Name: Homarus Americanus Stomatogastric Nervous System Dissection (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 26 min 22 s
Description: Leer de fijne dissectie van het stomatogastrische zenuwstelsel bij de Amerikaanse kreeft Homarus americanus. Deze methode is essentieel voor neurobiologisch onderzoek naar neuronale functie en ritmisch gedrag.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen graag onze adviseur, dr. Eva Marder erkennen. Dit onderzoek werd ondersteund door het National Institute of Health beurzen NS17813 tot Eva Marder en NS059255 naar AE T.

Voorafgaand aan het begin van dit protocol de maag van de kreeft moet worden verwijderd uit het dier en bereid zoals beschreven in de metgezel Jupiter artikel (Bierman &amp; Tobin, 2009). De meerderheid van de onderstaande maatregelen zijn getroffen om te worden uitgevoerd onder een dissectie microscoop. Deel I-isoleren van de Commissural Ganglia <ol><li> Plaats de schotel, zodat de voorste einde (door de lip) uit de buurt is van jou en het achterste einde (door de pylorus) is naar u toe. </li><li> Zorg ervoor dat de maag is gespeld, zodat het ligt zo plat mogelijk op de schotel. <ol><li> Pin de slokdarm aan beide zijden van de lip. </li><li> Indien nodig, de volgorde van de andere pinnen geplaatst tijdens de bruto-dissectie. </li></ol></li><li> Verwijder de hypodermis. <ol><li> Pak de hypodermis de buurt van de gm2/gm3 spieren, verwijdert u deze en deze spieren en trek in de voorste richting. </li><li> Scheid de hypodermis van de onderliggende vet door knippen verbindingen worden gemaakt. Gebruik extra zorg rond de centrale ader, die een belangrijk deel van het stomatogastric zenuwstelsel omsluit. Laat de hypodermis intact binnen ongeveer een 0,5 cm straal van de stomatogastric ganglion, die zit tussen de gm1b spieren. </li><li> Snij gescheiden hypodermis. </li></ol></li><li> Maak de hersenen van het onderliggende weefsel. <ol><li> Identificeer de twee grote commissural zenuwen die bilateraal project van de voorste gedeelte van de hersenen naar de commissural ganglia in het voorste gedeelte van de maag. </li><li> Het verlaten van deze zenuwen intact, til de hersenen met een tang en snijd aan de hersenen scheiden van de rest van het weefsel. Wees voorzichtig als u dit doet, omdat de stomatogastric zenuw is onder de hersenen en moeten worden bewaard intact. </li></ol></li><li> Scheid de commissural ganglia van de omliggende het weefsel. <ol><li> Volg een van de commissural zenuwen naar een van de commissural ganglia. </li><li> Identificeer de ion en zoon - deze zenuwen moet intact blijven. De commissural ganglion zal veel zenuwen uitstralen. Snijd de meesten van hen (behalve de ion en zoon), maar laat een extra zenuw aan de commissural ganglion zijn plaats te houden terwijl u klaar bent met de dissectie. </li><li> Herhaal met de andere commissural ganglion. </li></ol></li><li> Reinig de ion en zoon van lateraal naar mediaal. Laat de labiale zenuw intact aan het zenuwstelsel anker naar de maag. De slokdarm ganglion zit werden snijden de ion s. Je kan duidelijk daaronder worden gehouden door grijpen de inferieure ventriculaire zenuw en omhoog te trekken naar onder te snijden. </li></ol> Deel II-isoleren van de Stomatogastric Ganglion (STG) en de resterende zenuwen. <ol start="7"><li> Scheid de STG uit de omliggende het weefsel. <ol><li> De STG zit in een slagader die loopt tussen de gm1b spieren en neer naar de gm2a, b spieren. Kijk voor het afgesneden uiteinde van de ader bij de gm2a, b spieren. </li><li> Trek het afgesneden uiteinde van de slagader omhoog en naar voren, naar de dvn bloot te leggen. Ga verder omhoog te trekken tot aan het niveau van de resterende hypodermis. Eenmaal gescheiden, kan de slagader worden bijgesneden tot het niveau waar het raakt de resterende hypodermis. </li><li> Snijd de spier flap die was gelegen in het rostrum van de kreeft. </li><li> Til de hypodermis boven de slagader, de opmerking dat de slagader een tunnel in het vet boven de STG maakt. Leg een blad van uw schaar in de slagader en snij de spier erboven. Controleer of u kunt de dvn zien als je geknipt om er zeker van bent u veilig boven de STG. Ga verder snijden voren, naar aanleiding van de slagader. Zoals u besnoeiing boven de STG, kunt u zien dat de STN uitgaat naar voren uit de STG en duiken naar beneden in de spier. Blijven snijden voren om de spier volledig te scheiden boven de STG. </li><li> Verwijder eventueel weefsel weg van de STN. </li></ol></li><li> Scheid de AGN s van het omringende weefsel. (Zelfs als u niet van plan om op te nemen uit de AGN, zal je een deel van de intacte zenuw behoefte vast te pinnen het ganglion voor intracellulaire opnames.) <ol><li> Om beter te zien van de AGN s, verwijder het resterende hypodermis en een dun laagje van de onderliggende spier. </li><li> Juist achter de STG, identificeren van een donkere tunnel in het vet en de spieren aan weerszijden van de dvn. </li><li> Stick een schaar in de tunnel en snijd het weefsel boven de zenuw. Ga verder snijden zijdelings, naar aanleiding van de zenuw, om het te isoleren. (Een paar millimeter is voldoende voor pinning het ganglion, maar bloot ten minste 5 mm van de AGN als u van plan op te nemen van.) </li><li> Maak de AGN van de spier innerveert het door het snijden van de verbindingen. </li><li> Herhaal aan de andere kant naar de andere AGN isoleren. </li><li> Zodra beide AGN&#39;s zijn ontleed, knip alle spieren en weefsel aansluiten van de STG naar de maag. </li></ol></li><li> Isoleer de mvn s. Ze zijn een bilaterale paar kleine zenuwen vertakken uit de lvn en doorkruisen lateraal onder het vet. <ol><li> Of gebruik schaar of twee pincet om door het vet afgesneden aan de ene kant van de DVN, de buurt waar hij takken in de twee lvn s. Hier bent u ver van de mvn s en zal niet het risico te knippen. </li><li> Til de vetlaag, en identificeren van de kleine mvn eronder. Deze zenuwen lopen mediaal naar lateraal juist achter het niveau van de gm1b spieren. </li><li> Verwijder de laag vet boven de mvn, waardoor de zenuw intact voor nu, zodat het niet zal verward raken. U snijdt de laterale uiteinde van buiten de maag aan het eind van de dissectie. </li><li> Herhaal dit proces aan de andere kant naar de andere mvn isoleren. </li></ol></li><li> Isoleer de lvn s en achterste zenuwen. <ol><li> Te beginnen waar de lvn s tak zijwaarts uit de DVN, een lvn te volgen door het snijden van de vet erboven. Afhankelijk van de voorbereiding, soms de hele dikke laag boven de zenuw kan worden getrokken. </li><li> Ga door het openbaren van de lvn tot het punt waar de PSN vertakt. </li></ol></li><li> Isoleer de pyn. <ol><li> Zoek de pyn, het is een zenuw reist achterzijde over de pylorus. </li><li> Verwijder het dunne membraan dat deze regio. </li><li> Isoleer de pyn door het snijden van een klein deel van de pylorus, verbonden aan de pyn. </li><li> Til de pyloris sectie en weggesneden het weefsel aan weerszijden van de pyn tot u bij de tak die hecht aan de PDN. </li></ol></li><li> Isoleer de PDN. <ol><li> Zoek het PDN, het is een zenuw reist achterzijde van de pyloric dilatator spier. </li><li> Snijd een klein deel van de pyloric dilatator spier, verbonden aan de PDN. </li><li> Til de pyloris dilatator spier gedeelte weggesneden het weefsel aan weerszijden van het PDN tot u bij de tak die hecht aan de pyn. </li></ol></li><li> Isoleer de ventrale lvn, dat de pyn en PDN wordt aangesloten op de LVN. <ol><li> Op het driehoekige tak punt waar de pyn en PDN te sluiten op de ventrale lvn, isoleren elk klein deel van de zenuw die zich vertakt uit de ventrale lvn, zoals de vpln. Deze zal worden gebruikt als een handvat te trekken op het ventrale lvn. </li><li> Lift op het handvat en wegknippen het weefsel aan weerszijden van de ventrale lvn, die werkzaam zijn in de anterieure richting tot aan het punt waar de PSN vertakt. </li></ol></li><li> Herhaal stap 10 - 13 tot en met de lvn en de achterste zenuwen aan de andere kant te isoleren. </li><li> Maak de stomatogastric zenuwstelsel van de maag. <ol><li> Om volledig los van de lvn van de maag, trek aan de PSN en snijd alle weefsels en zenuwen aan de lvn en ventrale lvn, met uitzondering van het PDN en pyn. Herhaal dit proces aan de andere kant. </li><li> Snijd de laterale einde van elke mvn. Til de laterale uiteinde en snij elke vreemde attachments tussen de zenuw en het onderliggende weefsel maag. </li><li> Aan het voorste einde, snijd elke vreemde bijlagen aan de commissural ganglia, en snijd de labiale zenuw aan elke kant. </li><li> Visueel scannen de stomatogastric zenuwstelsel systeem om vervolgens te identificeren en snijd eventuele bijlagen naar de maag weefsel. </li><li> Pak op het voorste einde van beide commissural zenuwen, boven de commissural ganglia, en schil de stomatogastric zenuwstelsel uit de maag en het verplaatsen naar de zijkant van de schotel. Als je dit doet, knip alle resterende bijlagen aan het zenuwstelsel vrij. </li></ol></li><li> Bereid de kleine Sylgard schotel. <ol><li> Grondig te wrijven sommige maag weefsel op het oppervlak van de Sylgard in de kleine schotel. Hierdoor neemt de hydrofobiciteit van de Sylgard, zodat zout gelijkmatig zal verdelen over de schotel. </li><li> Spoel en vul de Sylgard gerecht met gekoelde zoutoplossing. </li></ol></li><li> Overdracht van het zenuwstelsel naar de klaargemaakte Sylgard schotel grijpen de voorste uiteinden van beide commissural zenuwen, het opheffen van het zenuwstelsel uit de grote schaal, en tot in de kleine schotel. </li><li> Speld de STNS in de kleine schotel met een combinatie van minuten pinnen en dunnere pennen gesneden van wolfraam draad. <ol><li> Zorg ervoor dat de voorbereiding is dorsale zijde naar boven door te controleren of de mindere ventriculaire zenuw is weg van de Sylgard wijzen. </li><li> Verwijder de hersenen en speld de commissural zenuwen. </li><li> Trek het zenuwstelsel strak en plat door te trekken van elk van de PSN s posterior en lateraal, en spelden ze naar beneden. </li><li> Verwijder de pyloric dilatator spier van het PDN s, en speld de PDN s. </li><li> Verwijder hetpylorus segment van de pyn s, en speld de pyn s. </li><li> Vastpinnen de resterende geïsoleerde zenuwen, zoals de labiale zenuwen, de mvn s en AGN s. </li></ol></li><li> Desheath de STG. <ol><li> Zorg ervoor dat de STG plat tegen de Sylgard en hield strak door de laterale AGN s, de voorste en de achterste STN dvn. </li><li> Schik de verlichting aan visualisatie van de axonen mogelijk te maken binnen de dvn. </li><li> Met behulp van een kleine pin of fijne tungsten naald, maak een klein ondiep gaatje in schede rond de DVN, juist achter de STG. </li><li> Trek de naald over de dvn, dorsaal van de axonen, een horizontale scheur in de zenuw schede te creëren. </li><li> Pak de klep van zenuwschede posterior aan de STG en trek naar voren om de schede te verwijderen uit de dorsale zijde van de STG. </li></ol></li></ol><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Afkortingen: </td></tr><tr><td> STNS </td><td> Stomatogastric zenuwstelsel </td></tr><tr><td> STG </td><td> Stomatogastric ganglion </td></tr><tr><td> Cog </td><td> Commissural ganglion </td></tr><tr><td> stn </td><td> stomatogastric zenuw </td></tr><tr><td> mvn </td><td> mediale zenuw ventriculaire </td></tr><tr><td> ion </td><td> inferieur oesofageale zenuw </td></tr><tr><td> zoon </td><td> superieure oesofageale zenuw </td></tr><tr><td> AGN </td><td> anterior maag zenuw </td></tr><tr><td> dvn </td><td> dorsale zenuw ventriculaire </td></tr><tr><td> lvn </td><td> laterale ventrikel zenuw </td></tr><tr><td> PSN </td><td> posterior maag zenuw </td></tr><tr><td> vpln </td><td> ventrale posterior laterale zenuw </td></tr><tr><td> pyn </td><td> pyloric zenuw </td></tr><tr><td> PDN </td><td> pyloric dilatator zenuw </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Marder, E., Bucher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+pattern+generators+and+the+control+of+rhythmic+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Central pattern generators and the control of rhythmic movements.</a> Curr. Biol. 11, R986-R996 (2001).</li>
<li>Nusbaum, M. P., Beenhakker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-systems+approach+to+motor+pattern+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A small-systems approach to motor pattern generation.</a> Nature. 417, 343-350 (2002).</li>
<li>Clemens, S., Massabuau, J. C., Legeay, A., Meyrand, P., Simmers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+modulation+of+interacting+central+pattern+generators+in+lobster+stomatogastric+ganglion%3A+influence+of+feeding+and+partial+pressure+of+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo modulation of interacting central pattern generators in lobster stomatogastric ganglion: influence of feeding and partial pressure of oxygen.</a> J. Neurosci. 18, 2788-2799 (1998).</li>
<li>Bierman, H. S., Tobin, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gross+dissection+of+the+stomach+of+the+lobster%2C+Homarus+americanus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Gross dissection of the stomach of the lobster, Homarus americanus.</a> J Vis Exp. 27, (2009).</li>
<li>Maynard, D. M., Dando, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+stomatogastric+neuromuscular+system+in+Callinectes+sapidus%2C+Homarus+americanus+and+Panulirus+argus+%28Decapoda+crustacean%29%5BTitle%5D)+AND+%22Philos.+Trans.+R.+Soc.+Lond.+B+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">The structure of the stomatogastric neuromuscular system in Callinectes sapidus, Homarus americanus and Panulirus argus (Decapoda crustacean).</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 268, 161-220 (1974).</li>
<li>Herrick, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+history+of+the+American+lobster%5BTitle%5D)+AND+%22Bull.+U.S.+Bur.+Fish%22%5BJournal%5D)">Natural history of the American lobster.</a> Bull. U.S. Bur. Fish. 29, 219-252 (1909).</li>
<li>Marder, E., Bucher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+circuit+dynamics+using+the+stomatogastric+nervous+system+of+lobsters+and+crabs%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Understanding circuit dynamics using the stomatogastric nervous system of lobsters and crabs.</a> Annu. Rev. Physiol. 69, 291-316 (2007).</li>
<li>Bucher, D., Taylor, A. L., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+pattern+generating+neurons+simultaneously+express+fast+and+slow+rhythmic+activities+in+the+stomatogastric+ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Central pattern generating neurons simultaneously express fast and slow rhythmic activities in the stomatogastric ganglion.</a> J. Neurophysiol. 95, 3617-3632 (2006).</li>
<li>Mizrahi, A., Dickinson, P. S., Kloppenburg, P., Fénelon, V., Baro, D. J., Harris-Warrick, R. M., Meyrand, P., Simmers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+maintenance+of+channel+distribution+in+a+central+pattern+generator+neuron+by+neuromodulatory+inputs+revealed+by+decentralization+in+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Long-term maintenance of channel distribution in a central pattern generator neuron by neuromodulatory inputs revealed by decentralization in organ culture.</a> J. Neurosci. 21, 7331-7339 (2001).</li>
<li>Schulz, D. J., Goaillard, J. M., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variable+channel+expression+in+identified+single+and+electrically+coupled+neurons+in+different+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Variable channel expression in identified single and electrically coupled neurons in different animals.</a> Nat. Neurosci. 9, 356-362 (2006).</li>
<li>Schulz, D. J., Goaillard, J. M., Marder, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+expression+profiling+of+identified+neurons+reveals+cell-specific+constraints+on+highly+variable+levels+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Quantitative expression profiling of identified neurons reveals cell-specific constraints on highly variable levels of gene expression.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 13187-13191 (2007).</li>
</ol>

De anatomie van kreeft maag en STNS is goed eerder 5,6 beschreven, en variaties van deze dissectie procedure zijn gebruikt in talloze studies. We raden aan bekend te raken met de anatomie van de maag 5-7 en STNS 5,8 voor het begin van dissecties. Een dergelijke bekendheid zal verminderen het risico op accidentele schade aan de zenuwen en weefsel. Voor een duurzaam behoud van de gezondheid van de voorbereiding, is het essentieel om de voorbereiding te handhaven op een koele temperatuur. Dit is eenvoudig te bereiken door het uitwisselen van de zoute elke 30 minuten met 4 ˚ C zoutoplossing bewaard in een koelkast. Bij onderdompeling in koude zoutoplossing, de geïsoleerde STNS voorbereiding is haalbaar voor vele uren. Opnamen in verwante Homarus gammarus hebben aangetoond een stabiele ritmische activiteit van de STG heel 5 dagen in vitro 9, lijkt robuustheid werd gezien in H. americanus (pers. obs.). Modulerende input voor de STG van de commissural ganglia nodig is om de lopende motor patronen te behouden. Daarom, om een normale ritmische activiteit van deze ganglia en het ion, de zoon te onderhouden en STN zenuwen moeten intact blijven. De dissectie beschrijven we behouden een aantal motorische zenuwen (met motor neuron axons): de AGN s (met daarin Gastric Mill (GM) axonen), de mvn s (met daarin Laterale Gastric (LG) en Inferior Cardiac (IC) axonen), de pyn s (met pylorus neuron (PY) axonen), de PDN s (met pylorus Dilator (PD) axonen), en de lvn s (met daarin Laterale pylorus (LP), mediale maag (MG), LPG ​​axonen evenals die van GM, PD en PY). Door het ontleden van extra (of andere) zenuwen, kunnen andere motor neuron axonen worden opgenomen. Elke individuele type motor neuron axon kunnen individueel worden geregistreerd door het ontleden en opnemen van de zenuw innerveren de spier waarop die soort van neuron projecten. Dit preparaat kan worden gebruikt voor een verscheidenheid van studies gericht op het functioneren van het zenuwstelsel. De activiteit van de neuronen kan worden opgenomen hetzij met behulp van de intracellulaire, scherpe elektrode opnames van somata of axonen, of door het opnemen van elektrische impulsen extracellulair van de zenuwen. Veel ion kanalen in de STG neuronen zijn deels gekloond en mRNA kan gemeten worden vanuit de hand getrokken somata 10,11.

<table><tbody><tr><td>Fijn wolfraamdraad (0.001 in. diameter)</td><td>Instrument</td><td>California Fine Wire Company</td><td></td><td>In stukjes van 1-2mm knippen om als fijne pinnen te gebruiken.</td></tr><tr><td>Pincet #5</td><td>Instrument</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Minuten-pinnen</td><td>Instrument</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Moria-veerschaar (7mm bladen)</td><td>Instrument</td><td>Fine Science Tools</td><td>15370-52</td><td>Dit is het topmodel. Er zijn voordeligere veerscharen beschikbaar van hetzelfde bedrijf.</td></tr><tr><td>Petrischaal (100x15mm)</td><td>Instrument</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-12</td><td>Vul 2-4mm met Sylgard 182.</td></tr><tr><td>Sylgard 182</td><td>Overig</td><td>Dow Corning</td><td>182</td><td></td></tr><tr><td>Pinnhouder</td><td>Instrument</td><td>Fine Science Tools</td><td>26018-17</td><td>Optioneel. Het verwijderen van de omhulling kan ook alleen met een schaar en fijne pincetten.</td></tr><tr><td>Super fijne pincet #5SF</td><td>Instrument</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Wolfraamnaalden</td><td>Instrument</td><td>Fine Science Tools</td><td>10130-05</td><td>Optioneel. Het verwijderen van de omhulling kan met een schaar of met pinnen geknipt uit fijne wolfraamdraad.</td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

homarus americanus stomatogastric nervous system dissection

Homarus Americanus Stomatogastric Nervous System Dissection

Met het doel om te begrijpen hoe zenuwstelsel activiteit te produceren en te reageren op het milieu, neurowetenschappers wenden tot model systemen die de activiteit van belang vertonen en zijn toegankelijk en vatbaar voor experimentele methoden. Het stomatogastric zenuwstelsel (STNS) van de Amerikaanse kreeft (<i&gt; Homarus americanus</i&gt;; Weten ook was de Atlantische Oceaan of Maine kreeft) is opgericht als een modelsysteem voor de bestudering van het ritme het genereren van netwerken en neuromodulatie van netwerken. De STNS bestaat uit 3 anterior ganglia (2 commissural ganglia en een slokdarm ganglion), met modulerende neuronen die centraal project om de stomatogastric ganglion (STG). De STG bevat ongeveer 30 neuronen die twee centrale patroon genereren netwerken omvatten, de pylorus en het maag-netwerken dat het voeren van gedragingen in schaaldieren ten grondslag liggen aan<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Hoewel het mogelijk is om te studeren dit systeem<i&gt; In vivo</i<sup&gt; 3</sup&gt;, De STNS blijft zijn ritmische activiteit produceren wanneer geïsoleerd<i&gt; In vitro</i&gt;. Fysieke isolatie van de STNS in een schotel zorgt voor gemakkelijke toegang tot de somata in de ganglia voor intracellulaire elektrofysiologische opnames en om de zenuwen van de STNS voor de extracellulaire opnames. Het isoleren van de STNS is een tweedelig proces. Het eerste deel, het ontleden van de maag van het dier, is beschreven in een begeleidend artikel van video-<sup&gt; 4</sup&gt;. In deze video artikel, zijn prima dissectie technieken die worden gebruikt om de STNS van de maag te isoleren. Deze procedure resulteert in een zenuwstelsel preparaat dat beschikbaar is voor elektrofysiologische opnames.

We beschrijven de fijne ontleding van het stomatogastric zenuwstelsel uit de maag van de Amerikaanse kreeft (<i&gt; Homarus americanus</i&gt;).

Met het doel te begrijpen hoe zenuwstelsels activiteit genereren en reageren op de omgeving, maken neurowetenschappers gebruik van modelsystemen die de ...

De procedure voor het isoleren van het ST-gastrisch zenuwstelsel van de kreeft kan worden onderverdeeld in twee fasen: de grove en de fijne dissectie. Deze video behandelt de fijne dissectie van het somatische gastrische zenuwstelsel uit de maag, inclusief het steatogastrische ganglion, aangeduid als het STG, en de commissurale ganglia, aangeduid als de cgs. In essentie moeten de zenuwen en ganglia worden gescheiden van het omringende weefsel, beginnend met de isolatie van de cgs, gevolgd door de isolatie van het STG. Het resultaat van deze procedure is het systematische gastrische zenuwstelsel, vastgepind in een schaal en klaar voor gebruik in diverse studies gericht op de functie van het zenuwstelsel.Hallo, ik ben Annalise Tobin uit het laboratorium van Dr. Eve Martyr van de afdeling biologie aan de Brandeis University. Hallo, ik ben Hillary Burman, ook van het Martyr Lab. Vandaag laten we u een protocol zien voor het isoleren van het somatische gastrische zenuwstelsel uit de maag van de kreeft Homarus Americana om te zien hoe de maag is verwijderd.Bekijk ons bijbehorende videoprotocol in JoVE. Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de functie van neuronen in kleine neurale circuits bij het produceren van ritmisch gedrag te bestuderen. Laten we beginnen.Om te beginnen is een preparaat van de maag van de kreeft vereist om te zien hoe dit wordt uitgevoerd. Bekijk de bijbehorende video van Beerman en Tobin. Orienteer het preparaat eerst zo dat het binnenste uiteinde, bij de lip, van u af wijst en het achterste uiteinde naar u toe is gericht. Dit deel van de procedure begint met een preciezere fixatie van het preparaat met spelden.Zet de slokdarm aan weerszijden van de lip vast met pinnen en herschik indien nodig de andere pinnen die tijdens de grove dissectie zijn geplaatst, zodat de maag plat ligt. Verwijder vervolgens de hypodermis door deze eerst vast te pakken nabij de gm, de twee GM drie spieren, deze los te maken van deze spieren en voorzichtig in anterieure richting te trekken. Scheid de hypodermis van het onderliggende vet door alle verbindingen door te knippen met zorg rond de centrale arterie, die een deel van het somatische gastrische zenuwstelsel omsluit; laat de hypodermis intact.Binnen een straal van ongeveer 0,5 centimeter rond het somatische maagganglion, dat tussen de GM one B-spieren ligt, kan de gescheiden hypodermis nu worden weggesneden. De volgende stap is het losmaken van het brein van het onderliggende weefsel. Begin met het identificeren van de twee grote commissurnerven die bilateraal lopen vanaf het anterieure deel van het brein naar de commissumganglia in het anterieure deel van de maag.Laat deze zenuwen intact, til de hersenen voorzichtig op met een pincet en snijd om de hersenen van het resterende weefsel te scheiden. Wees hierbij voorzichtig, aangezien de somatische maagzenuw zich onder de hersenen bevindt en intact moet blijven. Om de commissurale ganglia van het omringende weefsel te scheiden, lokaliseert u deze eerst door een van de commissurale zenuwen naar een ganglion te volgen.Identificeer nu de ION en de SON. Deze zenuwen moeten intact blijven. Elk commissuraal ganglion zal vele uitstralende zenuwen hebben.Snijd er de meeste door, behalve de ION en SON. Laat één extra zenuw vastzitten om het commissurele ganglion op zijn plaats te houden terwijl u de dissectie voltooit. Lokaliseer nu de zenuwen van het andere commissurele ganglion en trim deze op dezelfde manier.Reinig vervolgens de ION en SON van lateraal naar mediaal. Laat de labiale zenuw intact om de preparatie aan de maag te verankeren. Het oesofageale ganglion bevindt zich bij de intersectie van de iOS.U kunt dit gebied vrijmaken door de inferieure ventriculaire zenuw vast te pakken en naar boven gericht onder deze door te snijden. De volgende stap is om de STG te scheiden van het omringende weefsel. De STG bevindt zich in een arterie die loopt tussen de GM 1 B-spieren en naar beneden naar de GM 2 a B-spieren.Zoek naar het doorgesneden uiteinde van de arterie nabij de gm. Trek de arterie met twee AB-spieren omhoog en naar binnen om de DVN bloot te leggen. Blijf omhoog trekken tot aan de resterende hypodermis.Zodra deze is gescheiden, kan de arterie worden ingekort tot op het niveau waar deze de resterende hypodermis raakt. Snijd nu de spierflap af die zich in het rostrum van de kreeft bevond. Til vervolgens de hypodermis boven de arterie op.De arterie vormt een tunnel in het vet, boven de STG. Plaats één blad van de schaar in de arterie en knip de spier erboven door.Controleer tijdens het snijden of de DVN zichtbaar is om er zeker van te zijn dat u veilig werkt. Boven de STG snijdt u verder in anteriore richting langs de slagader. Terwijl u boven de STG snijdt, zult u de STN zien die anterieur uit de STG naar voren komt en in de spier duikt.Snijd verder in anteriore richting om de spier boven de STG volledig te scheiden. Verwijder al het weefsel rondom de STN. Nu kunnen we verdergaan met het isoleren van enkele andere zenuwen.De volgende zenuwen die van het omliggende weefsel worden gescheiden, zijn de AGN's. Zelfs als u niet van plan bent om registraties van de AGN uit te voeren, heeft u een deel ervan nodig om het ganglion vast te pinnen. Om de AGN's beter te kunnen zien, verwijdert u de resterende hypodermis en een dunne laag van de onderliggende spier direct posterieur aan de STG.Zoek naar een donker tunnelvormig gebied in het vet en spierweefsel aan weerszijden van het DVN-staafje, plaats één schaarblad in de tunnel en knip het weefsel boven de zenuw door. Snijd lateraal verder langs de zenuw om deze te isoleren. Een paar millimeter is voldoende om het ganglion vast te pinnen, maar leg ten minste vijf millimeter van de A GN bloot als u van plan bent hier metingen te verrichten.Koppel de AGN los van de spier die deze innerveert door de verbindingen door te snijden. Herhaal dit proces nu aan de andere zijde om de andere AGN te isoleren. Zodra beide AGN's zijn gedissecteerd, snijdt u alle spieren en weefsels door die de STG met de maag verbinden. Isoleer vervolgens de M vns.Het gaat om een bilateraal paar kleine zenuwen die aftakken van de LVN en lateraal onder het vet lopen. Gebruik een schaar of twee pincetten om het vet aan één zijde van de DVN door te snijden, nabij het punt waar deze vertakt in de twee LVN's. Op deze positie bevindt u zich ver genoeg van de M VNS om het risico te vermijden deze door te snijden.Til de vetlaag op en zoek daaronder naar een kleine zenuw. De MVN loopt mediaal lateraal, net posterieur aan het niveau van de GM1-spieren. Verwijder de vetlaag boven de MVN en laat de zenuw voorlopig intact zodat deze niet in de knoop raakt.U snijdt het laterale uiteinde en eventuele verbindingen met de M VNS door aan het einde van de dissectie van het zenuwstelsel. Herhaal het proces aan de andere zijde om de andere MVN te isoleren. Vervolgens worden de LVN's in de posterieure zenuwen geïsoleerd.Begin bij de LVN's die zijwaarts aftakken van de DVN. Volg een LVN door het vet erboven weg te snijden. Afhankelijk van de preparatie kan de gehele vetlaag boven de zenuw soms worden verwijderd.Ga door met het vrijleggen van de LVN tot het punt waar de PSN aftakt. Lokaliseer nu de PYN. Dit is een zenuw die posterieur over de pori loopt.Verwijder het dunne membraan dat dit gebied bedekt. Isoleer de PYN door een klein gedeelte van de pori te knippen dat aan de PYN-can vastzit. Til vervolgens voorzichtig het pric-gedeelte op en knip het weefsel aan weerszijden van de PYN weg totdat u de vertakking bereikt die verbonden is met de PDN.Ga verder met het isoleren van de PDNA-zenuw die posterieur naar de m. dilator pupillae loopt. Snijd eerst een klein gedeelte van de m. dilator pupillae door dat aan de PDN vastzit. Til vervolgens voorzichtig het gedeelte van de m. dilator pupillae op.Snijd het weefsel aan weerszijden van de PDN weg totdat u de vertakking bereikt die verbonden is met de PYN. Lokaliseer nu de ventrale LVN die de PYN en PDN verbindt met de LVN bij het driehoekige vertakkingspunt waar de PYN en PDN aansluiten op de ventrale LVN. Isoleer elk klein zenuwgedeelte dat aftakt van de ventrale LVN, zoals de VPLN. Dit zal worden gebruikt als handvat om aan de ventrale LVN te trekken door aan het handvat te tillen.Snijd het weefsel aan weerszijden van de ventrale LVN weg in anteriore richting totdat u het punt bereikt waar de PSN zich afsplitst. U heeft nu de posterieure zenuwen aan één zijde van de maag succesvol gedissecteerd. Isoleer nu de LVN en de posterieure zenuwen aan de andere zijde.Koppel de LVN volledig los van de maag. Trek aan de PSN en snijd al het weefsel en de zenuwen door die vastzitten aan de LVN en ventrale LVN, met uitzondering van de PDN en PYN. Herhaal dit proces aan de andere zijde.Snijd vervolgens het laterale uiteinde van elke MVN door. Til het laterale uiteinde op en snijd alle aanhechtingen aan het anteriore uiteinde van de MVN door. Snijd alle aanhechtingen aan de comm ganglia door en snijd de labial nerve aan beide zijden door.Scan het somatische gastrische zenuwstelsel visueel om eventuele aanvullende aanhechtingen aan het maagweefsel te identificeren en vervolgens door te snijden. Zodra alle verbindingen zijn doorgesneden, kunt u het anterieure uiteinde van beide commis-zenuwen boven de commis-ganglia vastpakken om het somatische gastrische zenuwstelsel van de maag los te pellen en naar de zijkant van de schaal te verplaatsen. Snijd tijdens deze handeling eventuele overige aanhechtingen door om het zenuwstelsel volledig te bevrijden.De dissectie is nu voltooid. Begin met het voorbereiden van de agarplaat waaraan het zenuwstelsel zal worden vastgepind. Wrijf wat maagweefsel grondig over het oppervlak van de agar in de kleine schaal.Dit zal de hydrofobiciteit van de agar verminderen, zodat de zoutoplossing gelijkmatig over de schaal wordt verdeeld. Spoel de agarschale uit en vul deze met gekoelde zoutoplossing. Verplaats het zenuwstelsel naar de voorbereide agarschale door de voorste uiteinden van beide commissuranerven vast te pakken.Het zenuwstelsel uit de grote schaal tillen en in de kleine schaal plaatsen. Gebruik een combinatie van minutia-pinnen en dunnere pinnen om het zenuwstelsel vast te zetten. Snijd eerst uit wolfraamdraad; zorg ervoor dat het preparaat met de dorsale zijde naar boven ligt door te controleren of de inferieure ventriculaire zenuw van de syl guard af wijst.Verwijder nu de hersenen en zet de commissuurnerven vast met spelden. Trek het zenuwstelsel voorzichtig strak en vlak door elke PSN posterieur en lateraal te trekken en ze vast te pinnen. Verwijder vervolgens de P-dilatatorspier van de PNS en zet deze zenuwen vast met spelden.Verwijder vervolgens het pylorische segment van de GYNs en zet de GYNs vast met spelden. Zet tot slot alle overgebleven geïsoleerde zenuwen vast met spelden, zoals de labiale zenuwen, de m vns en de AGNs. De volgende stap is het opensnijden van de S st.Ten eerste moet u ervoor zorgen dat de S st G plat tegen de S guard ligt en strak wordt vastgehouden door de laterale AGN's. De anterieure STN en de posterieure DVN regelen de verlichting om visualisatie van de axonen binnen de DVN mogelijk te maken. Gebruik vervolgens een kleine pin of een fijne wolfraamnaald.Maak een klein, ondiep gaatje in de schede rondom de DVN, net posterieur aan de STG. Trek de naald over de DVN, dorsaal van de axonen, om een horizontale scheur in dezenerve schede te maken. Pak vervolgens een flap van de nerfschede posterieur aan de STG, trek deze anterieur en snijd deze door om de schede van de dorsale zijde van de STG te verwijderen.Zodra de schede is verwijderd, is het preparaat klaar voor experimenten, mits het preparaat gekoeld wordt bewaard tussen ongeveer 4 en 15 °C. Er is opgemerkt dat dit preparaat tot vijf dagen experimenteel stabiel blijft. Het intacte gastrische zenuwstelsel van de Sato moet met pinnen worden vastgezet tegen de Sylgard-schaal.Zoals getoond moeten de zenuwen vrij zijn van beschadigingen en toegankelijk zijn voor extracellulaire registraties. De cellichamen van het intacte STG moeten zichtbaar en toegankelijk zijn voor intracellulaire registraties. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u het somatische gastrische zenuwstelsel van de kreeft Homa Americana isoleert.Bij het uitvoeren van deze dissectie is het belangrijk om zeer bekend te raken met de anatomie om beschadiging van weefsels en zenuwen te voorkomen. Daarnaast is het cruciaal om het preparaat op een koele temperatuur te houden, overal tussen de 4 en 15 °C. Dit kan tijdens de dissectie eenvoudig worden bereikt door de zoutoplossing elke half uur te vervangen door koele zoutoplossing die u in de koelkast bewaart bij 4 °C, zodat het preparaat gekoeld blijft.Het blijft uren tot dagen levensvatbaar. Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

homarus-americanus-stomatogastric-nervous-system-dissection

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Het stomatogastric zenuwstelsel (STNS) van de Jona krab...

Kanker Borealis Stomatogastric Nervous System Dissection

We beschrijven de bruto-dissectie van de maag van de Amerikaanse kreeft...

Bruto Dissectie van de maag van de Kreeft, Homarus Americanus</em

Het primaire doel van dit experiment is om te begrijpen hoe de primaire sensorische neuronen informatie van gezamenlijke bewegingen en posities als proprioceptieve informatie voor een dier over te brengen. Een bijkomende doelstelling van dit rapport aanwezig is de anatomie van de voorbereiding door dissectie en het bekijken van neuronen in een dissectie microscoop.

Muscle Receptor Orgels in de rivierkreeftjes Buik: Een Student Laboratorium Oefening in Proprioceptie

Hier presenteren we de methodologie voor een snelle en hoge resolutie tl-voltage-gevoelige kleurstof in beeld brengen van gedetailleerde activiteit van neuronen in de krab stomatogastric ganglion.

Optische beeldvorming van neuronen in de Krab Stomatogastric Ganglion met voltage-gevoelige kleurstoffen

We beschrijven de ontleding van het zenuwstelsel van het mariene...

Isolatie van sensorische neuronen van<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Voor Patch Clamp Recordings van Glutamaterge Currents

Prikken herstellen motoriek na een complete dwarslaesie. Sommige spinale-projecterende neuronen goed regeneratoren en andere niet. Dit document illustreert de technieken voor huisvesting zeeprik larven (en onlangs omgebouwd volwassenen), het produceren van volledige ruggenmerg doorsnijdingen en het voorbereiden wholemount hersenen en ruggenmerg voor in situ hybridisatie.

Compleet ruggenmergletsel en Brain Dissection Protocol voor Latere Wholemount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie in Larvale Overzeese Lamprei

Hier beschrijven we de dissectie van de abdominale zenuwstreng van rivierkreeft. We demonstreren ook een elektrofysiologische techniek om fictieve voortbeweging op te nemen vanuit zwembeenmotorneuronen.

De Swimmeret Systeem van rivierkreeftjes: Een praktische gids voor de dissectie van de Nerve Koord en extracellulaire Opnamen van de Motor van het Patroon

Gedragstests bieden krachtige hulpmiddelen voor het begrijpen van neuronale functie. Hier presenteren we verschillende protocollen voor het kwantificeren van roofzuchtig voedingsgedrag dat wordt aangetroffen in het modelrondworm Pristionchus pacificus en zijn verwanten. Bovendien bieden we methoden voor het analyseren van roofzuchtige voedingsaanpassingen, inclusief mondstructuren en tanden.

Het testen van Predatory Feeding gedrag in<em&gt; Pristionchus</em&gt; En andere Nematoden

Hier presenteren we een protocol voor minimaal invasieve chirurgische lesioning van spieren intrinsiek aan het Voer apparaat van de mariene weekdieren Aplysia californica om de rollen van deze spieren te begrijpen tijdens het voeden gedrag.

Een minimaal invasieve laesie techniek voor de intrinsieke spieren van de Odontophore van Aplysia californica

Dit protocol presenteert een methode voor het weergeven van neuronale populatieactiviteit met eencellige resolutie bij niet-transgene ongewervelde soorten met behulp van absorptiespanningsgevoelige kleurstoffen en een fotodiode array. Deze aanpak maakt een snelle workflow mogelijk, waarbij beeldvorming en analyse in één dag kunnen worden nagestreefd.

Op fotodiode gebaseerde optische beeldvorming voor het opnemen van netwerkdynamica met single-neuronresolutie in niet-transgene ongewervelde dieren

Leer de fijne dissectie van het stomatogastrische zenuwstelsel bij de Amerikaanse kreeft Homarus americanus. Deze methode is essentieel voor neurobiologisch onderzoek naar neuronale functie en ritmisch gedrag.

Homarus Americanus Stomatogastric Nervous System Dissection

Meer video's verkennen