Name: Het meten van Caenorhabditis elegans Levensduur over Solid Media (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-12T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: Leer een betrouwbare methode om de levensduur van Caenorhabditis elegans te meten op vast medium met UV-gedode bacteriën als voedselbron.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door een Glenn / verre Doorbraken in Gerontologie Award en NIH Grant 1R01AG031108-01 naar MKGS wordt ondersteund door NIH training te verlenen P30AG013280. MK is een Ellison Medical Foundation New Scholar in Aging.

Deel 1: Bereid nematode groei media (NGM) platen Deze paragraaf beschrijft de bereiding van het vaste NGM platen voor gebruik in de levensduur experiment. Een basis levensduur experiment zijn twee types van platen: standaard NGM platen, die geen additieven, en Amp / FUDR platen, die zowel ampicilline (Amp) en fluorodeoxyuridine (FUDR) toegevoegd aan de NGM hebben bevatten. Ampicilline wordt gebruikt om buitenlandse bacteriële besmetting te voorkomen. FUDR remt de celdeling, vermindert de productie van eieren, en voorkomt dat eieren van uitkomen. Het gebruik van FUDR voor een lange levensduur analyse heeft geen invloed op volwassen levensduur en verwijdert de noodzaak om de wormen overdragen om de paar dagen om ze te scheiden van groeiende larve. Beide types van platen zijn bezaaid met E. coli OP50 bacteriën, die vervolgens wordt gedood door blootstelling aan UV. <ol><li> Bereid NGM (zie hoofdstuk 5 voor recept en opslag noten) en label petri platen. U moet een 60 mm petri plaat per 10 ml NGM. Als je begint met de eerder bereid solide NGM, blijven 1,2 stap. Als u begint met vers geautoclaveerd NGM, ga dan naar stap 1.4. </li><li> Volledig smelten solide NGM door de magnetron op hoog in de 30 seconden pulsen. Swirl media tussen de pulsen te druk gasbellen te voorkomen dat de opbouw. </li><li> Plaats vloeistof NGM in 55 ° C water bad of op de bank om af te koelen. </li><li> Zodra NGM bereikt 55 ° C toe te voegen 33 pi van 150 mm FUDR en 100 pi van 100 mg / ml ampicilline per 100 ml NGM (voor Amp / FUDR platen) en zwenk om te mengen. Voor NGM platen zonder extra medicijnen gaan rechtstreeks naar 1,5 stap. </li><li> Met behulp van steriele techniek, pipet 10 mL NGM in elkaar 60 mm petri-plaat. Vermijd de vorming van luchtbellen indien mogelijk. Als luchtbellen vormen wel, kunnen ze worden geknald met behulp van een pipet tip. </li><li> Laat platen op de bank met de deksels op om NGM stollen en droog. Indien mogelijk, laat platen bank voor 2 dagen voor het toevoegen van bacteriën, maar 1 dag zal werken als platen zijn eerder nodig zijn. </li><li> Op de dag voordat de platen af te drogen, zaad vloeibaar LB cultuur met een enkele kolonie vanuit een nieuw streak van E. coli bacterie OP50 op LB-agar. U moet zich voorbereiden op zijn minst 1 mL van een overnachting OP50 cultuur per 60 mm plaat. </li><li> Plaats OP50 cultuur in 37 ° C mogelijk maakt shaker en bacteriën om te groeien &#39;s nachts (cultuur moet komen verzadiging). </li><li> Pellet OP50 bacteriën door het draaien bij 3.500 g gedurende 10 minuten. </li><li> Verwijder 90% van de supernatant en resuspendeer bacteriën om zich te concentreren cultuur 10x. </li><li> Pipetteer 100 ul van 10x geconcentreerde OP50 cultuur in het centrum van gestolde NGM platen. Swirl platen voorzichtig te spreiden bacteriën cultuur als dat nodig is (idealiter bacteriën moeten het centrale gebied van de NGM te dekken zonder dat de buurt van de plaat wanden). Probeer te vermijden dat het aanraken van de pipet tip om het oppervlak van de NGM, zoals gebreken in het oppervlak van de media zodat de wormen te graven in de NGM. </li><li> Laat platen op de bank &#39;s nachts, zodat bacteriën cultuur te drogen op de vaste NGM (meestal duurt ongeveer 24 uur). </li><li> Eenmaal droog, bloot het oppervlak van de platen om een ​​UV-dosis voldoende is om de groei van de bacteriën te arresteren. Als u gebruik maakt van een Stratagene UV Stratalinker 2400: <ul><li> Plaats platen in de Stratalinker en verwijder de deksels </li><li> Sluit de deur en zet de Stratalinker </li><li> Druk op &#39;Energie&#39; </li><li> Geef &#39;9999 &#39;met behulp van het toetsenbord </li><li> Druk op &#39;Start&#39; </li><li> De platen zullen worden blootgesteld aan UV voor ongeveer 5 minuten </li></ul></li><li> Platen met UV-gedode bacteriën kunnen ondersteboven worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende maximaal 1 maand. </li></ol> Deel 2: Voer een getimede eileg tot een leeftijd-gesynchroniseerde populatie van de dieren te verwerven In deze paragraaf geven we het genereren van een populatie van wormen met een gemeenschappelijke luik-date is. Dit wordt bereikt door te Reproductief actieve volwassenen om eieren te leggen op een bord voor een bepaalde periode van tijd en waardoor die eieren te ontwikkelen. <ol><li> (Optioneel) Breng circa 20 jonge volwassen wormen om een ​​frisse NGM plaat zonder FUDR. Laat platen bij 25 ° C, zodat de wormen te verspreiden en te eten door alle van de bacteriële voedsel. Nadat de bacteriën voedsel is geconsumeerd pas uitgekomen wormen zullen in de groei gearresteerd Dauer podium. Je zult om te Dauer larve zien rond te starten binnen een week, afhankelijk van het aantal wormen u in eerste instantie over te dragen aan de plaat. Dauer larve kan gebruikt worden voor de volgende stappen voor maximaal 1 maand. </li><li> (Optioneel) Transfer 20 tot 30 Dauer larve een nieuwe NGM plaat zonder FUDR. In de aanwezigheid van voedsel Dauer larve zal Reproductief actieve volwassenen worden binnen 2 dagen en blijven voor de voortplanting actief voor een paar dagen daarna bij 25 ° C. </li><li> Overdracht 10-15 Reproductief actieve volwassenen een nieuwe NGM plaat zonder FUDR. Deze plaat wordt aangeduid als de getimede eileg (TEL) plaat. </li><li> Laat de TEL plaat bij 25 ° C gedurende 6 uur, om t makenhij wormen tijd om eieren te leggen. </li><li> Verwijder de volwassen wormen uit TEL plaat. Plaat kunnen visueel worden geïnspecteerd voor eieren voordat u volwassenen. Als de wormen nog niet gelegd een voldoende aantal eieren die de TEL plaat kan worden achtergelaten bij 25 ° C tot een totaal van 24 uur voor het verwijderen van volwassen wormen. </li><li> Plaats TEL plaat bij 20 ° C tot de eieren zijn uitgekomen en de wormen hebben ontwikkeld om de L4 larvale stadium (in het algemeen 2 dagen voor wild-type C. elegans, maar kan langer duren voor de stammen met langzame ontwikkeling fenotypes). </li></ol> Deel 3: Score dieren voor de levensduur In deze paragraaf volgen we de leeftijd-gesynchroniseerde bevolking van wormen uit deel 2 tot ze sterven. Wormen zijn bijgehouden op Amp / FUDR platen ei-productie en bacteriële besmetting te voorkomen en worden geacht dood als ze niet reageren op prikkels van buitenaf. <ol><li> Overdracht L4 larve tot gezaaid Amp / FUDR platen. Voor iedere stam of conditie worden getest, is het typisch op te zetten 2-3 borden met 25-30 wormen per plaat. Beelden van de C. elegans levensfasen zijn bedoeld voor referentie (Figuur 1) 1. </li><li> Plaats Amp / FUDR platen bij 20 ° C gedurende 24 uur. </li><li> Na 24 uur, visueel te beoordelen wormen, media, en bacteriën. Overdracht wormen in de frisse Amp / FUDR platen als een van de volgende wordt waargenomen: <ul><li> Wormen hebben gegeten het grootste deel van de bacteriële voedsel. Vroeg in de levensduur van wormen experiment zal moeten worden overgebracht 1 tot 2 keer een week om de bacteriën te voorkomen dat uitgeput. </li><li> Een groot aantal van de larven aanwezig zijn. Dit is meestal een indicatie dat de wormen werden overgebracht naar de Amp / FUDR platen als jonge volwassenen in plaats van L4S en waren in staat om enkele eieren te leggen voordat de FUDR van kracht werd. De FUDR zal de larven in het algemeen te voorkomen groeien in volle volwassenen, maar af en toe een paar zal uitgroeien tot volwassenen en worden verward met de proefdieren. </li><li> Live / groeiende bacteriën worden waargenomen. In het algemeen zal de combinatie van Amp-en UV-doden ervoor te zorgen dat er geen levende bacteriën het experiment worden besmet, maar af en toe het zich voordoet. </li><li> Schimmelgroei is waargenomen op de media. Als vroeg genoeg bij bent, kan schimmelgroei meestal worden gesneden met behulp van een pipet tip of spatel. Als het eenmaal groeit groter te zijn dan een paar millimeter in diameter is het meestal makkelijker om de wormen te dragen aan een nieuwe plaat. </li><li> Met behulp van de dissectie bereik, bepalen of elke worm is levend of dood. </li><li> Tik voorzichtig de plaat. De worm is levend als het beweegt in reactie op de tikken. </li><li> Als de worm niet reageert op het aanboren van de plaat, zoom in op het hoofd regio. </li><li> Tik voorzichtig de worm het hoofd met platina overdracht te plukken. De score van de worm als dood als het niet reageert door het bewegen van zijn hoofd. </li><li> Dode wormen kunnen worden verwijderd uit de plaat. </li></ul></li><li> Noteer de datum en het aantal wormen die zijn levend en dood. </li><li> Keer terug platen tot 20 ° C. </li><li> Herhaal stap 3.3 tot 3.6 om de 2 tot 3 dagen totdat alle wormen zijn gestorven. </li></ol> Deel 4: Representatieve resultaten. De ruwe gegevens die door een nematode levensduur experiment is een lijst van data met de bijbehorende aantallen wormen die nog in leven en dood voor elk getest stam. Het aantal wormen die sterven op elke dag is meestal omgekeerd om het aandeel van de wormen leven op elke dag (Figuur 2A), die grafisch wordt uitgezet als een survival curve (Figuur 2B te berekenen; de dag van de getimede eileg wordt beschouwd als dag 0 ). De levensduur voor elke individuele worm in de studie kan worden berekend op basis van de telling van de wormen die sterven op elke dag en gebruikt voor het gemiddelde en mediane levensduur te berekenen voor vergelijking tussen de stammen. De telling van het aantal wormen in leven op elke dag wordt niet direct gebruikt in de levensduur analyse. Worms onderhouden op vaste media zal zo nu en &#39;vluchten&#39;, of kruipen of op de muur van de plaat of naar beneden onder de media. Het aantal wormen leven op elke dag gebruikt kan worden om te bepalen hoeveel wormen gevlucht in de loop van het experiment. Wormen die vluchten worden meestal verwijderd uit de analyse. Als benchmark, de typische gemiddelde levensduur van N2, de C. elegans wild-type stam, gehouden op UV-gedode bacteriën bij 20 ° C is ongeveer 25 dagen gemeten vanaf ei. Deel 5: Oplossingen <table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Nematoden Groei Media (NGM), 100 ml: </td></tr><tr><td colspan="2"> Te combineren: </td></tr><tr><td> 0,3 g </td><td> NaCl </td></tr><tr><td> 0,25 g </td><td> Pepton </td></tr><tr><td> 2 g </td><td> Agar-agar </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclaaf gedurende 40 minuten en laat afkoelen tot 55 ° C, dan toevoegen: </td></tr><tr><td> 100 ul </td><td> 1 M MgSO 4 </td></tr><tr><td> 100 ul </td><td> 5 mg / ml Cholesterol </td></tr><tr><td> 100 ul </td><td> 1 M CaCl2 </td></tr><tr><td> 1,625 mL </td><td> 1,5 M KPI pH 6,0 </td></tr><tr><td colspan="2"> Vloeistof NGM kan onmiddellijk worden gebruikt om de platen gieten of de gelegenheid te stollen en opgeslagen op lange termijn bij kamertemperatuur </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Luria Broth (LB), 1L: </td></tr><tr><td> 10 g </td><td> BactoTryptone </td></tr><tr><td> 5 g </td><td> Gist Extract </td></tr><tr><td> 10 g </td><td> NaCl </td></tr><tr><td> 10 ml </td><td> 1 M Tris pH 8,0 </td></tr><tr><td> Een L </td><td> gedeïoniseerd water </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclaaf en bewaren bij kamertemperatuur. </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 1 M MgSO 4, 300 ml: </td></tr><tr><td> 73,95 g </td><td> MgSO 4 </td></tr><tr><td> 300 ml </td><td> gedeïoniseerd water </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclaaf en bewaren bij kamertemperatuur. </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 5 mg / ml Cholesterol, 200 ml: </td></tr><tr><td> 1 g </td><td> cholesterol </td></tr><tr><td> 200 ml </td><td> 100% ethanol </td></tr><tr><td colspan="2"> Filter steriliseer en bewaar bij kamertemperatuur. </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 1 M CaCl 2, 500 ml: </td></tr><tr><td> 27,75 g </td><td> CaCl 2 </td></tr><tr><td> 500 ml </td><td> gedeïoniseerd water </td></tr><tr><td colspan="2"> Filter steriliseer en bewaar bij kamertemperatuur. </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 1,5 M KPI pH 6,0, 1L: </td></tr><tr><td colspan="2"> Te combineren: </td></tr><tr><td> 31,4 g </td><td> KPI dibasisch </td></tr><tr><td> 179,6 g </td><td> KPI monobasisch </td></tr><tr><td> 850 ml </td><td> gedeïoniseerd water </td></tr><tr><td colspan="2"> Warmte tijdens het mengen, zodat KPI op te lossen in oplossing. Pas de pH op 6.0 met 10 N NaOH. </td></tr><tr><td colspan="2"> Voeg gedeïoniseerd water tot 1 L. </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclaaf en bewaren bij kamertemperatuur. </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 1 M Tris, pH 8,0: </td></tr><tr><td> 60,57 g </td><td> Tris </td></tr><tr><td> 400 ml </td><td> gedeïoniseerd water </td></tr><tr><td colspan="2"> Pas de pH op 8.0 met HCl. </td></tr><tr><td colspan="2"> Voeg gedeïoniseerd water tot 500 ml. </td></tr><tr><td colspan="2"> Filter steriliseer en bewaar bij kamertemperatuur. </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 150 mM Fluorodeoxyuridine (FUDR), 10 ml: </td></tr><tr><td> 0,3693 g </td><td> FUDR </td></tr><tr><td> 10 ml </td><td> steriel gedemineraliseerd water </td></tr><tr><td colspan="2"> Bewaren bij -20 ° C. </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 100 mg / ml ampicilline (Amp), 10 ml: </td></tr><tr><td> 1 g </td><td> Ampicilline </td></tr><tr><td> 10 ml </td><td> steriel gedemineraliseerd water </td></tr><tr><td colspan="2"> Bewaren bij -20 ° C. </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 50 mg / ml carbenicilline (Carb), 10 ml: </td></tr><tr><td> 500 mg </td><td> Carbenicilline </td></tr><tr><td> 10 ml </td><td> steriel gedemineraliseerd water </td></tr><tr><td colspan="2"> Bewaren bij -20 ° C. </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 1 M Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG), 10 ml: </td></tr><tr><td> 2,38 g </td><td> IPTG </td></tr><tr><td> 10 ml </td><td> steriel gedemineraliseerd water </td></tr><tr><td colspan="2"> Bewaren bij -20 ° C. </td></tr></tbody></table><img src="/files/ftp_upload/1152/Figure%201.png" alt="figuur 1" /> Figuur 1. Bright gebied beelden van C. elegans levensfasen, zoals ei, de vier larvale stadia (L1 - L4), en volwassen. Alle panelen tonen hermafrodieten, behalve de lagere-rechts, dat een volwassen man (Afbeelding van Wood (1988)) laat zien. <img src="/files/ftp_upload/1152/Figure%202.png" alt="figuur 2" /> Figuur 2. Representatieve resultaten van een C. elegans levensduur experiment vergelijken van wild-type stam N2 naar een stam met een mutatie in het daf-2-gen. (A) Een tabel met verzamelde gegevens, waaronder het aantal dagen sinds wormen waren eieren, het aantal dode wormen waargenomen op elke dag, en het percentage van het oorspronkelijke monster nog in leven op elke dag (zoals berekend uit de dagelijkse tellingen van dode wormen) . (B) Survival curves die overeenkomt met de levensduur gegevens in (A). <imgsrc = &quot;/ files/ftp_upload/1152/Figure 3.jpg&quot; alt = &quot;figuur 3&quot; /&gt; Figuur 3. Vertegenwoordiger vergelijking van de lipofuscine tussen jong en oud volwassen C. elegans. Helderveld beelden worden getoond op de linker-en DAPI kanaal fluorescentie beelden aan de rechterkant. Top panelen tonen een vier dagen oude worm-en onderzijde panelen tonen een 11 dagen oude worm (zoals gemeten uit eieren).

<ol><li>Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWood%2C+WB+%22The+Nematode+Caenorhabditis+elegans%22">The Nematode Caenorhabditis elegans</a>. Wood, W. B. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 1-16 (1988).</li>
<li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+restriction+by+bacterial+deprivation+increases+life+span+in+wild-derived+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Dietary restriction by bacterial deprivation increases life span in wild-derived nematodes.</a> Exp Gerontol. 43, 130-135 (2008).</li>
<li>Garigan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+tissue+aging+in+Caenorhabditis+elegans%3A+a+role+for+heat-shock+factor+and+bacterial+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: a role for heat-shock factor and bacterial proliferation.</a> Genetics. 161, 1101-1112 (2002).</li>
<li>Chen, D., Pan, K. Z., Palter, J. E., Kapahi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longevity+determined+by+developmental+arrest+genes+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Longevity determined by developmental arrest genes in Caenorhabditis elegans.</a> Aging Cell. 6, 525-523 (2007).</li>
<li>Curran, S. P., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifespan+regulation+by+evolutionarily+conserved+genes+essential+for+viability%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Lifespan regulation by evolutionarily conserved genes essential for viability.</a> PLoS Genet. 3, e56-e56 (2007).</li>
<li>Dillin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rates+of+behavior+and+aging+specified+by+mitochondrial+function+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rates of behavior and aging specified by mitochondrial function during development.</a> Science. 298, 2398-2401 (2002).</li>
<li>Hamilton, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+RNAi+screen+for+longevity+genes+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A systematic RNAi screen for longevity genes in C. elegans.</a> Genes Dev. 19, 1544-1555 (2005).</li>
<li>Hansen, M., Hsu, A. L., Dillin, A., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+genes+tied+to+endocrine%2C+metabolic%2C+and+dietary+regulation+of+lifespan+from+a+Caenorhabditis+elegans+genomic+RNAi+screen%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">New genes tied to endocrine, metabolic, and dietary regulation of lifespan from a Caenorhabditis elegans genomic RNAi screen.</a> PLoS Genet. 1, 119-128 (2005).</li>
<li>Lee, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+RNAi+screen+identifies+a+critical+role+for+mitochondria+in+C.+elegans+longevity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity.</a> Nat Genet. 33, 40-48 (2003).</li>
<li>Smith, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-+and+calorie-independent+life+span+extension+from+dietary+restriction+by+bacterial+deprivation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Age- and calorie-independent life span extension from dietary restriction by bacterial deprivation in Caenorhabditis elegans.</a> BMC Dev Biol. 8, 49-49 (2008).</li>
<li>Hodgkin, J., Horvitz, H. R., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nondisjunction+Mutants+of+the+Nematode+CAENORHABDITIS+ELEGANS%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Nondisjunction Mutants of the Nematode CAENORHABDITIS ELEGANS.</a> Genetics. 91, 67-94 (1979).</li>
<li>Emmons, S. W., Sternberg, P. W. C. ELEGANS II. Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Springs Harbor, NY. (1997).</li>
<li>Lipton, J., Kleemann, G., Ghosh, R., Lints, R., Emmons, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mate+searching+in+Caenorhabditis+elegans%3A+a+genetic+model+for+sex+drive+in+a+simple+invertebrate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mate searching in Caenorhabditis elegans: a genetic model for sex drive in a simple invertebrate.</a> J Neurosci. 24, 7427-7434 (2004).</li>
<li>Davis, B. O., Anderson, G. L., Dusenbery, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+luminescence+spectroscopy+of+fluorescence+changes+during+aging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Total luminescence spectroscopy of fluorescence changes during aging in Caenorhabditis elegans.</a> Biochemistry. 21, 4089-4095 (1982).</li>
<li>Klass, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+major+biological+and+environmental+factors+influencing+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span.</a> Mech Ageing Dev. 6, 413-429 (1977).</li>
<li>Steinkraus, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+restriction+suppresses+proteotoxicity+and+enhances+longevity+by+an+hsf-1-dependent+mechanism+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Dietary restriction suppresses proteotoxicity and enhances longevity by an hsf-1-dependent mechanism in Caenorhabditis elegans.</a> Aging Cell. 7, 394-404 (2008).</li>
</ol>

De genetische controle van de levensduur is uitgebreid onderzocht in C. elegans, grotendeels te danken aan het gemak en de snelheid waarmee levensduur kan worden vastgesteld. Het protocol besproken in dit artikel beschrijft een raamwerk voor het verkrijgen van reproduceerbare levensduur gegevens in C. elegans en kan ook worden toegepast op relatednematode soorten. 2 Door het maken van een aantal eenvoudige aanpassingen van deze procedures kunnen worden aangepast aan de levensduur te meten on...

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Reagens</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0145-17-0 (214530)</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td>Reagens</td><td>MidSci</td><td>0339</td><td></td></tr><tr><td>BactoTryptone</td><td>Reagens</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0123-17-3 (211705)</td><td></td></tr><tr><td>BactoPeptone</td><td>Reagens</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0118-17-0 (211677)</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Reagens</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9699248 (1332-01)</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicilline</td><td>Reagens</td><td>Gold Biotechnology</td><td>C0109</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C75209</td><td></td></tr><tr><td>Fluorodeoxyuridine (FUDR)</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl &amp;#946;-d-thiogalactopyranoside (IPTG)</td><td>Reagens</td><td>Gold Biotechnology</td><td>I2481C5</td><td></td></tr><tr><td>KPi dibasisch</td><td>Reagens</td><td>Fisher Scientific</td><td>5087862 (3252-01)</td><td></td></tr><tr><td>KPi monobasisch</td><td>Reagens</td><td>Fisher Scientific</td><td>5087861 (3246-01)</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Reagens</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9561800 (2500-01)</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Reagens</td><td>Fisher Scientific</td><td>S251</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Gistextract</td><td>Reagens</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0886-17-0 (288620)</td><td></td></tr></tbody></table>

het meten van caenorhabditis elegans levensduur over solid media

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Veroudering is een degeneratieve proces wordt gekenmerkt door een progressieve verslechtering van de cellulaire componenten en organellen resulterend in sterfte. De nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Heeft zich ontpopt als een van de belangrijkste model dat wordt gebruikt om de biologie van veroudering te bestuderen. Omdat vrijwel alle biologische subsysteem ondergaat functionele achteruitgang met de leeftijd, de levensduur is het primaire eindpunt van belang bij het overwegen van totale tarief van de vergrijzing. In nematoden, is de levensduur meestal gedefinieerd als het aantal dagen dat een dierlijke resten reageren op prikkels van buitenaf. Aaltjes kan worden gepropageerd in vloeibare media of op vaste media in platen, en technieken zijn ontwikkeld voor het meten van de levensduur onder beide omstandigheden. Hier presenteren wij een algemeen protocol voor het meten van de levensduur van nematoden gehouden op vaste nematode groei media en gevoed met een dieet van UV-gedode bacteriën. Deze procedures kunnen eenvoudig worden aangepast aan de test levensduur onder verschillende voorkomende aandoeningen, waaronder een dieet bestaande uit levende bacteriën, calorische restrictie, en RNA-interferentie.

In dit artikel geven we een algemeen protocol voor het meten van de levensduur van nematoden gehouden op vaste media met UV-gedode bacteriën voedsel.

Het meten van Caenorhabditis elegans Levensduur over Solid Media

Veroudering is een degeneratief proces dat wordt gekenmerkt door een progressieve verslechtering van cellulaire componenten en organellen, wat uiteindelijk leidt tot sterfte. De nematode ...

Om de levensduur in C. elegans te meten, wordt een leeftijdgesynchroniseerde populatie gegenereerd door middel van een tijdgebonden ei-legging. Actieve volwassen hermafrodiete wormen worden overgebracht naar nematode growth media (NGM)-platen gezaaid met UV-gedode E. coli, waarbij ze zes tot acht uur lang eieren mogen leggen waarna ze worden verwijderd. Gedurende de volgende twee dagen komen de wormen uit deze eieren en groeien ze naar het L4-larvale stadium. De L4-wormen worden overgebracht naar nieuwe NGM-platen die ampicilline bevatten om levende bacteriële contaminatie te voorkomen en FUDR om reproductie te voorkomen, waarna ze zich mogen ontwikkelen tot volwassenen.Vanaf dit punt worden de volwassen wormen elke twee tot drie dagen geobserveerd totdat alle wormen zijn gestorven. Op elk tijdstip worden de dode wormen van de plaat verwijderd en wordt het aantal levende en dode wormen geregistreerd. Ik ben George Seton van het laboratorium van Matt Capline van de afdeling Pathologie aan de University of Washington.Vandaag laten we u zien hoe u de levensduur meet en kijken we naar onze hepatitis elegance. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de genetica van veroudering te bestuderen. Laten we beginnen.Een basisexperiment naar de levensduur vereist twee soorten platen: standaard NGM-platen, die geen additieven bevatten, en AMP FUDR-platen, waaraan zowel ampicilline als fluorodeoxyuridine aan de NGM zijn toegevoegd. Beide soorten platen worden bezaaid met e coli OP 50-bacteriën, die vervolgens worden gedood door blootstelling aan uv. Begin met het bereiden van 10 milliliters NGM-oplossing.Smelt voor elke Petri-schaal van 60 millimeter vaste NGM volledig door deze in pulsen van 32 seconden op hoge stand in de magnetron te verhitten. Draai het medium tussen de pulsen door om te voorkomen dat er onder druk staande gasbellen ontstaan; plaats de vloeibare NGM in een waterbad van 55 graden Celsius of op de werkbank om het medium af te koelen. Zodra het medium is afgekoeld tot 55 graden Celsius, op welk punt u de glazen container comfortabel met blote handen zou moeten kunnen vasthouden, is het gereed voor de toevoeging van geneesmiddelen.Om de platen met geneesmiddelen te gieten, voegt u 33 µL van 150 mM FUDR en 100 µL van 100 mg/mL ampicilline per 100 mL NGM toe en draait u de plaat rond om te mengen. Ampicilline wordt gebruikt om vreemde bacteriële contaminatie te voorkomen en FUDR om te voorkomen dat eieren uitkomen. Zo hoeven de wormen niet elke paar dagen te worden overgezet om ze te scheiden van groeiende larven.Giet nu het medium en laat de platen twee dagen op de werkbank drogen. Op de dag voordat de platen klaar zijn met drogen, wordt een vloeibare LB-cultuur geënt met een enkele kolonie van een verse uitstrijk van E. coli OP 50 bacteriën op LB-agar. Bereid ten minste 0,5 milliliter cultuur per 60 millimeter plaat voor.Plaats de OP 50-cultuur in een schudincubator op 37 °C en laat de bacteriën een nacht groeien. Pellet de volgende dag de OP 50-bacteriën met een centrifugale kracht van 3 500 g gedurende 10 minuten. Decanteer voldoende supernatant om de bacteriën te resuspenderen tot een 10 x concentratie.Inoculeer nu elke plaat met 100 µL van de geconcentreerde cultuur. Vermijd contact tussen de pipetpunt en het oppervlak van de NGM, aangezien beschadigingen in het oppervlak van het medium de wormen in staat stellen om in het medium te graven; draai de platen rond totdat de bacteriën het centrale gebied van de NGM bedekken zonder de wanden van de plaat te raken, en laat de platen 24 uur drogen op de werkbank. Wanneer ze droog zijn, wordt het oppervlak van de platen blootgesteld aan een UV-dosis die sterk genoeg is om de bacteriële groei te stoppen; wij gebruiken een StrataGene UV Crosslinker 2400.Begin met het plaatsen van de platen in de straddle linker zonder hun deksels. Druk nu op energy. Voer 9 9 9 9 in op het toetsenbord en druk op start.De platen worden gedurende ongeveer vijf minuten blootgesteld aan UV-licht. Platen met UV-gedode bacteriën kunnen ondersteboven worden bewaard bij vier graden Celsius voor maximaal een maand. Deze sectie beschrijft hoe men een populatie wormen met een gemeenschappelijke uitkomstdatum kan genereren.Begin met het overbrengen van ongeveer 20 jonge volwassen wormen naar een verse NGM-plaat zonder geneesmiddelen. Laat de plaat ongeveer een week op 25 °C staan, zodat de wormen zich kunnen voortplanten en al het bacteriële voedsel binnen een week consumeren. Zodra er pas uitgekomen wormen in het groeistop-dauerstadium verschijnen, moeten 20 tot 30 dauerlarven worden overgebracht naar een verse NGM-plaat zonder geneesmiddelen en bij 25 °C worden geïncubeerd in aanwezigheid van voedsel.De dower-larven worden binnen twee dagen reproductief actieve volwassenen en blijven daarna nog enkele dagen reproductief actief. Draag nu 10 tot 15 van de reproductief actieve volwassenen over naar een verse NGM-plaat zonder geneesmiddelen. Deze plaat wordt aangeduid als de timed egg laying- of TEL-plaat.Laat de TEL-plaat bij 25 °C zodat de wormen eieren kunnen leggen. De dieren die uit deze eieren uitkomen, zullen de experimentele dieren zijn en hun levensduur wordt na zes uur gescoord. Inspecteer de TEL-plaat op eieren.Als er nog niet genoeg eitjes zijn, laat de TEL-plaat dan tot een totaal van 24 uur bij 25 °C staan. Controleer periodiek op de aanwezigheid van eitjes. Wanneer er een voldoende aantal eitjes is gelegd, worden de volwassen dieren van de TEL-plaat verwijderd.Voor een typisch experiment naar de levensduur zijn 30 tot 90 eieren per experimentele groep nodig, maar op een enkele TEL-plaat kunnen enkele honderden eieren worden gegenereerd. Ongeveer 150 eieren worden in zes tot acht uur gelegd door 10 tot 15 reproductief actieve volwassenen. Bij het vergelijken van experimentele groepen kan statistische significantie worden bereikt voor grote verschillen in levensduur met slechts 30 dieren.Er moeten meer dieren worden gebruikt om bescheiden verschillen te kunnen onderscheiden. Plaats de TEL-plaat zonder volwassen dieren nu bij 20 °C totdat de eieren zijn uitgekomen en de wormen zich hebben ontwikkeld tot het L4-larvale stadium. Dit duurt gewoonlijk twee dagen voor wild-type C. elegans, maar kan langer duren voor stammen met fenotypes die een trage ontwikkeling vertonen.Deze sectie beschrijft hoe het leven van een leeftijdgesynchroniseerde populatie kan worden gevolgd. Draag eerst de L4-larven over van de TEL-plaat naar geplaatste AMP FUDR-platen. Voor elke stam of conditie die wordt getest, is het gebruikelijk om twee tot drie platen in te richten met 25 tot 30 wormen per plaat.Incubeer de AMP FUDR-platen gedurende 24 uur bij 20 °C. Beoordeel vervolgens visueel de wormen, het medium en de bacteriën, en breng de wormen over naar verse AMP FUDR-platen. Dit gebeurt doorgaans één of twee keer per week, indien de wormen het grootste deel van het bacteriële voedsel hebben geconsumeerd.Als er vroeg in het experiment een aanzienlijk aantal larven aanwezig is, duidt dit gewoonlijk erop dat de wormen als jonge volwassenen in plaats van als L4-stadia op de AMP FUDR-platen zijn overgebracht. Jonge volwassenen kunnen eieren leggen voordat FUDR effect heeft, en af en toe ontsnappen larven aan de effecten van FUDR en groeien ze uit tot volwassenen. Deze larven zullen het experiment beïnvloeden; breng in deze situatie de volwassen wormen over naar verse platen en gooi de oude platen die de larven bevatten weg.Wormen moeten ook worden overgebracht naar verse plaatjes als er levende, groeiende bacteriën worden waargenomen. Over het algemeen zorgt de combinatie van AMP en UV-bestraling ervoor dat er geen levende bacteriën het experiment contamineren, maar af en toe komt dit voor. Breng in dat geval de wormen over.Indien er schimmelgroei op het medium wordt waargenomen. Als dit vroeg genoeg wordt opgemerkt, kan de schimmel worden verwijderd met behulp van een pipetpunt of spatel. Zodra de schimmel een diameter van meer dan enkele millimeters bereikt, is het meestal eenvoudiger om de wormen over te brengen naar een nieuwe plaat.Beoordeel elke twee tot drie dagen de levensduur van alle wormen. Gebruik hiervoor een dissectiemicroscoop. Bepaal of elke worm levend of dood is.Tik voorzichtig tegen de plaat. De worm is in leven als deze beweegt als reactie op het tikken. Als de worm niet reageert op het tikken tegen de plaat, zoom dan in op de kopregio en tik voorzichtig tegen de kop van de worm met een platinatransfernaald.Markeer de worm als dood. Als deze niet reageert door met de kop te bewegen, verwijder dan de dode worm van de plaat. Noteer na het controleren van alle wormen de datum en het aantal levende en dode wormen.Wormen die op vaste media worden gehouden, ontsnappen af en toe van het platoppervlak door te graven of tegen de wand omhoog te kruipen. Wormen die ontsnappen, worden volledig uitgesloten van de studie. Plaats de platen na afloop terug in de incubator van 20 °C.Wacht nog twee tot drie dagen en controleer vervolgens de platen opnieuw. Zet dit regime voort totdat elke worm is gestorven. Het aantal wormen dat per dag sterft, wordt gewoonlijk geïnverteerd om de proportie levende wormen per dag te berekenen; deze gegevens worden grafisch uitgezet als een overlevingscurve, waarbij de dag van de getimede eiafzetting in rekening wordt gebracht.Dag nul. De typische mediane levensduur van *C. elegans* wildtype-stammen, gekweekt op UV-gedode bacteriën bij 20 graden Celsius, bedraagt ongeveer 25 dagen, gemeten vanaf het eistadium.We hebben zojuist aangetoond hoe u de levensduur kunt meten en elegantie kunt waarnemen. U kunt deze basisprocedure aanpassen om verschillende omgevingscondities te testen, waaronder dieetrestrictie en RNA-interferentie, wat wordt besproken in de begeleidende tekst. Dat is alles.Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experiment.

measuring-caenorhabditis-elegans-life-span-on-solid-media

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In dit protocol presenteren we een methode om te...

Het meten van Caenorhabditis elegans Levensduur in 96 Well microtiterplaten

Deze video beschrijft een traditionele, op platen gebaseerde methode om de levensduur van C. elegans te meten. Het voorbeeldprotocol meet de levensduur van wormen die met RNAi worden behandeld.

Levensduuranalyse: Het meten van de levensduur van C. elegans

C. elegans eierleggedrag kan belangrijke informatie bieden in ontwikkelings-, reproductieve en anatomische studies.  Deze video introduceert de belangrijke stappen van een eierlegtest en toont een monsterexperiment waarbij een medicijn wordt getest op reproductietoxiciteit.

Egg Laying Assay: Een methode om het eierleggedrag van C. elegans te kwantificeren

Een ei-in-worm (EIW) test is een handige methode om eierleggende gedrag te kwantificeren. Veranderingen in eileg kan een gedragsmatige reactie van het modelorganisme...

Het meten van de effecten van bacteriën op<em&gt; C. Elegans</em&gt; Gedrag Met behulp van een Ei Retention Assay

Hier beschrijven we protocollen die specifiek zijn ontworpen om morfogenetische defecten te monitoren die optreden tijdens de vroege en late fasen van embryonale verlenging van de rondworm Caenorhabditis elegans. Uiteindelijk zijn deze protocollen ontworpen om genen te identificeren die deze fasen reguleren en om hun differentiële vereisten langs de antero-posterior as van het embryo te karakteriseren.

Novel Metrics te karakteriseren Embryonale Verlenging van de nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Hier beschrijven we de replicaset methode, een benadering tot kwantitatief maatregel C. elegans levensduur/overleving en de healthspan in een high-throughput en robuuste manier, waardoor screening van vele voorwaarden zonder in te boeten op kwaliteit van de gegevens. Dit protocol details van de strategie en biedt een software-instrument voor de analyse van gegevens van de replicaset.

De Replica Set, methode: Een High-throughput benadering van kwantitatief maatregel Caenorhabditis elegans levensduur

Caenorhabditis elegans dienen als een uitstekend modelsysteem met robuuste en goedkope methoden voor het onderzoeken van de gezondheid, levensduur en veerkracht tegen stress.

Onderzoek naar goedkope methoden om levensduur en gezondheid te meten in Caenorhabditis elegans

Hier wordt een geoptimaliseerd protocol gepresenteerd voor het kweken van geïsoleerde individuele nematoden op vaste media in microgefabriceerde multi-well-apparaten. Met deze aanpak kunnen individuele dieren gedurende hun hele leven worden gevolgd op een verscheidenheid aan fenotypen die verband houden met veroudering en gezondheid, waaronder activiteit, lichaamsgrootte en -vorm, bewegingsgeometrie en overleving.

Langetermijnkweek en monitoring van geïsoleerde Caenorhabditis elegans op vaste media in multiwell-apparaten

Hier presenteren we een algemene methode om de embryonale levensvatbaarheid en het totale aantal geproduceerde embryo's (broed) te bepalen met behulp van het modelorganisme C. elegans.

Het meten van de embryonale levensvatbaarheid en broedgrootte bij Caenorhabditis elegans

Dit protocol beschrijft een test om de voedingssnelheid van Caenorhabditis elegans te kwantificeren op basis van het meten van de klaring van bacteriën in vloeibare cultuur.

Kwantificering van de voedselinname bij Caenorhabditis elegans door de bacteriële klaring te meten

Leer een betrouwbare methode om de levensduur van Caenorhabditis elegans te meten op vast medium met UV-gedode bacteriën als voedselbron.

Het meten van Caenorhabditis elegans Levensduur over Solid Media

Meer video's verkennen