Name: Proteomics om eiwitten Interactie met P2X2 ligand-gated kationenkanalen identificeren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-18T23:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 36 s
Description: Leer een proteomics-methode om eiwitinteracties met P2X2-receptoren te identificeren met behulp van GST-pull-down en massaspectrometrie. Dit protocol helpt onderzoekers bij het ontrafelen van signaalroutes in het zenuwstelsel.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SW en TMV worden ondersteund door de NCRR en NHLBI bij de National Institutes of Health. BSK en HS worden ondersteund door de NINDS en NIGMS van de National Institutes of Health.

Experimentele procedures De experimentele procedure (figuur 2) bestaat uit vier onderdelen die hieronder worden beschreven in een stapsgewijze manier. Deel 1: subkloneren en expressie van de C-terminus van P2X2 receptoren. We hebben geuit over de volle lengte C-terminus van P2X2 receptoren in bacteriën naar de hersenen eiwitten waaraan het bindt identificeren. <ol><li> De C-terminus (residuen 353-472) van de P2X2 receptor (figuur 1) werd geamplificeerd door PCR, gekloneerd in pGEX 4NT1 (GE Life Sciences) en geverifieerd met sequencing. </li><li> Het recombinante plasmide werd getransformeerd in E. Coli (BL21) voor de expressie van recombinante eiwitten. </li><li> Glycerol voorraden van bacteriën (E. coli BL21) met de P2X2 CT-GST plasmide werden geschraapt met een steriele pipet tip en geënt in 5 ml Luria-Bertani (LB) media met geschikte selectieve marker (50 g / ml ampicilline) en &#39;s nachts geïncubeerd in een orbitale schudder bij 37C. </li><li> De kweken gedurende de nacht gekweekt werden geïnoculeerd in 250 ml van LB media met een geschikte antibioticum (50 ug / ml ampicilline) en geïncubeerd in een orbitale schudder bij 250 rpm gedurende 2-3 uur bij 37 ° C tot de optische dichtheid bij 600 nm bereikt ~ 0,6-0,7. </li><li> De cultuur werd geïnduceerd met 1 mM van IPTG en verder geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 3 uur voor eiwitexpressie. </li><li> De cultuur werd daarna gecentrifugeerd bij 5000 g gedurende 15 min bij 4C (1 ml van de cultuur was gered voor het analyseren van het expressieniveau en gelabeld als &#39;geïnduceerde&#39;). Supernatant werd weggegooid en de pellet werd geresuspendeerd in 20 ml van Saline Tris-EDTA (STE) buffer (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA pH 8,0). </li><li> De suspensie werd gecentrifugeerd bij 5000 g gedurende 15 min in een 50 ml falcon buis. Het supernatant werd verwijderd en de semi-droge pellet werd ingevroren bij-70C &#39;s nachts. </li><li> De 70C-pellet werd geresuspendeerd in 40 ml ijskoud lysis buffer (2% (w / v) Sarkosyl, 15 mg lysozym, 150 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7,5, 5 mM DTT en complete protease remmer tablet) , en de suspensie werd geïncubeerd op ijs gedurende 30 minuten. Tijdens deze incubatie werden de 3 ml Glutathion-Sepharose 4B parels gewassen met 20 ml fosfaatbuffer Saline (PBS) en 20 ml T-PBS (0,1% (v / v) tritonX-100 in PBS), gevolgd door PBS. De kralen werden geresuspendeerd in 1 ml PBS. </li><li> De bacteriële suspensie werd bevroren en ontdooid 3 keer in vloeibare stikstof en gesoniceerd (1s aan / uit, 30 micron gedurende 3 minuten op ijs) en verder geïncubeerd gedurende 30 minuten met 4% (v / v) Triton X-100, 10 mM MgSO 4 en 2 mM ATP op het ijs. </li><li> Het lysaat werd gesponnen bij 20.000 g gedurende 15 minuten bij 4C en pellet werd weggegooid (een monster van pellet en 1 ml supernatant werd bewaard voor SDS pagina kunt u de hoeveelheden eiwitten te testen in cytosol en membranen). Het supernatant werd geïncubeerd met de kralen van een uur (of &#39;s nachts) in 4C. </li><li> De kralen werden gesponnen bij 500 g gedurende 5 minuten en het supernatant werd verwijderd (monster werd bewaard voor ongebonden fractie). De kralen werden gewassen met T-PBS vijf keer (wasbeurten werden opgeslagen voor wassen controles). </li><li> De parels werden vervolgens geresuspendeerd in PBS tot 50% (w / v) geven drijfmest en opgeslagen in de koelkast bij 4C tot gebruik. De eiwitconcentratie werd geschat door Bradford assay (per fabrikant). </li></ol> Deel 2: Voorbereiding van de gehele hersenen lysaten P2X2 receptoren is bekend dat ze overvloedig worden uitgedrukt in de hersenen 8. In de huidige analyses hebben we getracht de eiwitten interageren met P2X2 receptoren van ratten hele brein lysaten (afb. 3) te identificeren. <ol><li> Volwassen hersenen van de rat werd geoogst (dieren werden geofferd volgens een UCLA IAACUC-goedgekeurde protocol en volgens de NIH Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren) en gespoeld meteen ijskoud PBS (3X). </li><li> Om de cellen te lyseren 10 ml (~ 5 maal het natte gewicht van de geoogste hersenen) van de ijskoude lysis buffer die 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM NaF, 1 mM Na 3 VO 4, 1 mM PMSF, 5 ng / ml leupeptin, was 1% (v / v) NP-40, en een proteaseremmer cocktail tablet toegevoegd aan de geoogste hersenen. </li><li> Hersenweefsel werd gehomogeniseerd op ijs met een glas Dounce homogenisator tot een homogeen mengsel van de consistentie werd bereikt. </li><li> Cellysaat werd gesponnen bij 2000 g gedurende 5 minuten om de ongebroken cellen te verwijderen. Het supernatant werd verzameld en gesponnen weer bij 29.000 g gedurende 60 minuten aan intacte organellen en membraan aggregaten te verwijderen. </li><li> Onmiddellijk na het centrifugeren van de supernatant werd overgebracht naar een schone buis. Het eiwit concentratie van het gehele brein lysaat werd gemeten door Bradford assay (meestal ~ 15 mg / ml). </li><li> Het lysaat werd gealiquoteerd en opgeslagen bij-70C. </li></ol> Deel 3: Isolatie van P2X2 C-staart geassocieerde eiwitten Het identificeren van de binding partners van P2X2 CT-GST van hele brein lysaten, een pull-down test werd uitgevoerd met behulp van CT-GST geïmmobiliseerd op glutathion Sepharose 4B parels als lokaas. Voor de controles, werd GST alleen gebonden aan kralen gebruikt. <ol><li> Brain lysaat werd precleared met GST kralen gedurende 1 uur bij 4C. De pellet werd verwijderd en het supernatant werd gebruikt voor verdere analyses. </li><li> Gelijke hoeveelheden van de GST en P2X2 CT-GST (10 ug) gebonden aan glutathion sepharose 4 B kralen werden gedurende de nacht geïncubeerd met 100 g precleared opgeloste eiwitten uit de rat hele brein lysaat, met rotatie in 4C in de lysis buffer. </li><li> Kralen werden gesponnen bij 1000 g gedurende 5 minuten en het supernatant werd weggegooid. </li><li> De kralen werden eenmaal gewassen met de lysis buffer en gekookt in gewijzigde Laemli buffer [4% (w / v) SDS, 10% (v / v) 2-mercapto-ethanol, 2% (v / v) glycerol, 0,004% (w / v) broomfenolblauw en 0,125 M TrisCl pH 6,8] gedurende 5 minuten. </li><li> De monsters werden gecentrifugeerd bij 5000 g gedurende 5 minuten en het supernatant gescheiden door 10% SDS-PAGE (afb. 4). Gels werden gekleurd met SYPRO Ruby eiwitgel vlek (volgens de instructies van de fabrikant) en zichtbaar onder ultraviolet licht. P2X2 CT-geassocieerde eiwitten werden vergeleken met teruggevonden die gebruik maken van GST-null als lokaas. Vier biologische repliceert werden uitgevoerd (dat wil zeggen vier hersenen en vier onafhankelijke pull downs). </li></ol> Deel 4: Identificatie van eiwitten. Eiwitten worden gescheiden door gel-elektroforese werden uitgesneden uit de gel en geïdentificeerd door middel van massaspectrometrie 12. Opmerking: afwezigheid van stof tijdens het gehele proces is van cruciaal belang voor keratine besmetting te verminderen. De experimentator moet dragen een gezichtsmasker, haar netto en handschoenen te allen tijde en nooit de gel gebied van belang contact zonder het gebruik van handschoenen. <ol><li> Alle zichtbare eiwitbanden hersteld van de P2X2 pull-down werden uitgesneden met een schone scheermesje en in blokjes gesneden (afb. 4). Overeenkomstige regio&#39;s van de gel in het GST-null pull-down laan werden ook besneden op dezelfde manier zonder rekening te houden band vlekken (banden specifiek voor de GST-null lokaas werden ook uitgesneden en geïdentificeerd) om dat de aanwezigheid van eiwitten te verzekeren onder het niveau van vlekken gevoeligheid was niet gemist. </li><li> De gel stukken werden geïncubeerd met 200 ul van 50 mM ammoniumbicarbonaat in 50% (v / v) acetonitril (ACN) en de buizen gevortexed gedurende 15 min bij RT. Herhaal deze wasstap. </li><li> De gel stukken werden ontwaterd door toevoeging van 200 ul acetonitril (gel stukken moeten krimpen en worden ondoorzichtig in kleur). </li><li> Acetontrile werd verwijderd en de gel stukjes gedroogd in een speedvac voor ~ 10 minuten. </li><li> De gel stukken werden vervolgens geïncubeerd met 30 ul van de vers bereide 10 mM DTT/10 mM Tris (2-carboxy-ethyl) fosfine hydrochloride (TCEP) van voldoende volume om de stukken onder te dompelen. Dit bleef gedurende 30 min bij 56c waterbad. </li><li> Vervolgens wordt de DTT-oplossing werd vervangen door 100 ul 500 mM ammoniumbicarbonaat in 50% acetonitril-oplossing en de gel plakjes gewassen met ammounium bicarbonaat. </li><li> Het wassen oplossing werd opgezogen en 200 ul van acetonitril toegevoegd aan de gels uitdrogen. </li><li> Acetonitril werd vervolgens verwijderd en 100 ul vers bereide 100 mM joodacetamide oplossing werd toegevoegd aan gratis sulfhydryls alkylaat. Deze stap ging gedurende 25 minuten bij kamertemperatuur in het donker. </li><li> Joodacetamide oplossing werd verwijderd en de gel stukken werden gewassen met 200 ul van 50 mM ammoniumbicarbonaat in 50% acetontrile (pH 8,0) gedurende 2 minuten, terwijl vortexen. Deze wasstap werd herhaald. </li><li> Na het verwijderen van de wasoplossing, werden de stukken gel geïncubeerd met 200 ul acetonitril, die vervolgens werd door speedvac verwijderd voor ~ 10min. </li><li> Bij deze stap de gel stukken zijn klaar voor trypsine spijsvertering. Gel stukken werden geïncubeerd in 30 ul trypsine oplossing (20 ng / ul werk concentratie) en op ijs geplaatst gedurende 10 minuten voor de gels goed te gezwollen. Overtollig trypsine werd verwijderd en gerehydrateerd gel deeltjes bedekt met 30 ul met 50 mM ammoniumbicarbonaat om ze ondergedompeld in heel de spijsvertering, die mocht voor 12 tot 16 uur te gaan op 37C. </li><li> Vijf ul van 5% (v / v) Mierenzuur wordt toegevoegd aan de trypsine en arrestatie spijsvertering uit te schakelen. </li><li> Buizen werden vortex voor ~ 15 min en gecentrifugeerd kort om de vloeistof te brengen naar de bodem van de buis, die vervolgens werd overgebracht naar een schone en gelabeld 0,5 ml flacon. </li><li> Volgende 30 pi van 0,1% (v / v) Mierenzuur in 50% acetonitril werd toegevoegd aan gel stukken, zodat ze waren net bedekt, gevolgd door vortexen tweemaal voor 10-15 minuten, van elkaar gescheiden door korte centrifugeren. Deze stap was een keer herhaald, ter vervanging van het mierenzuur-acetonitril tussen de stappen. </li><li> De laatste vloeistof werd verwijderd en alle extractie-oplossing gecombineerd in een enkele flacon. Dit volume werd teruggebracht tot ~ 30 ul in de speedvac. Het monster was nu klaar voor reverse phase nano-vloeistofchromatografie en eiwit-identificatie door massa-spectrometrie. In dit specifieke voorbeeld, is deze stap uitgevoerd op een Orbi-trap tandem massaspectrometer van ThermoFisher (gekozen voor de hoge nauwkeurigheid van massa&#39;s, snelle duty cycle voor eiwit detectie en in het algemeen robuuste operationele functies), hoewel andere modellen en fabrikanten instrumenten gemakkelijk kunnen worden gekoppeld aan de beschreven aanpak op dit punt. </li><li> De details en de criteria voor massaspectrometrische analyses worden nu kort voorgesteld. Alle peptiden werden gescheiden door omgekeerde fase nano-LC (Eksigent) en peptiden werden geladen op een C18 reverse-fase kolom met een debiet van 3 pl / min. Mobiele fase A was 0,1% mierenzuur en 2% ACN in water; mobiele fase B was 0,1% mierenzuur en 20% water in ACN. Peptiden werden geëlueerd uit de kolom met een debiet van 220 nl / min met behulp van een lineaire gradiënt van 5% B tot 50% B meer dan 90 min, daarna tot 95% B over 5 min, en uiteindelijk constant houden 95% B gedurende 5 minuten . Spectra werden verworven in data-afhankelijke modus met de Orbi-trap gebruikt voor MS-scans en LTQ voor MS / MS scans. Peptiden werden geïdentificeerd door te zoeken op de spectra tegen de rat BIV-database v.3.53 het gebruik van de Sequest algoritme geïntegreerd in de BioWorks softwarepakket. Elke peptide voldoet aan de volgende criteria: XCorr ≥ 2 (+1), ≥ 3 (+2), ≥ 4 (+3), en DeltaCN&gt; 0,1. Alle spectra gebruikt voor de eiwit-identificatie werden handmatig gecontroleerd en geen eiwitten geaccepteerd wanneer er minder dan twee peptiden werden geïdentificeerd. Alleen eiwitten die aanwezig zijn na elke van de vier P2X2 trekken downs en afwezig tijdens de GST-null pull downs werden beschouwd voor verdere analyse. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1178/1178fig1.jpg" alt="figuur 1" /> Figuur 1. Schematische weergave van een P2X2 receptor subeenheid. A. De cartoon illustreert de topologie van een P2X2 receptor subeenheid. De cytosolische domein bestaat uit N-en C-termini. De C-terminus van P2X2 receptor (rood) werd gebruikt als aas voor de pull-down-test. B. aminozuursequentie van de P2X2 receptor C-terminus in deze studie gebruikt. <img src="/files/ftp_upload/1178/1178fig2.jpg" alt="" /> Figuur 2. Stroomschema en de tijd lijn van het protocol wordt gebruikt voor expressie, zuivering, pull down en identificatie van eiwitten. We tonen de contouren van het protocol met de tijd lijn. Volwassen hersenen van de rat lysaat werd vers bereid vlak voor het gebruik voor de pull-down assays. <img src="/files/ftp_upload/1178/1178fig3.jpg" alt="" /> Figuur 3. Schematische weergave van de binaire proteoomanalyse van P2X2 C-terminus netwerk in de hersenen van de rat. De C-terminus van P2X2 receptoren gefuseerd met GST-eiwit gebonden aan GST kralen werd gebruikt voor het pull-down assays. Brain lysaat werd voorbereid en eiwitten werden geïncubeerd met de geïmmobiliseerde recombinante eiwitten. Niet-gebonden fractie werd gewassen met de lysis buffer. Eiwitten werden geïdentificeerd door massa-spectrometrie. <img src="/files/ftp_upload/1178/Fig%204%20Singh%20et%20al.jpg" alt="" /> Figuur 4. Identificatie van binding partners van de C-terminus van P2X2 receptoren. Sypro gekleurde gel met een spectrum van vermeende eiwitten die interageren met de C-terminus van receptoren gefuseerd met GST (blauwe doos). Controles rijstroken voor GST alleen (geel doos) en glutathion sefarose kralen alleen worden ook getoond. De pijlen geven voorbeelden van unieke bands die waren voor verdere analyse uitgesneden door massa-spectrometrie.

<ol><li>Hille, B. Ion channels of excitable membranes. , 3rd edition, Sinauer Associates Inc. Sunderland Massachusetts, USA. (2001).</li>
<li>Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+physiology+of+P2X+receptors+and+ATP+signalling+at+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular physiology of P2X receptors and ATP signalling at synapses.</a> Nat Rev Neurosci. 2, 165-174 (2001).</li>
<li>Egan, T. M., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+calcium+ions+to+P2X+channel+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Contribution of calcium ions to P2X channel responses.</a> J Neurosci. 24, 3413-3420 (2004).</li>
<li>Burnashev, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+permeability+of+ligand-gated+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Calcium permeability of ligand-gated channels.</a> Cell Calcium. 24, 325-332 (1998).</li>
<li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling.</a> Cell. 131, 1047-1058 (2007).</li>
<li>Levitan, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+protein+complexes+associated+with+neuronal+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Signaling protein complexes associated with neuronal ion channels.</a> Nat Neurosci. 9, 305-310 (2006).</li>
<li>Khakh, B. S., North, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P2X+receptors+as+cell-surface+ATP+sensors+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">P2X receptors as cell-surface ATP sensors in health and disease.</a> Nature. 442, 527-532 (2006).</li>
<li>Roger, S., Pelegrin, P., Surprenant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitation+of+P2X7+receptor+currents+and+membrane+blebbing+via+constitutive+and+dynamic+calmodulin+binding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Facilitation of P2X7 receptor currents and membrane blebbing via constitutive and dynamic calmodulin binding.</a> J Neurosci. 28, 6393-6401 (2008).</li>
<li>North, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+physiology+of+P2X+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Molecular physiology of P2X receptors.</a> Physiol Rev. 82, 1013-1067 (2002).</li>
<li>Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+union+of+pharmacology.+XXIV.+Current+status+of+the+nomenclature+and+properties+of+P2X+receptors+and+their+subunits.%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">International union of pharmacology. XXIV. Current status of the nomenclature and properties of P2X receptors and their subunits.</a> Pharmacol Rev. 53, 107-118 (2001).</li>
<li>Young, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+shape%2C+architecture+and+size+of+P2X4+receptors+determined+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular shape, architecture and size of P2X4 receptors determined using fluorescence resonance energy transfer and electron microscopy.</a> J Biol Chem. 283, 26241-26251 (2008).</li>
<li>Edmondson, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C+epsilon+signaling+complexes+include+metabolism-+and+transcription%2Ftranslation-related+proteins%3A+complimentary+separation+techniques+with+LC%2FMS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Protein kinase C epsilon signaling complexes include metabolism- and transcription/translation-related proteins: complimentary separation techniques with LC/MS/MS.</a> Mol Cell Proteomics. 1, 421-433 (2002).</li>
<li>Evans, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthosteric+and+allosteric+binding+sites+of+P2X+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Orthosteric and allosteric binding sites of P2X receptors.</a> Eur Biophys J. 38, 319-327 (2009).</li>
</ol>

Ion kanalen zijn een belangrijke klasse van integrale membraaneiwitten. Ze bevatten met water gevulde poriën die selectief toestaan ​​dat de beweging van ionen neer hun elektrochemische gradiënten het plasmamembraan. Ionkanalen hek tussen open en de gesloten staten. De gating stap wordt geactiveerd door zenders (bijv. ATP) in geval van P2X ligand gated ionkanalen, of het kan worden gereguleerd door interacties met andere eiwitten. Het laatste decennium is getuige geweest van een toename van ons begrip van hoe P2X recept...

<table><tbody><tr><td>Acetonitril</td><td>Reagens</td><td>JT Baker</td><td>9829-02</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>Reagens</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0156</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td>Reagens</td><td>VWR international</td><td>VW1507-01</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumbicarbonaat</td><td>Reagens</td><td>Fluka</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfaat (APS)</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Adenosinetrifosfaat (ATP)</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>Bradford-reagens</td><td>Reagens</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>Bromofenolblauw</td><td>Reagens</td><td>Fisher Scientific</td><td>B-392</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie blue R-250</td><td>Reagens</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>Sc-24972</td><td></td></tr><tr><td>Ditiothreitol (DTT)</td><td>Reagens</td><td>EMD Millipore</td><td>3860</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiaminetetraazijnzuur (EDTA)</td><td>Reagens</td><td>VWR international</td><td>VW1474-01</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenglycoltetraazijnzuur (EGTA)</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E8145</td><td></td></tr><tr><td>Mierenzuur</td><td>Reagens</td><td>EMD Millipore</td><td>11670-1</td><td></td></tr><tr><td>Glutathion-Sefarose 4B-beads</td><td>Reagens</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5132-01</td><td></td></tr><tr><td>Zoutzuur (HCl)</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15502</td><td></td></tr><tr><td>Jodoacetamide</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB) medium</td><td>Reagens</td><td>EMD Millipore</td><td>1.00547.5007</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptine</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8511</td><td></td></tr><tr><td>Lysozym</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>62971</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfaat (MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride (NaCl)</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Natriumfluoride (NaF)</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7920</td><td></td></tr><tr><td>Natriumorthovanadaat (Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;VO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40</td><td>Reagens</td><td>Fluka</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF)</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Proteaseremmertablet</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8820</td><td></td></tr><tr><td>Proteïnestandaard</td><td>Reagens</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0305</td><td></td></tr><tr><td>Sarkosyl</td><td>Reagens</td><td>Acros Organics</td><td>61207</td><td></td></tr><tr><td>Flesje met schroefdop</td><td>Instrument</td><td>Agilent Technologies</td><td>5182-0866</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfaat</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4509</td><td></td></tr><tr><td>SYPRO&amp;#174; Ruby proteïneglodiering</td><td>Reagens</td><td>Bio-Rad</td><td>170-3125</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&amp;rsquo;,N&amp;rsquo;-tetramethylethylendiamine (TEMED)</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Reagens</td><td>Promega Corp.</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5927</td><td></td></tr><tr><td>Water</td><td>Reagens</td><td>Burdick &amp;amp; Jackson</td><td>365-4</td><td></td></tr><tr><td>LTQ-Orbitrap tandem massaspectrometer</td><td>Instrument</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nano-vloeistofchromatografiesysteem</td><td>Instrument</td><td>Eksigent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>β-Mercapto&amp;#8211;ethanol</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td></td><td>EMD Millipore</td><td>GX0185-6</td><td></td></tr></tbody></table>

proteomics om eiwitten interactie met p2x2 ligand-gated kationenkanalen identificeren

Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels

Ligand-gated ionkanalen ten grondslag liggen aan de synaptische communicatie in het zenuwstelsel 1. Bij zoogdieren zijn er drie families van ligand-gated kanalen: de Cys lus, de glutamaat-gated en de P2X receptor kanalen 2. In elk geval binding van de zender leidt tot de opening van een porie waardoor ionen naar beneden stromen hun elektrochemische gradiënten. Veel ligand-gated kanalen zijn ook doorlaatbaar voor calciumionen 3, 4, die stroomafwaarts hebben signalering rollen 5 (bijv. gen regulatie), die de duur van het kanaal opening kan overschrijden. Zo ligand-gated kanalen kunnen signaal over een brede tijdschalen variërend van enkele milliseconden tot enkele dagen. Gezien deze belangrijke rol is het noodzakelijk om te begrijpen hoe ligand-gated ionkanalen zelf worden geregeld door eiwitten, en hoe deze eiwitten kunnen afstemmen signalering. Recente studies tonen aan dat vele, zo niet alle, kanalen kan een deel van eiwit signalisatie complexen 6. In dit artikel leggen we uit hoe je de eiwitten die binden aan de C-terminale aspecten van de P2X2 receptor cytosolische domein te identificeren. P2X receptoren zijn ATP-gated kation kanalen en bestaat uit zeven subeenheden (P2X1-P2X7). P2X receptoren worden op grote schaal tot uitdrukking in de hersenen, waar ze bemiddelen excitatoire synaptische transmissie en presynaptische facilitatie van neurotransmitters 7. P2X receptoren zijn gevonden in prikkelbaar en niet-opgewonden cellen en bemiddelen belangrijke rol bij neuronale signalering, ontstekingen en cardiovasculaire functie 8. P2X2 receptoren zijn overvloedig in het zenuwstelsel 9 en zijn de focus van deze studie. Elke P2X subeenheid wordt gedacht aan twee membraan verspreid over segmenten (TM1 en TM2), gescheiden door een extracellulaire regio 7 en intracellulaire N-en C-termini (afb. 1a) 7 bezitten. P2X subunits 10 (P2X1-P2X7) tonen aan 30-50% sequentiehomologie op het aminozuur level 11. P2X receptoren bevatten slechts drie subeenheden, dat is de eenvoudigste stoichiometrie onder ionotrope receptoren. De P2X2 C-terminus bestaat uit 120 aminozuren (Figuur 1b) en bevat verschillende eiwitten docking consensus sites, ondersteunen de hypothese dat P2X2 receptor kan deel uitmaken van signalering complexen. Hoewel een aantal functies zijn toegeschreven aan de C-terminus van P2X2 receptoren 9 geen enkele studie heeft beschreven de moleculaire partners die paar om de intracellulaire kant van dit eiwit via de volledige lengte C-terminus. In deze methoden paper beschrijven we een proteoom benadering van de proteïnen die interageren met de volledige lengte C-terminus van P2X2 receptoren te identificeren.

Beschrijven we een eenvoudig protocol om de hersenen eiwitten die zich binden aan de volledige lengte C-terminus van de ATP-gated P2X2 receptoren te identificeren. De uitbreiding en systematische toepassing van deze aanpak op alle P2X receptoren zal naar verwachting leiden tot een beter begrip van P2X receptor signalering.

Proteomics om eiwitten Interactie met P2X2 ligand-gated kationenkanalen identificeren

Ligand-gestuurde ionkanalen vormen de basis voor synaptische communicatie in het zenuwstelsel1. Bij zoogdieren zijn er drie families van ligand-gestuurde kanalen: de cys ...

Deze procedure begint met de overexpressie van het recombinante C-terminus van de purinerge P2X-receptor of P2X2, ontwikkeld als een GST-fusie-eiwit, gevolgd door bacteriële lyse. Het gezuiverde eiwit wordt geïncubeerd met glutathione sepharose 4B-beads, waarna de concentratie wordt bepaald met de Bradford-methode. Vervolgens worden eiwitten uit gezuiverd rattenhersenlysaat geïncubeerd met de C-terminus van P2X2-receptoren die gebonden zijn aan glutathione sepharose-beads; eiwitcomplexen die gebonden zijn aan de C-terminus van P2X2-receptoren worden geïsoleerd via SDS-PAGE-gelelektroforese en excisie, en worden vervolgens geïdentificeerd middels massaspectrometrie.Hallo, ik ben Harpring van het laboratorium van JIT K van de afdeling Fysiologie aan de University of California Los Angeles. Hallo, ik ben Sarah Walburn van het laboratorium van Tom Vka van de afdeling Anesthesiologie aan de University of California Los Angeles. Vandaag laten we u de procedure zien om de CTS van P2X2-receptoren te isoleren en te zuiveren.We gebruiken deze eiwitten om de in van de rode hersenen te identificeren en in ons laboratorium gebruiken we deze eiwitten om de functionele gevolgen voor P two X two r

proteomics-to-identify-proteins-interacting-with-p2x2-ligand-gated

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De cel permeabele crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionaat)] stabiliseert van voorbijgaande aard en labiele...

Isolatie van labiele Multi-eiwit-complexen door In vivo Gecontroleerde Cellulaire Cross-Linking and Immuno-magnetische affiniteitschromatografie

Een biochemische benadering wordt beschreven in vivo eiwit-eiwit interacties (PPI) van membraaneiwitten identificeren. De methode combineert eiwit verknoping, affiniteitszuivering en massaspectrometrie, en is aanpasbaar aan vrijwel elk type cel of organisme. Met deze benadering ook de identificatie van voorbijgaande PPI mogelijk.

Membraan-STEKEL: een biochemische Tool om eiwit-eiwit interacties van membraaneiwitten Identificeer In Vivo

Optische biosensor technieken kunnen detecteren veranderingen in de massa in de buurt van het plasmamembraan van levende cellen en laten ons toe om cellulaire reacties in zowel individuele cellen en populaties van cellen te volgen. Dit protocol detectie van de modulatie van kaliumkanalen door G-proteïne gekoppelde receptoren in intacte cellen die deze benadering beschreven.

Gebruik van Label-free Optische biosensoren om Modulatie van kaliumkanalen Detect door G-proteïne gekoppelde receptoren

Eiwitten interageren met elkaar en deze interacties bepalen voor een groot deel hun functies. Eiwitinteractiepartners kunnen op grote schaal in vivo worden geïdentificeerd met behulp van een gistfitnesstest op basis van de dihydrofolaatreducase-eiwitfragmentcomplementatietest (DHFR-PCA).

Genoom-brede Eiwit-eiwit Interactie Screening door Eiwit-fragment Complementatie Assay (PCA) in levende cellen

De beschreven cellulaire assay is ontworpen voor de identificatie van CXC chemokine receptor 4 (CXCR4)-interagerende agenten die remmen of deze te stimuleren, concurrerend of allosterically, de intracellulaire Ca2 + release geïnitieerd door CXCR4 activering.

Een kinetische fluorescentie gebaseerde Ca2 + mobilisatie Assay te identificeren van G eiwit-gekoppelde Receptor agonisten en antagonisten Allosteric modulatoren

Hier presenteren we een protocol bij scherm extracellulaire proteïne microarrays voor de identificatie van nieuwe receptor-ligand interacties in hoge-doorvoer. Ook beschrijven we een methode ter verbetering van de opsporing van voorbijgaande eiwit-eiwitinteractie met behulp van eiwit-microbead complexen.

Extracellulaire eiwit Microarray technologie voor detectie van High Throughput van lage affiniteit Receptor-Ligand interacties

Verstrekken van eencellige gevoeligheid, is real-time stroom cytometry uniek geschikt voor het kwantificeren van multimodale receptor functies van levende culturen. Met behulp van neurale volwassen voorlopercellen, de P2X7 receptor functie evalueerden via calcium toestroom gedetecteerd door calcium indicator kleurstof, transmembraan porie vorming door ethidium bromide opname en fagocytose met behulp van fluorescerende latex kralen.

Real-Time Live-cel Stroom Cytometry te onderzoeken Calcium toestroom, porie vorming en fagocytose door P2X7 receptoren in volwassen neurale voorlopercellen

Dit protocol presenteert een methode voor het meten van adenine nucleotide binding aan receptoren in real time in een cellulaire omgeving. Binding wordt gemeten als Förster resonantie energieoverdracht (FRET) tussen trinitrofenylnucleotidederivaten en eiwit gelabeld met een niet-canoniek, fluorescerend aminozuur.

Het meten van nucleotidebinding aan intacte, functionele membraaneiwitten in realtime

Technieken voor het genereren van een bibliotheek van korte peptiden die mestcellen kunnen activeren via de MRGPRX2-receptor worden beschreven. Bijbehorende technieken zijn eenvoudig, goedkoop en kunnen worden uitgebreid naar andere celreceptoren.

Screening van peptiden die MRGPRX2 activeren met behulp van Engineered HEK Cells

Hier presenteren we een protocol om het vastleggen en identificeren van ziektespecifieke eiwit-eiwitinteracties van natuurlijke cellen en weefsels mogelijk te maken met behulp van chemische sondes en massaspectrometrie. De resulterende interactiedatasets worden geanalyseerd via een speciaal webgebaseerd platform om dynamische netwerkdisfuncties en routeveranderingen die verband houden met ziekte aan het licht te brengen.

In kaart brengen van disfunctionele eiwit-eiwitinteracties bij ziekte

Een UV-gebaseerde ChIRP-methode om directe interacties tussen lncRNA en eiwitten te identificeren.

Een UV-gebaseerde ChIRP-methode voor de verifieerbare identificatie van eiwitten die direct interageren met LncRNA: van gekweekte cellen tot muistestikels

Leer een proteomics-methode om eiwitinteracties met P2X2-receptoren te identificeren met behulp van GST-pull-down en massaspectrometrie. Dit protocol helpt onderzoekers bij het ontrafelen van signaalroutes in het zenuwstelsel.

Proteomics om eiwitten Interactie met P2X2 ligand-gated kationenkanalen identificeren

Meer video's verkennen