Het meten van Caenorhabditis elegans Levensduur over Solid Media
12 mei 2009
In dit artikel geven we een algemeen protocol voor het meten van de levensduur van nematoden gehouden op vaste media met UV-gedode bacteriën voedsel.
Om de levensduur bij C Elgan te meten, wordt een leeftijdsgesynchroniseerde populatie gegenereerd door middel van een getimede eierleggende reproductieve worm. Actieve volwassen hermafrodiete wormen worden overgebracht naar nematodegroeimediaplaten gezaaid met UV-gedode e coli waarna ze zes tot acht uur eieren mogen leggen en vervolgens gedurende de volgende twee dagen worden verwijderd. Wormen komen uit deze eieren en groeien naar de L vier larvenstadium. De L vier wormen worden overgebracht naar nieuwe NGM-platen die ampicilline bevatten om levende bacteriële besmetting te voorkomen en FUDR om reproductie te voorkomen en worden toegelaten om zich te ontwikkelen tot volwassenen.
Vanaf dit punt worden de volwassen wormen elke twee tot drie dagen waargenomen totdat alle wormen zijn gestorven. Op elk tijdstip worden dode wormen van de plaat verwijderd en het aantal levende en dode wormen geregistreerd. Ik ben George Seton van het laboratorium van Matt Capline in de afdeling Pathologie aan de Universiteit van Washington.
Vandaag gaan we je laten zien hoe je de levensduur meet en onze hepatitis elegance bekijkt. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de genetica van veroudering te bestuderen. Dus laten we beginnen.
Een basislevensduurexperiment vereist twee soorten platen, standaard NGM-platen, die geen toevoegingen bevatten, en AMP FUDR-platen, die zowel ampicilline als fluorodeoxyuridine bevatten die aan de NGM zijn toegevoegd. Beide soorten platen worden gezaaid met e coli OP 50-bacteriën, die vervolgens worden gedood door blootstelling aan uv. Begin met het bereiden van 10 milliliter NGM-oplossing.
Per 60 millimeter petrischaal smelt de vaste NGM volledig door te magnetron op hoog niveau in 32ste pulsen. Draai het medium tussen de pulsen om te voorkomen dat er geperste gasbubbels ontstaan. Plaats het vloeibare NGM in een waterbad van 55 graden Celsius of op de werkbank om het medium te laten afkoelen. Zodra het medium is afgekoeld tot 55 graden Celsius, op welk punt je de glazen container comfortabel met blote handen kunt vasthouden, is het klaar om medicijnen toe te voegen.
En om de platen met geneesmiddelen te gieten, voeg 33 microliter van 150 millimolair FUDR en 100 microliter van 100 milligram per milliliter toe. Ampicilline per 100 milliliter NGM en draai om te mengen. Ampicilline wordt gebruikt om buitenlandse bacteriële besmetting te voorkomen en FUDR om eieren te voorkomen dat ze uitkomen. Dus wormen hoeven niet elke paar dagen te worden overgeplaatst om ze te scheiden van groeiende larven.
Giet nu het medium en laat de platen twee dagen op de werkbank drogen op de dag voordat de platen klaar zijn om te drogen, zaai een vloeibare LB-kweek met een enkele kolonie van een verse streep e coli. OP 50-bacteriën op LB-agar. Bereid minstens 0,5 milliliter kweek per 60 millimeter plaat.
Plaats de OP 50-kweek in een schudder van 37 graden Celsius en laat de bacteriën een nacht groeien. De volgende dag pel de OP 50-bacteriën met 3.500 g centrifugeerkracht gedurende 10 minuten. Giet genoeg van het supernatant af om de bacteriën te hersuspenderen in een 10 x-concentratie.
Inoculeer nu elke plaat met 100 microliter van de geconcentreerde kweek. Vermijd contact van de pipettenpunt met het oppervlak van de NGM, omdat gebreken in het oppervlak van het medium de wormen zullen laten graven. Draai de platen totdat de bacteriën het centrale gebied van de NGM bedekken zonder de plaatwanden te benaderen en laat de platen 24 uur op de werkbank drogen. Eenmaal droog, legt u het oppervlak van de platen bloot aan een UV-dosis die sterk genoeg is om de bacteriegroei te stoppen, we gebruiken een Strata Gene UV Straddle Linker 2.400.
Begin met het laden van de platen in de Straddle Linker zonder hun deksels. Druk nu op energie. Voer 9 9 9 9 in op het toetsenbord en druk op start.
De platen worden ongeveer vijf minuten aan UV blootgesteld. Platen met UV-gedode bacteriën kunnen ondersteboven worden bewaard bij vier graden Celsius gedurende maximaal een maand. Dit gedeelte beschrijft hoe u een populatie wormen met een gemeenschappelijke uitkomstdatum genereert.
Begin met het overbrengen van ongeveer 20 jonge volwassen wormen naar een nieuwe NGM-plaat zonder geneesmiddelen. Laat de plaat ongeveer een week op 25 graden Celsius staan om wormen te laten propageren en al het bacteriële voedsel binnen een week op te eten. Nieuw uitgekomen wormen in de groeiachtergestelde dower-fase zouden overgebracht moeten worden. Breng 20 tot 30 dower-larven over naar een nieuwe NGM-plaat zonder geneesmiddelen en incubeer ze op 25 graden Celsius in aanwezigheid van voedsel.
De dower-larven worden binnen twee dagen reproductief actieve volwassenen en blijven enkele dagen reproductief actief. Breng nu 10 tot 15 van de reproductief actieve volwassenen over naar een nieuwe NGM-plaat zonder geneesmiddelen. Deze plaat wordt aangeduid als de getimede eierleggende of TEL-plaat.
Laat de TEL-plaat op 25 graden Celsius staan zodat de wormen eieren kunnen leggen. De dieren die uit deze eieren komen, zullen de experimentele dieren zijn en hun levensduur wordt na zes uur beoordeeld. Inspecteer de TEL-plaat op eieren.
Als er nog niet genoeg eieren zijn, laat de TEL-plaat dan maximaal 24 uur op 25 graden Celsius staan. Controleer periodiek op eieren. Wanneer er voldoende eieren zijn gelegd, verwijdert u de volwassenen van de TEL-plaat.
Een typisch levensduurexperiment vereist 30 tot 90 eieren per experimentele groep, maar er kunnen enkele honderden eieren op een enkele TEL-plaat worden gegenereerd. Ongeveer 150 eieren worden gelegd door 10 tot 15 reproductief actieve volwassenen in zes tot acht uur. Bij het vergelijken van experimentele groepen kan statistische significantie worden bereikt voor grote verschillen in levensduur met slechts 30 dieren
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het meten van de levensduur van nematoden die worden gehouden op vaste media met UV-gedode bacterievoeding. De methode omvat het genereren van een leeftijdgesynchroniseerde populatie en het monitoren van de levensduur van volwassen wormen.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschap
- Biologie
- Ontwikkelingsbiologie
Achtergrond
- Nematoden worden veel gebruikt in studies naar de levensduur.
- Met UV-licht gedode bacteriën dienen als voedingsbron zonder het risico op levende bacteriële contaminatie.
- Leeftijdssynchronisatie is cruciaal voor een nauwkeurige meting van de levensduur.
- Het protocol maakt een systematische observatie van de sterfte van de wormen mogelijk.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode vast te stellen voor de meting van de levensduur bij nematoden.
- Om UV-gedode bacteriën te gebruiken als een veilige voedselbron.
- Om bij te dragen aan het begrip van veroudering in modelorganismen.
Gebruikte methoden
- Genereren van een leeftijdsgesynchroniseerde populatie C. elegans met behulp van tijdgestelde eiafszetting.
- Overbrengen van volwassen hermafrodiete wormen naar platen met nematode-groeimedium.
- Gebruik van ampicilline en FUDR om contaminatie en voortplanting te voorkomen.
- Regelmatige observatie en registratie van levende en dode wormen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle vestiging van een protocol voor het meten van de levensduur.
- Effectief gebruik van UV-gedode bacteriën als voedselbron.
- Nauwkeurige monitoring van de mortaliteit van wormen over tijd.
- Inzichten in de levensduurdynamiek van C. elegans.
Conclusies
- Het protocol biedt een waardevolle tool voor levensduurstudies bij nematoden.
- Met UV-bestraalde bacteriën is er een levensvatbaar alternatief voor levende voedselbronnen.
- Deze methode kan het onderzoek naar veroudering en levensduur bij modelorganismen verbeteren.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Het meten van de levensduur in C. elegans biedt een voorspellend high-throughput-systeem voor targetvalidatie en mechanische risicoreductie bij geneesmiddelenonderzoek naar veroudering. Het protocol maakt een kwantitatieve beoordeling mogelijk van genetische en omgevingsinterventies op de levensduur, wat vroege hypothesetests en portfoliotriage ondersteunt. De schaalbaarheid en reproduceerbaarheid maken het geschikt voor integratie in discovery-workflows die gericht zijn op verouderingspaden en de identificatie van translationele biomarkers.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen met betrekking tot verouderingspaden en mechanismen van levensduur te onderzoeken.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door functionele read-outs te verschaffen van targetmodulatie op de levensduur.
- Voorspellende waarde: Genereert kwantitatieve overlevingsgegevens om de betrouwbaarheid van targets te beoordelen en lead-compounds te prioriteren voor verdere validatie.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert gestandaardiseerde, kwantitatieve levensduurmetingen op die geschikt zijn voor compound- of genetische screening.
- Operationele waarde: Waarborgt de reproduceerbaarheid van de assay door gebruik van leeftijdgesynchroniseerde populaties en gecontroleerde condities (UV-gedode bacteriën, FUDR, ampicilline).
- Schaalbaarheid: Compatibel met multi-well- of plaatgebaseerde formaten voor een verhoogde doorvoer in lead-identificatiecampagnes.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Verbindt bevindingen uit de ontdekkingsfase met preklinische validatie via geconserveerde verouderingspaden.
- Afstemming van biomarkers: Ondersteunt de identificatie van translationele biomarkers die correleren met levensduurverlenging of vertraging van veroudering.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Informeert go/no-go-beslissingen op basis van meetbare impact op de gezondheidsspanne en mortaliteitskinetiek.
Integratie van pijplijn en workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie via leadidentificatie tot preklinische beoordeling, in het bijzonder voor interventies die veroudering moduleren.
- Discovery Biology: Faciliteert hypothesetesten en het verduidelijken van signaalpaden door de organismische respons op genetische of farmacologische perturbaties te meten.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid via gestandaardiseerde protocollen die consistente, kwantitatieve overlevingscurves opleveren.
- Analytics: Genereert longitudinale mortaliteitsgegevens die statistische vergelijking van overlevingsdistributies onder verschillende condities mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt mechanistische bevindingen met preklinische relevantie via de evolutionaire conservering van verouderingsregulatoren.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor longitudinale verouderingsstudies over meerdere projecten en therapeutische gebieden.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen bij targetvalidatie door mechanistische ambiguïteit in verouderingsmodellen te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van levensduuranalyses tussen teams en locaties.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroege risicoreductie van longevity-targets mogelijk te maken vóór kostbare preklinische investeringen.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en beslissingen over verdere ontwikkeling op basis van empirische resultaten van de levensduur.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in de hantering van C. elegans, leeftijdssynchronisatie en microscopische levensvatbaarheidsscoring.
- Afhankelijk van toegang tot incubatoren, UV-bestralingsapparatuur en dissectiemicroscopen voor longitudinale tracking.
- Vereist standaardisatie van scoringscriteria en omgevingscondities (temperatuur, mediacompositie) tussen teams.
- Omvat overwegingen voor adaptatie bij het toepassen van het protocol op verschillende genetische achtergronden of omgevingsstressoren.
- Bevat praktische beperkingen zoals het graven of ontsnappen van wormen, wat protocolaanpassingen kan vereisen om de integriteit van de gegevens te waarborgen.
