Name: Het verwerken van de Loblolly Pine PtGen2 cDNA microarray (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-20T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: Leer de verwerking van de PtGen2 cDNA-microarray voor loblolly pine. Deze methode verbetert signaalkwaliteit en vermindert achtergrondruis door stringente wasprotocollen voor en na hybridisatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De etikettering, hybridisatie en het wassen van protocollen hierin bevatten enkele wijzigingen die eerder ontwikkeld door Dr J. Quackenbush terwijl bij het Institute for Genomic Research (TIGR), Dr Shawn Levy aan de Vanderbilt Microarray Shared Resource (VMSR), en Dr rob Alba terwijl het Boyce Thompson Instituut, (BTI) Cornell University.

(Let op de artikelen 1 tot 4 niet aangetoond in Video) Voorbereiden van Cy-gelabeld cDNA Target Wat volgt is het protocol waarin we voor cDNA synthese gebruik van loblolly dennen totaal RNA en indirecte cDNA etikettering voorafgaand aan de hybridisaties microarray. Hoewel een enkele niet-triviale wijzigingen zijn aangebracht, het protocol hieronder is vergelijkbaar met die in de handleiding die bij SuperScript Indirecte van de Invitrogen&#39;s cDNA Labeling Kit. Deel 1: eerste streng cDNA synthesereactie <ol><li> Mix en kort elke kit component draaien voor gebruik. </li><li> Bereid reacties als volgt: <ul><li> Xμl DEPC-H 2 O </li><li> Xμl totaal RNA, 20 pg / reactie (voorbehandeld met Turbo DNase Ambion&#39;s) </li><li> 2μl Verankerd oligo (dT) 20 Primer (2.5μg/μl) </li><li> 1μl Random hexameer Primer </li><li style="list-style:none;"> Totaal Volume = 18μl </li></ul></li><li> Incubeer buisjes bij 70 ° C gedurende 5 minuten, en plaats dan op ijs gedurende 1-2 minuten. </li><li> Voeg de volgende aan elke reactie buisje op ijs: <ul><li> 6μl 5X eerste streng buffer </li><li> 1.5μl 0,1 M DTT </li><li> 1.5μl 10 mM dNTP mix </li><li> 1μl RNaseOUT (40U/μl) </li><li> 2μl SuperScript III RT (400U/μl) </li></ul></li><li> Meng voorzichtig en spin kort. &#39;S nachts Incubeer buis bij 45 ° C. </li><li> Voeg 15μl van 1M NaOH om elke reactie buis en meng goed. </li><li> Incubeer buis bij 70 ° C gedurende 10 minuten. </li><li> Voeg 15μl van 1M HCl, meng voorzichtig. </li><li> Voeg 20μl 3M natriumacetaat (pH 5,2), meng voorzichtig. </li></ol> Deel 2: Reinigend eerste streng cDNA. <ol><li> Voeg 500μl van laden Buffer naar het cDNA (vanaf stap 1.9) en meng goed. </li><li> Plaats een SNAP Purification Column (meegeleverd met de Indirect Etikettering kit) op een verzamelbuis en laad je cDNA op de kolom. </li><li> Spin bij 14.000 g bij kamertemperatuur gedurende 1 minuut en schenk de flow-through. </li><li> Plaats de SNAP Column op dezelfde collectie buis en voeg 500μl van Wash Buffer. </li><li> Spin bij 14.000 g bij kamertemperatuur gedurende 1 minuut en schenk de flow-through. </li><li> Herhaal de stappen 2.4 en 2.5 drie keer, voor een totaal van drie 500μl wasbeurten. </li><li> Spin nog een keer bij 14.000 g bij kamertemperatuur gedurende 1 minuut seconden; gooi de flow-through. </li><li> Plaats de SNAP Column op een nieuwe 1,5 ml buis. </li><li> Voeg 50μl van warm DEPC-water (50 ° C) om de SNAP Column en incubeer column bij kamertemperatuur gedurende 1 minuut. Elueer het cDNA via een spin bij 14.000 g bij kamertemperatuur gedurende 1 minuut. </li><li> Herhaal stap 2.9, met behulp van 100μl van warm DEPC-water en dezelfde 1,5 ml buis voor het eluens. </li><li> Voeg 20μl van 3M natriumacetaat (pH 5,2) om het eluens van de stappen 2.9 en 2.10. </li><li> Voeg 3μl van glycogeen (20mg/ml) om de buis en meng. </li><li> Voeg 500μl van ijskoude 100% EtOH, meng goed, en incubeer de buis gedurende 1 uur bij -80 ° C. </li><li> Spin de buis op 14.000 g bij 4 ° C gedurende 20 minuten. Verwijder voorzichtig het supernatant. </li><li> Voeg 500μl van ijskoude 70% EtOH en spin de buis op 14.000 g bij 4 ° C gedurende 5 minuten. Verwijder voorzichtig het supernatant. </li><li> De lucht drogen van het monster gedurende 5 minuten; ervoor zorgen dat alle EtOH wordt verwijderd. </li><li> Verwarm de 2X Coupling buffer bij 37 ° C gedurende 5 minuten en de cDNA monster opnieuw te schorten in 5μl van warme 2X Koppeling Buffer. </li><li> Verwarm de cDNA / Coupling buffer bij 50 ° C gedurende 10 minuten en vortex goed. Zorg ervoor dat uw cDNA pellet volledig wordt opnieuw gesuspendeerd in de 2X Koppeling Buffer. </li></ol> Deel 3: Etikettering met fluorescerende kleurstof Bij de voorbereiding van de reactie, wees dan voorzichtig om de blootstelling van de kleurstof oplossing aan het licht te minimaliseren. Ook DMSO is hygroscopisch en zal vocht uit de lucht, die reageren met de NHS ester van de kleurstof en een aanzienlijke vermindering van de koppeling reactie-efficiëntie. Houd de DMSO in de kit geleverd in een amberkleurige schroef-capped flesje bij -20 ° C, en laat de flacon op kamertemperatuur voordat u deze opent om condensatie te voorkomen. Gebruik alleen de DMSO die bij deze kit. <ol><li> Open een pakje van Cy-3 of Cy-5 Dye en direct toe te voegen 75μl van DMSO aan de kleurstof flacon. </li><li> Voeg 5μl van de DMSO / kleurstof oplossing om de buis van stap 2.18. </li><li> Meng goed en incubeer het buisje bij kamertemperatuur in het donker gedurende 1 uur. </li><li> Voeg 20μl van 3M natriumacetaat (pH 5,2) om de kleurstof-gekoppelde cDNA-oplossing. </li><li> Voeg 500μl van laden Buffer naar het cDNA-oplossing. Meng goed door vortexen. </li><li> Plaats een SNAP Column op een duidelijke verzameling buis en laadt de cDNA / bufferoplossing. </li><li> Spin bij 14.000 g bij kamertemperatuur gedurende 1 minuut en schenk de flow-through. </li><li> Plaats de SNAP Column op dezelfde collectietube en voeg 500μl van Wash Buffer naar kolom. </li><li> Spin bij 14.000 g bij kamertemperatuur gedurende 1 minuut en schenk de flow-through. </li><li> Herhaal stap 3. 8-3,9 drie keer, voor een totaal van drie 500μl wasbeurten. </li><li> Spin nog een keer bij 14.000 g bij kamertemperatuur gedurende 1 minuut en schenk de flow-through. </li><li> Plaats de SNAP Column op een nieuwe oranje collectie buis. </li><li> Voeg 65μl van warm DEPC-water (50 ° C) om de SNAP Column en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 1 minuut. </li><li> Spin bij 14.000 g bij kamertemperatuur gedurende 1 minuut en het verzamelen van de doorstroming. De flow-through moet bevatten 60μl van uw gezuiverde dye-gekoppelde cDNA. </li></ol> Deel 4: Het beoordelen van de Labeling procedure. <ol><li> Voer een spectrofotometer test aan elke Cy-cDNA labeling te beoordelen. Bereken het totale aantal pmol van de gesynthetiseerde cDNA: [OD 260 x vol. x 37ng/μl x 10 3 ng / pg] / 324,5 pg / pmol. Bereken de totale pmol van opgenomen Cy-Dye voor elke etikettering reactie: pmol Cy3 = [OD 550 X vol.] / 0,15; pmol Cy5 = [OD 650 X vol.] / 0,25. Vervolgens berekent de pmol van nucleotide / pmol dye-ratio voor elke reactie. Optimale reacties genereren&gt; 6000pmol van cDNA (per 60ul),&gt; 200pmol van Cy-Dye (per 60ul), en een nucleotide / kleurstof verhouding die is &lt;30. </li></ol> Deel 5: Schuif Pre-Wash <ol><li> De PtGen2 Array is gedrukt op Corning UltraGaps dia&#39;s (amino-silaan gecoat) en cDNA&#39;s zijn UV-cross-linked. Print plekken zijn duidelijk zichtbaar door het hoge zoutgehalte van de buffer. </li><li> Gebruik een diamant tip pen aan de glijbaan voor de bovenste en onderste delen van het afdrukgebied (optioneel) te markeren. </li><li> Zet ongeveer 250mL voorverwarmde tot 43 ° C 0,2% SDS oplossing in microscoopglaasje wassen schotel (3 &quot;x 4&quot;). </li><li> Plaats de glaasjes te pre-gehybridiseerd in de dia rek en duik in het SDS-oplossing 15-20 keer zeer krachtig om de zouten te verwijderen op de dia&#39;s. </li><li> Met behulp van een tang, verwijder voorzichtig de dia&#39;s uit het rek en plaats ze in een Coplin pot met Pre-hybridisatie Buffer (5x SSC, 0,1% SDS, 1% BSA), die is voorverwarmd tot 43 ° C. Incubeer bij 43 ° C gedurende ten minste een uur. </li></ol> Deel 6: Pre-hybridisatie <ol><li> Stel vijf slide afwas, elk gevuld met millipure dH 2 O, en een Coplin pot gevuld met moleculair-biologische kwaliteit isopropanol. Plaats de objectglaasjes in een rack en proces achtereenvolgens vijf gerechten door dunking 20 keer per stuk. </li><li> Verwijder de dia&#39;s twee tegelijk uit de vijfde water wassen en dip 5-6 keer in de isopropanol en onmiddellijk plaats in dia&#39;s in de slide microfuge (Chipmate benchtop, 2 posities) en spin 1 minuut om te drogen. </li><li> Schoon dia&#39;s met perslucht gefilterd door een 0,22 urn filter cartridge en plaats deze met de streepjescode naar boven in een Genomic Solutions Hybridization Kamer. </li><li> Schoon LifterSlips ™ met gefilterde lucht en plaats ze op de dia&#39;s met de witte strips naar beneden. Gebruik een geel pipet tip om voorzichtig uitlijnen van de lifter slip op de dia (wassen LifterSlips ™ eerst in 70% ethanol is optioneel. We hebben gemerkt dat het niet nodig is.) </li></ol> Deel 7: hybridisatie Moeten worden uitgevoerd in het donker of bij weinig licht. <ol><li> Voor elke dia worden gehybridiseerd, berekent het bedrag van Cy-5 en Cy-3 gemerkte cDNA tot 50-75pmol van elk doel te geven. Combineer die bedragen in een enkele buis en in een vacuüm exsiccator met de hitte-instelling droog bij 37-45 ° C. Voorkomen dat ze uitdrogen compleet! </li><li> Resuspendeer de gedroogde probes in 60ml hybridisatiebuffer (vers gemaakt die dag) en vortex kort. </li><li> Incubeer de geresuspendeerde cDNA 5 minuten in een 95 ° C en vervolgens snel microfuge gedurende 30 seconden. </li><li> Laad de hele gehersuspendeerd sonde volume door het langzaam pipetteren op de slide-LifterSlip ™ kruising onderaan (streepjescode einde) van de dia. De dia zal laden door middel van capillaire werking. (Sommigen geven de voorkeur aan on pipet om de dia en dan zachtjes de overlay LifterSlip ™ is dit een one shot methode want als je bellen kunt u de LifterSlip ™ niet bewegen na plaatsing wat kan leiden tot versmering artefacten spot) </li><li> Plaats 20uL van 100mm DTT in elke vochtigheid goed gelegen aan de uiteinden van de kamer. </li><li> Plaats de top op de kamer en draai de nok schroeven. Bedek de kamer met aluminiumfolie en onder te dompelen in een 48 ° C waterbad voor 12-18 uur zacht schudden op 50-60 rpm. </li></ol> Deel 8: Post-hybridisatie Wast Alle gewassen moeten worden uitgevoerd in het donker of bij weinig licht. Dia&#39;s mogen nooit worden toegestaan ​​om te drogen tot de laatste stap. <ol><li> Stel een Coplin pot gevuld met Wash Solution # 1 @ 53 ° C, en vier schuif afwassen gevuld met 250 ml van elk van de volgende: 1) Wash Oplossing # 1 @ 53 ° C, 2) Was Oplossing # 2 @ kamertemperatuur, 3 &amp; 4) twee gerechten met wassen Oplossing # 3 @ kamertemperatuur. </li><li> Verwijder voorzichtig de dia&#39;s van de hybridisatie kamers en plaats ze twee tegelijk in de Coplin pot. Laat gedurende 30 seconden, til de schuif langzaam en de tillift slip blijft in de pot. Plaats de glaasjes in de glijbaan rack en onmiddellijk onder te dompelen in Wash Solution # 1 (1X SSC, 0,2% SDS, verwarm tot 43 ° C). Herhaal dit totdat alle LifterSlips zijn verwijderd en alle dia&#39;s te worden gewassen in de Wash Solution # 1 schotel. Duik rack op en neer 10 keer krachtig. </li><li> Plaats schotel in 53 ° C in lucht shaker met schudden bij 50-100 toeren per minuut gedurende 10 minuten. </li><li> Overdracht rek naar Oplossing # 2 (0.1X SSC, 0,2% SDS), dompelbad 10 keer, en incubeer wassen bij kamertemperatuur langzaam schudden gedurende 10 minuten. </li><li> Dip rack 15 keer in de eerste Wash Solution # 3 (0.1X SSC) te verwijderen eventueel resterende SDS over te dragen van de Wash Solution # 2. Plaats rek in de tweede Wash Solution # 3 schotel, dompelbad 10 keer, en dan langzaam schudden gedurende 10 minuten. </li><li> Plaats de glaasjes in 50 ml Falcon buizen afgedekt en spin @ 1500 rpm in centrifuge is uitgerust met een swingende emmer rotor. Verwijder de dia&#39;s om gerezen container licht, gebruiken we een andere Falcon buis bekleed met aluminiumfolie, en zuiveren de lucht uit de buis met stikstofgas, dop stevig vast (dit vermindert de oxidatie van de Cy kleurstoffen, in het bijzonder Cy-5 in de zomer, wanneer ozonconcentraties het hoogst ). Dia&#39;s kunnen worden opgeslagen voor een paar uur voor het scannen in de stikstof gespoeld buizen, maar de beste signaal resultaten worden verkregen bij het scannen gebeurt onmiddellijk na het wassen. </li></ol> Deel 9: verzamelen van gegevens en statistische analyse <ol><li> Scan beeldgegevens is verzameld op een PerkinElmer ScanArray. We maken gebruik van een 10 micron scaninstelling en balans Cy3 en Cy5 signalen met behulp van de lijn methode voor de aanpassing volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> TIF-bestanden zijn gerasterde en ruwe signaal data verzameld en gefilterd met ImaGene Version 7.5 (BioDiscovery, Inc, El Segundo, CA) </li><li> Data normalisatie en evaluatie om statistisch verantwoorde differentieel tot expressie soort te bepalen wordt gedaan met BRB Array tools Ver. 3.7. </li><li> Patroon analyse tot bepaling van de coördinerend uitgedrukte genen te vergemakkelijken wordt gedaan met Gene Expression Pattern Analysis Software (GEPAS) Ver. 3.1. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1182/Figure1_WWLorenz-1.png" alt="Figuur 1" /> Figuur 1. Voorbeeld van verwerkte PtGen2 array met deze protoco l. <img src="/files/ftp_upload/1182/Figure2_WWLorenz.png" alt="Figuur 2" /> Figuur 2. Voorbeeld van PtGen2 reeks verwerkt met behulp van standaard-hybridisatie en het wassen van protocollen.

<ol><li>Lorenz, W. W., Sun, F., Liang, C., Kolychev, D., Wang, H., Zhao, X., Cordonnier-Pratt, M. M., Pratt, L. H., Dean, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water+stress-responsive+genes+in+loblolly+pine+%28Pinus+taeda%29+roots+identified+by+analyses+of+expressed+sequence+tag+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Tree+Physiol%22%5BJournal%5D)">Water stress-responsive genes in loblolly pine (Pinus taeda) roots identified by analyses of expressed sequence tag libraries.</a> Tree Physiol. 26, 1-16 (2006).</li>
<li>Lorenz, W. W., Dean, J. F. D. unpublished data. , Forthcoming.</li>
<li>Hegde, P., Qi, R., Abernathy, K., Gay, C., Dharap, S., Gaspard, R., Hughes, J. E., Snesrud, E., Lee, N., Quackenbush, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+concise+guide+to+cDNA+microarray+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A concise guide to cDNA microarray analysis.</a> Biotechniques. 29, 548-562 (2000).</li>
<li>Alba, R., Fei, Z., Payton, P., Liu, Y., Moore, S. L., Debbie, P., Cohn, J., D'Ascenzo, M., Gordon, J. S., Rose, J. K. C., Martin, G., Tanksley, S. D., Bouzayen, M., Molly, M., Jahn, M. M., Giovannoni, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ESTs%2C+cDNA+microarrays%2C+and+gene+expression+profiling%3A+tools+for+dissecting+plant+physiology+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">ESTs, cDNA microarrays, and gene expression profiling: tools for dissecting plant physiology and development.</a> The Plant Journal. 39, 697-714 (2004).</li>
<li>Lorenz, W. W., Simões, M., Miguel, C., Dean, J. F. D. Analysis of Gene Expression changes in Pinus species using a Loblolly pine cDNA microarray. IUFRO-CTIA 2008 Joint Conference. August 25-29, Quebec City, Quebec, , (2008).</li>
<li>Simões, M., Lorenz, W. W., Alba, A., Gonçalves, S., Dean, J., Miguel, C. Global gene expression analysis during P. pinaster embryo development. 7th Plant Genomics European Meeting. September 24-27, Albena, Bulgaria, , (2008).</li>
</ol>

PtGen2 is een recent ontwikkeld, op maat cDNA microarray, dat is ontworpen om in de eerste plaats worden gebruikt door de loblolly dennen onderzoeksgemeenschap. Generated voorlopige resultaten tot nu toe hebben aangetoond dat het array een waardevol instrument voor de evaluatie van transcriptionele gebeurtenissen die zich voordoen in respons op droogtestress, evenals bij het ​​toezicht op wijzigingen die tijdens de ontwikkeling van het embryo zich in de maritieme dennen, Pinus pinaster 5,6 We worden ...

<table><tbody><tr><td>Pre-hybridisatiebuffer</td><td>Buffer</td><td></td><td></td><td>5X SSC, 0.1% SDS, 1% BSA</td></tr><tr><td>Hybridisatiebuffer</td><td>Buffer</td><td></td><td></td><td>30% formamide, 5X SSC, 5X Denhardt&amp;rsquo;s, 1% PolyA RNA (Invitrogen, POLYA.GF), 0.1% SDS</td></tr><tr><td>Wasoplossing #1</td><td>Buffer</td><td></td><td></td><td>1X SSC, 0.2% SDS, voorverwarmen tot 43&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Wasoplossing #2</td><td>Buffer</td><td></td><td></td><td>0.1X SSC, 0.2% SDS</td></tr><tr><td>Wasoplossing #3</td><td>Buffer</td><td></td><td></td><td>0.1X SSC</td></tr><tr><td>Isopropylalcohol</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34959-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>50mL Conische buizen</td><td>Overig</td><td>Falcon BD</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>15mL Conische buizen</td><td>Overig</td><td>Falcon BD</td><td>352196</td><td>Gebruik deze of een soortgelijke dop onderin elke 50mL conische buis tijdens centrifugatie</td></tr><tr><td>Coplin-pot</td><td></td><td>Wheaton</td><td>900520</td><td></td></tr><tr><td>Kleurbak &amp;amp; rek</td><td>Overig</td><td>Wheaton</td><td>900200</td><td></td></tr><tr><td>Albumine uit runderserum (BSA)</td><td>Overig</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-9418</td><td></td></tr><tr><td>PolyA RNA</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>POLYA.GF</td><td></td></tr><tr><td>SuperScriptTM Indirect cDNA Labeling </td><td>Kit</td><td>Invitrogen</td><td>L1014-02</td><td></td></tr><tr><td>Turbo DNase </td><td>Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1907</td><td></td></tr><tr><td>Systeem</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cy-5 kleurstof</td><td>Reagens</td><td>GE Healthcare</td><td>PA25001</td><td></td></tr><tr><td>Cy-3 kleurstof</td><td>Reagens</td><td>GE Healthcare</td><td>PA23001</td><td></td></tr><tr><td>LifterSlips&amp;#8482;</td><td>Overig</td><td>Erie Scientific</td><td>25X601</td><td></td></tr><tr><td>HybChambers</td><td>Apparatuur</td><td>GeneMachines</td><td>JHYB200003</td><td></td></tr></tbody></table>

het verwerken van de loblolly pine ptgen2 cdna microarray

Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray

PtGen2 is een kenmerk 26496 cDNA microarray met versterkte loblolly grenen EST&#39;s. De array wordt geproduceerd in ons laboratorium voor gebruik door onderzoekers bestuderen van genexpressie in dennen en andere naaldbomen. PtGen2 werd ontwikkeld als een resultaat van onze ontdekking van genen inspanningen in loblolly grenen, en bestaat uit sequenties geïdentificeerd in de eerste plaats van de wortel weefsels, maar ook van de naald en de stengel. 1,2 PtGen2 is getest door het hybridiseren van verschillende gelabelde Cy-dye conifeer doel cDNA , waarbij zowel versterkt en niet-versterkte indirecte labeling methoden, en ook getest met een aantal van de hybridisatie en het wassen voorwaarden. Deze video richt zich op de behandeling en verwerking van dia&#39;s voor en na de pre-hybridisatie, als na hybridisatie, met behulp van enkele aanpassingen aan de procedures eerder ontwikkelde. 3,4 Ook inbegrepen, in tekst vorm, zijn de protocollen die gebruikt worden voor het opwekken, etikettering en de clean-up van de doelstelling cDNA&#39;s, evenals informatie over de software die wordt gebruikt voor de downstream-verwerking van gegevens. PtGen2 is bedrukt met een eigen afdruk buffer die hoge concentraties van het zout dat kan moeilijk zijn om volledig te verwijderen bevat. De dia&#39;s worden eerst gewassen in een warme SDS-oplossing voorafgaand aan de pre-hybridisatie. Na de pre-hybridisatie, worden de dia&#39;s krachtig gewassen in een aantal wijzigingen van het water om de verwijdering van de resterende zouten te voltooien. LifterSlips ™ worden vervolgens gereinigd en geplaatst op de dia&#39;s en gelabeld cDNA wordt zorgvuldig geladen op de microarray door middel van capillaire werking, die voorziet in een gelijkmatige verdeling van de steekproef over de glijbaan, en vermindert de kans van de zeepbel van oprichting. Hybridisatie van doelstellingen om de array wordt gedaan bij 48 ° C in een hoge luchtvochtigheid. Na hybridisatie wordt een reeks van standaard wasbeurten gedaan op 53 ° C en kamertemperatuur voor langere tijden. Verwerking PtGen2 dia&#39;s met deze techniek minder zout en SDS-afgeleide artefacten vaak gezien als de array is minder rigoureus verwerkt. Hybridiserende doelen die afgeleid zijn uit verschillende bronnen conifeer RNA, deze verwerking protocol leverde minder artefacten, minder achtergrond, en op voorwaarde dat een betere samenhang tussen de verschillende experimentele groepen van arrays.

Het cDNA microarray PtGen2 is ontwikkeld voor genexpressie studies in loblolly pine,<em&gt; P. taeda</em&gt;, En andere naaldbomen. Hier tonen we pre-en post-hybridisatie hanteren en wassen technieken die gebruikt kunnen worden met deze array betere consistentie, verminderde artefacten, en een lagere opbrengst achtergronden.

Het verwerken van de Loblolly Pine PtGen2 cDNA microarray

PtGen2 is een cDNA-microarray met 26.496 kenmerken die geamplificeerde EST's van de loblollyden bevat. De array wordt in ons laboratorium geproduceerd voor gebruik door onderzoekers ...

Deze video is geproduceerd door onderzoekers van de Warnell School of Forestry and Natural Resources aan de University of Georgia. Het doel van deze trainingsvideo is om gedetailleerd uit te leggen hoe onze LOB lolly pine pt, gen twee CDNA-microarray moet worden verwerkt, met bijzondere aandacht voor het wassen en hanteren van de array, zowel vóór als na hybridisatie. In het algemeen volgen onze protocollen die van het Institute for Genomic Research Tiger en de Vanderbilt Microarray Shared Resource Facility (VMSR), waar onze arrays worden geprint.We hebben vastgesteld dat een striktere verwerking van PT Gen twee vereist is om de grootste consistentie te verkrijgen met betrekking tot de uniformiteit van de signaalkwaliteit en lage achtergronden. De eerste stap is een pre-wash. We doen dit omdat onze spottingbuffer een zeer hoog zoutgehalte bevat en deze pre-wash noodzakelijk is om dat zout te verwijderen.De objectglazen worden in een objectglashouder geplaatst en 15 tot 20 keer krachtig ondergedompeld in een 0,2% SDS-oplossing die is voorverwarmd tot 43 °C. Nadat de objectglazen in de SDS-oplossing zijn gewassen, worden ze voorzichtig met een pincet overgebracht naar een Copeland-pot met prehibridisatiebuffer. Deze buffer bevat 5X SSC, 0,1% SDS en 1% BSA, en is eveneens verhit tot 43 °C.De Copeland-pot wordt bedekt met parfum en gedurende één uur in een incubator van 43 °C geplaatst. Na de prehybridisatie worden de objectglazen overgebracht naar een objectglashouder en opeenvolgend behandeld met vijf wisselingen van gedeïoniseerd water, waarbij ze 15 tot 20 keer in elke wisseling worden gedompeld. Ten slotte worden de objectglazen in isopropanol geplaatst en vijf of zes keer gedoopt voordat ze in een chip M mate-centrifuge worden gecentrifugeerd tot ze droog zijn.Na centrifugatie worden de objectglazen afgeblazen met perslucht die door een filter van 0,2 micron is geleid. De objectglazen worden vervolgens bedekt met dekglasplaatjes, die eveneens met perslucht zijn gereinigd, waarna we een kleine pipetpunt gebruiken om het dekglasplaatje in de juiste positie op het objectglas te plaatsen.Nadat de lifter slips zijn geplaatst, maar voordat de hybridisatiebuffer wordt toegevoegd, voegen we 20 µL van 100 mM dihi, drie atol toe aan de bevochtigingsputjes aan de uiteinden van de kamer. Nu zijn we klaar om de target cDNA's toe te voegen, die zijn geresuspendeerd in hybridisatiebuffer. De pipetpunt wordt aan de rand van de lifter slip en de slide geplaatst en de oplossing wordt langzaam gepipetteerd.We stelden vast dat het benutten van het capillaire effect bij het laden van de arrays de meeste consistentie biedt en de vorming van ongewenste luchtbellen aanzienlijk vermindert. Nadat het doelmateriaal aan de array is toegevoegd, wordt de hybridisatiekamer geassembleerd en afgedekt met aluminiumfolie. De hybridisatiekamer wordt vervolgens in een schuddend waterbad geplaatst voor incubatie gedurende de nacht, gewoonlijk 14 tot 16 uur.Het waterbad wordt ingesteld op 48 °C en de shaker op 50 rpm. Het is bovendien belangrijk om op te merken dat vanaf het moment van toevoegen van de hybridisatieloplossing tot en met alle wasstappen na de hybridisatie, de procedures bij weinig licht worden uitgevoerd om foto-oxidatie te voorkomen. De volgende dag worden de objectglazen uit de hybridisatiekamer gehaald en geplaatst in een Copeland-pot met wasoplossing nummer één, die vooraf is voorverwarmd tot 53 °C.De objectglazen blijven ongeveer een minuut in de Copeland-pot tot de liftstrips loslaten, waarna de glazen voorzichtig met een pincet worden verwijderd en in een objectgashouder worden geplaatst om verder te gaan met de wasstappen. De objectglazen worden vervolgens ongeveer 15 tot 20 keer krachtig ondergedompeld in een tweede container, die eveneens wasoplossing nummer één bij 53 °C bevat. De container wordt daarna afgesloten met Parafilm en geplaatst in een incubator-schudapparaat dat is ingesteld op 53 °C en 100 RPM.Na de incubatie van 10 minuten en wasoplossing nummer één worden de objectglazen 15 tot 20 keer krachtig ondergedompeld in een container met wasoplossing nummer twee, die op kamertemperatuur is. De container wordt afgedekt met parafilm en opnieuw op een shaker bij kamertemperatuur geplaatst voor een incubatie van 10 minuten. Ten slotte worden de objectglazen uit wasoplossing nummer twee gehaald en 15 tot 20 keer krachtig ondergedompeld in een container met wasoplossing nummer drie.De objectglazen worden vervolgens overgeplaatst naar een tweede bak met wasoplossing nummer drie, afgedekt met Parafilm, en opnieuw 10 minuten op de schudmachine geplaatst. Na de laatste wasstap centrifugeren we de objectglazen tot ze volledig droog zijn. Hiervoor plaatsen we een dop van een 15 ml Falcon-buis in een 50 ml conische buis en plaatsen we de arrays met de barcodezijde naar beneden in de conische buis.De buisjes worden vervolgens gecentrifugeerd in een swing-out rotor op 1500 RPM bij kamertemperatuur. Na centrifugatie worden de objectglazen overgeplaatst naar een tweede set conische buisjes van 50 mil, die zijn afgedekt met aluminiumfolie. De buisjes worden vervolgens gespoeld met stikstofgas, dat is gefilterd door een 0,22 micron filter, en afgesloten voor transport of opslag tot aan het scannen.We verzamelen scandata op een PerkinElmer scan array 5, 000. De array-afbeelding wordt gerasterd, de ruwe scandata worden verwerkt en de initiële data-analyse wordt uitgevoerd met de imaging software suite van BioDiscovery. Vervolgens worden de signaalintensiteitsgegevens van de spots genormaliseerd en worden statistische analyses uitgevoerd met BRB array tools, een robuust en gratis beschikbaar statistisch microarray-pakket dat kan worden gedownload van het National Cancer Institute.Andere statistische analyses en zoekopdrachten naar genexpressiepatronen worden uitgevoerd met de suite voor genexpressiepatronen en analyses Jeep PPAs, een ander freely beschikbare webgebaseerde analysepackage. Bedankt voor het bekijken van onze video over het verwerken van de loblollyden PT Gen twee microarray.De volgende personen waren verantwoordelijk voor de inhoud en productie van deze trainingsvideo.

processing-the-loblolly-pine-ptgen2-cdna-microarray

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Vanwege het tijdelijke karakter van de pre-mRNA, kan het moeilijk zijn te isoleren en te...

Een snelle High-throughput Methode voor Mapping Ribonucleoproteins (RNP&#39;s) op de menselijke pre-mRNA

Veel planten-weefsels, waaronder floëem en xyleem van loblolly den...

Een verbeterde methode van RNA isolatie uit Loblolly Pine ( P. taeda L.) en andere naaldbomen

Een fundamentele zoektocht in de celbiologie is het definiëren van de mechanismen die de identiteit van de organellen die eukaryotische cellen te maken ten grondslag liggen. Hier stellen we een methode om de genen die verantwoordelijk zijn voor de morfologische en functionele integriteit van plantaardige organellen met behulp van fluorescentie microscopie en next-generation sequencing tools te identificeren.

Fluorescentie-microscopie Screening en next-generation sequencing: Handige hulpmiddelen voor de identificatie van genen betrokken bij organel Integriteit

Dit manuscript beschrijft het gebruik van de nieuwste technologie die wordt geleverd door DNA-microarrays. Microarrays geven een overzicht van de transcriptomische veranderingen in bacteriën die ontstaan onder specifieke omstandigheden. Bovendien benadrukken we hoe gemakkelijk grote hoeveelheden gegevens kunnen worden geanalyseerd door gebruik te maken van handige, in eigen beheer ontwikkelde softwarepakketten.

Een snelle en betrouwbare Pipeline voor Bacteriële Transcriptome Analyse Case study: Serine-afhankelijke genregulatie in<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em

Microarray-technologie maakt kwantitatieve meting en profielbepaling van genexpressie van transcripten op genoombreed niveau mogelijk. Daarom biedt dit protocol een geoptimaliseerde technische procedure in een tweekleurige op maat gemaakte boviene array met gebruik van boviene embryo's op dag 7 om de haalbaarheid van het gebruik van een kleine hoeveelheid totaal RNA aan te tonen.

Transcriptome Profilering van In-Vivo Geproduceerd Bovine Pre-implantatie embryo's met behulp van twee-kleuren Microarray Platform

Dit artikel beschrijft de toepassing van ongerichte metabolomics, transcriptomics en multivariate statistische analyse om druivenbes transcripties en metabolieten om inzicht te krijgen in het terroir concept, dat wil zeggen, de invloed van de omgeving op bes kwaliteitskenmerken.

De Terroir Concept Uitgelegd door de Bes van de Druif Metabolomics en Transcriptomics

Dit artikel beschrijft de procedure voor de identificatie en karakterisering van de familie van een gen in grapevine toegepast aan de familie van Arabidopsis Tóxicos in Levadura (ATL) E3 ubiquitin ligases.

Uitgebreide Workflow voor de genoom-brede identificatie en expressie Meta-analyse van de ATL E3 Ubiquitin Ligase Gene familie in Grapevine

Dit protocol worden de algemene procedures beschreven en kwaliteitscontrole controles nodig voor gezonde volwassen één zoogdiercellen voorbereiden druppel gebaseerde, hoge doorvoer eencellige RNA-Seq preparaten. Sequencing parameters, worden Lees uitlijning en downstream eencellige bioinformatic analyse ook geleverd.

Druppel Barcoding gebaseerde eencellige Transcriptomics van volwassen zoogdieren weefsels

Deze studie presenteert een ruimtelijk Trekker–CUT&amp;Tag multioomprotocol dat directe ruimtelijke streepjescoding van een weefselsectie combineert met enkelcel-multioomanalyse. Deze aanpak maakt ruimtelijk opgeloste enkelcelprofilering van genexpressie en de histon H3K27ac-modificatie mogelijk gelijktijdig, wat mechanistische inzichten biedt in genregulatie in de context van weefselmicroanatomie.

Ruimtelijk opgeloste, geïntegreerde single-cell multiomic profilering van het transcriptoom en epigenomische doelen in bevroren weefselsecties

De studie van de ontwikkelingsprocessen van de ascosporen in Gibberella zeae, een procedure voor de collectie onder steriele omstandigheden wordt gefilmd om het hoogste niveau van informatie voor protocol beschrijving te genereren. Dit moet de reproduceerbaarheid van het experiment, een cruciaal aspect bij het volledige genoom expressie profiel testen worden uitgevoerd.

Gibberella zeae Ascospore Productie en collectie voor microarray experimenten.

Leer de verwerking van de PtGen2 cDNA-microarray voor loblolly pine. Deze methode verbetert signaalkwaliteit en vermindert achtergrondruis door stringente wasprotocollen voor en na hybridisatie.

Het verwerken van de Loblolly Pine PtGen2 cDNA microarray

Meer video's verkennen