de bijbehorende aantallen wormen die nog in leven en dood voor elk getest stam. Het aantal wormen die sterven op elke dag is meestal omgekeerd om het aandeel van de wormen leven op elke dag (Figuur 2A), die grafisch wordt uitgezet als een survival curve (Figuur 2B te berekenen; de dag van de getimede eileg wordt beschouwd als dag 0 ). De levensduur voor elke individuele worm in de studie kan worden berekend op basis van de telling van de wormen die sterven op elke dag en gebruikt voor het gemiddelde en mediane levensduur te berekenen voor vergelijking tussen de stammen. De telling van het aantal wormen in leven op elke dag wordt niet direct gebruikt in de levensduur analyse. Worms onderhouden op vaste media zal zo nu en &#39;vluchten&#39;, of kruipen of op de muur van de plaat of naar beneden onder de media. Het aantal wormen leven op elke dag gebruikt kan worden om te bepalen hoeveel wormen gevlucht in de loop van het experiment. Wormen die vluchten worden meestal verwijderd uit de analyse. Als benchmark, de typische gemiddelde levensduur van N2, de <em>C. elegans</em> wild-type stam, gehouden op UV-gedode bacteriën bij 20 ° C is ongeveer 25 dagen gemeten vanaf ei. </p><p class="jove_title"> Deel 5: Oplossingen </p><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>Nematoden Groei Media (NGM), 100 ml:</strong> </td></tr><tr><td colspan="2"> Te combineren: </td></tr><tr><td> 0,3 g </td><td> NaCl </td></tr><tr><td> 0,25 g </td><td> Pepton </td></tr><tr><td> 2 g </td><td> Agar-agar </td></tr><tr><td colspan="2"> <strong>Autoclaaf gedurende 40 minuten en laat afkoelen tot 55 ° C, dan toevoegen:</strong> </td></tr><tr><td> 100 ul </td><td> 1 M MgSO <sub>4</sub> </td></tr><tr><td> 100 ul </td><td> 5 mg / ml Cholesterol </td></tr><tr><td> 100 ul </td><td> 1 M CaCl<sub>2</sub> </td></tr><tr><td> 1,625 mL </td><td> 1,5 M KPI pH 6,0 </td></tr><tr><td colspan="2"> Vloeistof NGM kan onmiddellijk worden gebruikt om de platen gieten of de gelegenheid te stollen en opgeslagen op lange termijn bij kamertemperatuur </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>Luria Broth (LB), 1L:</strong> </td></tr><tr><td> 10 g </td><td> BactoTryptone </td></tr><tr><td> 5 g </td><td> Gist Extract </td></tr><tr><td> 10 g </td><td> NaCl </td></tr><tr><td> 10 ml </td><td> 1 M Tris pH 8,0 </td></tr><tr><td> Een L </td><td> gedeïoniseerd water </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclaaf en bewaren bij kamertemperatuur. </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>1 M MgSO <sub>4,</sub> 300 ml:</strong> </td></tr><tr><td> 73,95 g </td><td> MgSO <sub>4</sub> </td></tr><tr><td> 300 ml </td><td> gedeïoniseerd water </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclaaf en bewaren bij kamertemperatuur. </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>5 mg / ml Cholesterol, 200 ml:</strong> </td></tr><tr><td> 1 g </td><td> cholesterol </td></tr><tr><td> 200 ml </td><td> 100% ethanol </td></tr><tr><td colspan="2"> Filter steriliseer en bewaar bij kamertemperatuur. </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>1 M CaCl <sub>2,</sub> 500 ml:</strong> </td></tr><tr><td> 27,75 g </td><td> CaCl <sub>2</sub> </td></tr><tr><td> 500 ml </td><td> gedeïoniseerd water </td></tr><tr><td colspan="2"> Filter steriliseer en bewaar bij kamertemperatuur. </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>1,5 M KPI pH 6,0, 1L:</strong> </td></tr><tr><td colspan="2"> Te combineren: </td></tr><tr><td> 31,4 g </td><td> KPI dibasisch </td></tr><tr><td> 179,6 g </td><td> KPI monobasisch </td></tr><tr><td> 850 ml </td><td> gedeïoniseerd water </td></tr><tr><td colspan="2"> Warmte tijdens het mengen, zodat KPI op te lossen in oplossing. Pas de pH op 6.0 met 10 N NaOH. </td></tr><tr><td colspan="2"> Voeg gedeïoniseerd water tot 1 L. </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclaaf en bewaren bij kamertemperatuur. </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>1 M Tris, pH 8,0:</strong> </td></tr><tr><td> 60,57 g </td><td> Tris </td></tr><tr><td> 400 ml </td><td> gedeïoniseerd water </td></tr><tr><td colspan="2"> Pas de pH op 8.0 met HCl. </td></tr><tr><td colspan="2"> Voeg gedeïoniseerd water tot 500 ml. </td></tr><tr><td colspan="2"> Filter steriliseer en bewaar bij kamertemperatuur. </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>150 mM Fluorodeoxyuridine (FUDR), 10 ml:</strong> </td></tr><tr><td> 0,3693 g </td><td> FUDR </td></tr><tr><td> 10 ml </td><td> steriel gedemineraliseerd water </td></tr><tr><td colspan="2"> Bewaren bij -20 ° C. </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>100 mg / ml ampicilline (Amp), 10 ml:</strong> </td></tr><tr><td> 1 g </td><td> Ampicilline </td></tr><tr><td> 10 ml </td><td> steriel gedemineraliseerd water </td></tr><tr><td colspan="2"> Bewaren bij -20 ° C. </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>50 mg / ml carbenicilline (Carb), 10 ml:</strong> </td></tr><tr><td> 500 mg </td><td> Carbenicilline </td></tr><tr><td> 10 ml </td><td> steriel gedemineraliseerd water </td></tr><tr><td colspan="2"> Bewaren bij -20 ° C. </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> <strong>1 M Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG), 10 ml:</strong> </td></tr><tr><td> 2,38 g </td><td> IPTG </td></tr><tr><td> 10 ml </td><td> steriel gedemineraliseerd water </td></tr><tr><td colspan="2"> Bewaren bij -20 ° C. </td></tr></tbody></table><p class="jove_content"><img src="/files/ftp_upload/1152/Figure%201.png" alt="figuur 1" /><br /> <strong>Figuur 1.</strong> Bright gebied beelden van <em>C. elegans</em> levensfasen, zoals ei, de vier larvale stadia (L1 - L4), en volwassen. Alle panelen tonen hermafrodieten, behalve de lagere-rechts, dat een volwassen man (Afbeelding van Wood (1988)) laat zien. </p><p class="jove_content"><img src="/files/ftp_upload/1152/Figure%202.png" alt="figuur 2" /><br /> <strong>Figuur 2.</strong> Representatieve resultaten van een <em>C. elegans</em> levensduur experiment vergelijken van wild-type stam N2 naar een stam met een mutatie in het <em>daf-2-gen.</em> (A) Een tabel met verzamelde gegevens, waaronder het aantal dagen sinds wormen waren eieren, het aantal dode wormen waargenomen op elke dag, en het percentage van het oorspronkelijke monster nog in leven op elke dag (zoals berekend uit de dagelijkse tellingen van dode wormen) . (B) Survival curves die overeenkomt met de levensduur gegevens in (A). </p><p class="jove_content"><imgsrc = &quot;/ files/ftp_upload/1152/Figure 3.jpg&quot; alt = &quot;figuur 3&quot; /&gt; <br /> <strong>Figuur 3.</strong> Vertegenwoordiger vergelijking van de lipofuscine tussen jong en oud volwassen <em>C. elegans.</em> Helderveld beelden worden getoond op de linker-en DAPI kanaal fluorescentie beelden aan de rechterkant. Top panelen tonen een vier dagen oude worm-en onderzijde panelen tonen een 11 dagen oude worm (zoals gemeten uit eieren). </p>

<ol><li>Wood, W. B. <em><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWood%2C+WB+%22The+Nematode+Caenorhabditis+elegans%22">The Nematode Caenorhabditis elegans</a></em>. Wood, W. B. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 1-16 (1988).</li>
<li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+restriction+by+bacterial+deprivation+increases+life+span+in+wild-derived+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Dietary restriction by bacterial deprivation increases life span in wild-derived nematodes.</a> <em>Exp Gerontol</em>. <strong>43</strong>, 130-135 (2008).</li>
<li>Garigan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+tissue+aging+in+Caenorhabditis+elegans%3A+a+role+for+heat-shock+factor+and+bacterial+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: a role for heat-shock factor and bacterial proliferation.</a> <em>Genetics</em>. <strong>161</strong>, 1101-1112 (2002).</li>
<li>Chen, D., Pan, K. Z., Palter, J. E., Kapahi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longevity+determined+by+developmental+arrest+genes+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Longevity determined by developmental arrest genes in Caenorhabditis elegans.</a> <em>Aging Cell</em>. <strong>6</strong>, 525-523 (2007).</li>
<li>Curran, S. P., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifespan+regulation+by+evolutionarily+conserved+genes+essential+for+viability%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Lifespan regulation by evolutionarily conserved genes essential for viability.</a> <em>PLoS Genet</em>. <strong>3</strong>, e56-e56 (2007).</li>
<li>Dillin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rates+of+behavior+and+aging+specified+by+mitochondrial+function+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rates of behavior and aging specified by mitochondrial function during development.</a> <em>Science</em>. <strong>298</strong>, 2398-2401 (2002).</li>
<li>Hamilton, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+RNAi+screen+for+longevity+genes+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A systematic RNAi screen for longevity genes in C. elegans.</a> <em>Genes Dev</em>. <strong>19</strong>, 1544-1555 (2005).</li>
<li>Hansen, M., Hsu, A. L., Dillin, A., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+genes+tied+to+endocrine%2C+metabolic%2C+and+dietary+regulation+of+lifespan+from+a+Caenorhabditis+elegans+genomic+RNAi+screen%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">New genes tied to endocrine, metabolic, and dietary regulation of lifespan from a Caenorhabditis elegans genomic RNAi screen.</a> <em>PLoS Genet</em>. <strong>1</strong>, 119-128 (2005).</li>
<li>Lee, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+RNAi+screen+identifies+a+critical+role+for+mitochondria+in+C.+elegans+longevity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity.</a> <em>Nat Genet</em>. <strong>33</strong>, 40-48 (2003).</li>
<li>Smith, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-+and+calorie-independent+life+span+extension+from+dietary+restriction+by+bacterial+deprivation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Age- and calorie-independent life span extension from dietary restriction by bacterial deprivation in Caenorhabditis elegans.</a> <em>BMC Dev Biol</em>. <strong>8</strong>, 49-49 (2008).</li>
<li>Hodgkin, J., Horvitz, H. R., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nondisjunction+Mutants+of+the+Nematode+CAENORHABDITIS+ELEGANS%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Nondisjunction Mutants of the Nematode CAENORHABDITIS ELEGANS.</a> <em>Genetics</em>. <strong>91</strong>, 67-94 (1979).</li>
<li>Emmons, S. W., Sternberg, P. W. <em>C. ELEGANS II</em>. Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Springs Harbor, NY. (1997).</li>
<li>Lipton, J., Kleemann, G., Ghosh, R., Lints, R., Emmons, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mate+searching+in+Caenorhabditis+elegans%3A+a+genetic+model+for+sex+drive+in+a+simple+invertebrate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mate searching in Caenorhabditis elegans: a genetic model for sex drive in a simple invertebrate.</a> <em>J Neurosci</em>. <strong>24</strong>, 7427-7434 (2004).</li>
<li>Davis, B. O., Anderson, G. L., Dusenbery, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+luminescence+spectroscopy+of+fluorescence+changes+during+aging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Total luminescence spectroscopy of fluorescence changes during aging in Caenorhabditis elegans.</a> <em>Biochemistry</em>. <strong>21</strong>, 4089-4095 (1982).</li>
<li>Klass, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+major+biological+and+environmental+factors+influencing+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span.</a> <em>Mech Ageing Dev</em>. <strong>6</strong>, 413-429 (1977).</li>
<li>Steinkraus, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+restriction+suppresses+proteotoxicity+and+enhances+longevity+by+an+hsf-1-dependent+mechanism+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Dietary restriction suppresses proteotoxicity and enhances longevity by an hsf-1-dependent mechanism in Caenorhabditis elegans.</a> <em>Aging Cell</em>. <strong>7</strong>, 394-404 (2008).</li>
</ol>

<p class="jove_content"> De genetische controle van de levensduur is uitgebreid onderzocht in <em>C. elegans,</em> grotendeels te danken aan het gemak en de snelheid waarmee levensduur kan worden vastgesteld. Het protocol besproken in dit artikel beschrijft een raamwerk voor het verkrijgen van reproduceerbare levensduur gegevens in <em>C. elegans</em> en kan ook worden toegepast op relatednematode soorten. <sup>2</sup> Door het maken van een aantal eenvoudige aanpassingen van deze procedures kunnen worden aangepast aan de levensduur te meten on...

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Reagens</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0145-17-0 (214530)</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td>Reagens</td><td>MidSci</td><td>0339</td><td></td></tr><tr><td>BactoTryptone</td><td>Reagens</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0123-17-3 (211705)</td><td></td></tr><tr><td>BactoPeptone</td><td>Reagens</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0118-17-0 (211677)</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Reagens</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9699248 (1332-01)</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicilline</td><td>Reagens</td><td>Gold Biotechnology</td><td>C0109</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C75209</td><td></td></tr><tr><td>Fluorodeoxyuridine (FUDR)</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl &amp;#946;-d-thiogalactopyranoside (IPTG)</td><td>Reagens</td><td>Gold Biotechnology</td><td>I2481C5</td><td></td></tr><tr><td>KPi dibasisch</td><td>Reagens</td><td>Fisher Scientific</td><td>5087862 (3252-01)</td><td></td></tr><tr><td>KPi monobasisch</td><td>Reagens</td><td>Fisher Scientific</td><td>5087861 (3246-01)</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Reagens</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9561800 (2500-01)</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Reagens</td><td>Fisher Scientific</td><td>S251</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Gistextract</td><td>Reagens</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0886-17-0 (288620)</td><td></td></tr></tbody></table>

het meten van<em> caenorhabditis elegans</em> levensduur over solid media

Measuring <em>Caenorhabditis elegans</em> Life Span on Solid Media

<p class="jove_content">Veroudering is een degeneratieve proces wordt gekenmerkt door een progressieve verslechtering van de cellulaire componenten en organellen resulterend in sterfte. De nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Heeft zich ontpopt als een van de belangrijkste model dat wordt gebruikt om de biologie van veroudering te bestuderen. Omdat vrijwel alle biologische subsysteem ondergaat functionele achteruitgang met de leeftijd, de levensduur is het primaire eindpunt van belang bij het overwegen van totale tarief van de vergrijzing. In nematoden, is de levensduur meestal gedefinieerd als het aantal dagen dat een dierlijke resten reageren op prikkels van buitenaf. Aaltjes kan worden gepropageerd in vloeibare media of op vaste media in platen, en technieken zijn ontwikkeld voor het meten van de levensduur onder beide omstandigheden. Hier presenteren wij een algemeen protocol voor het meten van de levensduur van nematoden gehouden op vaste nematode groei media en gevoed met een dieet van UV-gedode bacteriën. Deze procedures kunnen eenvoudig worden aangepast aan de test levensduur onder verschillende voorkomende aandoeningen, waaronder een dieet bestaande uit levende bacteriën, calorische restrictie, en RNA-interferentie.</p>

<p class="jove_content">In dit artikel geven we een algemeen protocol voor het meten van de levensduur van nematoden gehouden op vaste media met UV-gedode bacteriën voedsel.</p>

Het meten van<em> Caenorhabditis elegans</em> Levensduur over Solid Media

Veroudering is een degeneratief proces dat wordt gekenmerkt door een progressieve verslechtering van cellulaire componenten en organellen, wat uiteindelijk leidt tot sterfte. De nematode ...

<p>Om de levensduur in C. elegans te meten, wordt een leeftijdgesynchroniseerde populatie gegenereerd door middel van een tijdgebonden ei-legging. Actieve volwassen hermafrodiete wormen worden overgebracht naar nematode growth media (NGM)-platen gezaaid met UV-gedode E. coli, waarbij ze zes tot acht uur lang eieren mogen leggen waarna ze worden verwijderd. Gedurende de volgende twee dagen komen de wormen uit deze eieren en groeien ze naar het L4-larvale stadium. De L4-wormen worden overgebracht naar nieuwe NGM-platen die ampicilline bevatten om levende bacteriële contaminatie te voorkomen en FUDR om reproductie te voorkomen, waarna ze zich mogen ontwikkelen tot volwassenen.</p><p>Vanaf dit punt worden de volwassen wormen elke twee tot drie dagen geobserveerd totdat alle wormen zijn gestorven. Op elk tijdstip worden de dode wormen van de plaat verwijderd en wordt het aantal levende en dode wormen geregistreerd. Ik ben George Seton van het laboratorium van Matt Capline van de afdeling Pathologie aan de University of Washington.</p><p>Vandaag laten we u zien hoe u de levensduur meet en kijken we naar onze hepatitis elegance. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de genetica van verouderin</p>

measuring-caenorhabditis-elegans-life-span-on-solid-media

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In dit protocol presenteren we een methode om te...

Het meten van<em> Caenorhabditis elegans</em> Levensduur in 96 Well microtiterplaten

Deze video beschrijft een traditionele, op platen gebaseerde methode om de levensduur van C. elegans te meten. Het voorbeeldprotocol meet de levensduur van wormen die met RNAi worden behandeld.

Levensduuranalyse: Het meten van de levensduur van <em>C. elegans</em>

Een ei-in-worm (EIW) test is een handige methode om eierleggende gedrag te kwantificeren. Veranderingen in eileg kan een gedragsmatige reactie van het modelorganisme...

Het meten van de effecten van bacteriën op<em&gt; C. Elegans</em&gt; Gedrag Met behulp van een Ei Retention Assay

Hier beschrijven we protocollen die specifiek zijn ontworpen om morfogenetische defecten te monitoren die optreden tijdens de vroege en late fasen van embryonale verlenging van de rondworm Caenorhabditis elegans. Uiteindelijk zijn deze protocollen ontworpen om genen te identificeren die deze fasen reguleren en om hun differentiële vereisten langs de antero-posterior as van het embryo te karakteriseren.

Novel Metrics te karakteriseren Embryonale Verlenging van de nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Hier presenteren we een kader hebben betrekking op breed scala dieet beperking genexpressie en levensduur. We beschrijven de protocollen voor breed scala dieet beperking en voor kwantitatieve beeldvorming van genexpressie onder dit paradigma. We schetsen verder computationele analyses te onthullen de functies van information processing van de genetische circuits onderliggende betrokken bij voedsel-sensing.

Kwantificering van informatie gecodeerd door Gene Expression niveaus tijdens levensduur modulatie onder breed-scala dieet beperking in <em>C. elegans</em>

Hier beschrijven we de replicaset methode, een benadering tot kwantitatief maatregel C. elegans levensduur/overleving en de healthspan in een high-throughput en robuuste manier, waardoor screening van vele voorwaarden zonder in te boeten op kwaliteit van de gegevens. Dit protocol details van de strategie en biedt een software-instrument voor de analyse van gegevens van de replicaset.

De Replica Set, methode: Een High-throughput benadering van kwantitatief maatregel <em>Caenorhabditis elegans</em> levensduur

Caenorhabditis elegans dienen als een uitstekend modelsysteem met robuuste en goedkope methoden voor het onderzoeken van de gezondheid, levensduur en veerkracht tegen stress.

Onderzoek naar goedkope methoden om levensduur en gezondheid te <em>meten in Caenorhabditis elegans</em>

Hier wordt een geoptimaliseerd protocol gepresenteerd voor het kweken van geïsoleerde individuele nematoden op vaste media in microgefabriceerde multi-well-apparaten. Met deze aanpak kunnen individuele dieren gedurende hun hele leven worden gevolgd op een verscheidenheid aan fenotypen die verband houden met veroudering en gezondheid, waaronder activiteit, lichaamsgrootte en -vorm, bewegingsgeometrie en overleving.

Langetermijnkweek en monitoring van geïsoleerde <em>Caenorhabditis elegans</em> op vaste media in multiwell-apparaten

Hier presenteren we een protocol om geïsoleerde individuele nematoden op vaste media te kweken voor levenslange fysiologische parametertracking en fluorescentiekwantificering. Dit kweeksysteem omvat een palmitinezuurbarrière rond putten met één worm om te voorkomen dat dieren vluchten, waardoor aversieve interventies mogelijk zijn, waaronder pathogene bacteriën en chemische stressoren.

Langetermijnkweek van individuele <em>Caenorhabditis elegans</em> op vaste media voor longitudinale fluorescentiemonitoring en aversieve interventies

Hier presenteren we een algemene methode om de embryonale levensvatbaarheid en het totale aantal geproduceerde embryo's (broed) te bepalen met behulp van het modelorganisme C. elegans.

Het meten van de embryonale levensvatbaarheid en broedgrootte bij <em>Caenorhabditis elegans</em>

Dit protocol beschrijft een test om de voedingssnelheid van Caenorhabditis elegans te kwantificeren op basis van het meten van de klaring van bacteriën in vloeibare cultuur.

Kwantificering van de voedselinname bij <em>Caenorhabditis elegans</em> door de bacteriële klaring te meten

Leer een betrouwbare methode om de levensduur van Caenorhabditis elegans te meten op vast medium met UV-gedode bacteriën als voedselbron.

Het meten van Caenorhabditis elegans Levensduur over Solid Media

Meer video's verkennen