De voorbereiding van Drosophila Embryo's voor Live-Imaging Met behulp van de Opknoping Drop Protocol
13 maart 2009
Een eenvoudige, goedkope en effectieve methode voor de bereiding Drosophila embryo's voor live-imaging analyse wordt gepresenteerd. Onze-protocol zorgt voor vochtigheid en gas uit te wisselen en comprimeert niet de Drosophila embryo. Deze methode is geschikt voor het GFP-gebaseerde live beeldvorming van Drosophila embryo's met behulp van een stereomicroscoop of rechtop samengestelde microscoop.
Hallo. Mijn naam is Bruce Reed. Ik ben universitair docent bij de Afdeling Biologie van de University of Waterloo in Waterloo, Ontario, Canada. Vandaag maken we dit videoarchief om een nieuwe techniek te documenteren die we hebben ontwikkeld voor het prepareren van your softly-embryo's voor live-imaginganalyse.
Bij het uitvoeren van live-imaginganalyse met drosophila-embryo's maken we frequent gebruik van time-lapse acquisitie, wat enkele uren kan duren. Daarom is het belangrijk om een techniek te hebben waarbij de embryo's worden beschermd tegen zowel uitdroging als hypoxie. Daarnaast willen we een techniek ontwikkelen die elke compressie van het embryo voorkomt.
Voor het monteren hebben we een zeer eenvoudige, goedkope en effectieve methode ontwikkeld die we de 'hanging drop'-preparatie noemen. De hanging drop-preparatie is geschikt voor live-imaginganalyse van embryo's met behulp van stereomicroscopie of elke rechtopstaande compoundmicroscoop. Deze time-lapse movie laat acht GFP-expresserende embryo's zien die zijn geprepareerd volgens het hanging drop-protocol en zijn vastgelegd met time-lapse fluorescentiemicroscopie.
Deze beeldsequentie representeert een verstreken tijd van meer dan vier uur. Het begin van de beweging laat zien dat deze embryo's in een levensvatbare conditie verkeren. We zullen u nu meenemen door een gedetailleerde stapsgewijze beschrijving van hoe u het Hanging drop-protocol uitvoert.
Embryo's worden verzameld op standaard druivensap-, ei- of platen. Met behulp van een geautomatiseerde dsof FLA ei-verzamelaar van Fly max scientific equipment biedt de geautomatiseerde verzamelaar gesynchroniseerde collecties van embryo's in een vooraf bepaald ontwikkelingsstadium. Ter voorbereiding op het handmatig decoreren van embryo's wordt een stukje dubbelzijdige plakband op een microscopieplaatje geplakt en wordt de achterkant van de tape verwijderd.
Het hanging-drop-protocol vereist een op maat gemaakte kamer, vervaardigd uit een vijf millimeter dikke plaat polycarbonaatplastic. De plaat wordt op de afmetingen van een objectglas gesneden en er wordt met een rotor een drie millimeter diepe inkeping gemaakt. De bevochtiging van de kamer voor live-imaging wordt gerealiseerd met een stukje weefsel dat op maat is gesneden voor de put van de kamer en is bevochtigd met gedestilleerd water.
Halo Carbon-olie is ideaal voor live-imaging van gecoördineerde drosophila-embryo's omdat het gasdoorlaatbaar en optisch helder is. Het mengen van halo carbon-olie serie 700 en serie 56 in een verhouding van één op één resulteert in een viscositeit die geschikt is voor het werken met Drosophila-embryo's. Embryo's kunnen van de druivensap-agarplaten worden verzameld met gebruik van pincetten of een zeer fijn penseel.
Embryo's kleven aan elkaar en aan de punten van de pincet. Ze klonteren gemakkelijk samen tot groepjes embryo's. Ze hechten zich aan de pincet.
De tips worden voorzichtig neergezet op het kleverige oppervlak van de tape op de eerder voorbereide decoratieslide. Terwijl u de embryo's via een stereomicroscoop bekijkt, duwt u ze voorzichtig aan of strijkt u ertegenaan met de zijkant van de pincet. U moet de corona openbreken zonder het binnenste vliezige membraan te scheuren.
Dit vereist een vaste hand, geduld en enige oefening. Zodra de buitenste corona is doorbroken, heeft het gedechloreerde embryo de neiging om aan de pincet te kleven. Let erop dat het gedechloreerde embryo het plakkerige oppervlak van de tape niet raakt.
Het kan erg moeilijk zijn om ze snel van de tape te verwijderen; breng de gedechloreerde embryo's daarom over naar de halo. Druppel koolstofolie op het dekglas. Het is raadzaam om dit bij de hand te houden. Raak met de punt van de pincet het oppervlak van de koolstofoliedruppel in de halo aan.
Het embryo wordt met de pincet in de olie geplaatst; de overdracht van het embryo kan met het blote oog worden bevestigd tegen een zwarte achtergrond en met een glasvezelverlichtingsbron die onder een schuine hoek is geplaatst voordat u het volgende embryo chlorineert. Het is nuttig om de olie van de pincet af te vegen vanwege hun drijfvermogen in de halocarbonolie. De gecoördineerde embryo's drijven op het oppervlak van de oliedruppel.
We kunnen de positie en oriëntatie van de embryo's controleren door ze naar de bodem van de oliedruppel te duwen en het dekglas in het hanging-drop-protocol snel om te keren. We keren het dekglas om boven de bevochtigde put van de live-imagingkamer. Wanneer het dekglas is omgekeerd, zullen de embryo's tegen de onderzijde van het dekglas rusten.
De rustposities van de embryo's kunnen onder een stereomicroscoop worden gecontroleerd. Indien deze niet bevredigend zijn, kan de procedure worden herhaald. Zodra de embryo's in de gewenste positie zijn, wordt het dekglas met tape aan de live-imagingkamer bevestigd.
De kamer wordt geventileerd door gaten in de tape te maken. De embryo's zijn nu klaar om te worden afgebeeld.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een eenvoudige en effectieve methode voor het prepareren van Drosophila-embryo's voor live-imaging analyse. Het protocol waarborgt een juiste luchtvochtigheid en gasuitwisseling terwijl compressie van de embryo's wordt voorkomen, waardoor het geschikt is voor GFP-gebaseerde imaging.
Belangrijkste Componenten van de Studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Biologie
- Beeldvormingstechnieken
Achtergrond
- Live-imaginganalyse van Drosophila-embryo's wordt gewoonlijk uitgevoerd met behulp van time-lapse-acquisitie.
- Embryo's zijn kwetsbaar voor uitdroging en hypoxie tijdens langdurige imagingsessies.
- Een techniek die compressie van de embryo's vermijdt, is essentieel voor nauwkeurige imaging.
- GFP-gebaseerde imaging vereist specifieke condities voor optimale resultaten.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een methode die Drosophila-embryo's beschermt tegen uitdroging.
- Het waarborgen van een adequate gasuitwisseling tijdens de beeldvorming.
- Het voorkomen van compressie van embryo's tijdens live-imaging.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van Drosophila-embryo's voor live-imaging.
- Implementatie van vochtigheidscontrole tijdens imaging-sessies.
- Gebruik van een stereomicroscoop of een rechtopstaande compoundmicroscoop voor imaging.
- Toepassing van GFP-gebaseerde imaging-technieken.
Belangrijkste resultaten
- De methode handhaaft effectief de vochtigheid en gasuitwisseling voor embryo's.
- Embryo's blijven onsamengedrukt, wat zorgt voor een betere beeldkwaliteit.
- GFP-gebaseerde beeldvorming levert over langere perioden duidelijke resultaten op.
- De techniek is eenvoudig en kosteneffectief voor onderzoekers.
Conclusies
- Deze methode verbetert de kwaliteit van live-imaging van Drosophila-embryo's.
- Het biedt een betrouwbare aanpak voor onderzoekers in dit vakgebied.
- Het protocol kan eenvoudig worden toegepast in verschillende laboratoriumomgevingen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Live-imaging van modelorganismen is essentieel voor doelwitvalidatie en fenotypische screening in de vroege ontdekkingsfase. Het hanging drop-protocol pakt belangrijke beperkingen aan met betrekking tot dehydratatie, hypoxie en mechanische compressie, die de levensvatbaarheid van embryo's en de datakwaliteit tijdens langdurige time-lapse-imaging in gevaar brengen. Door niet-gecomprimeerde, fysiologisch relevante imaging van Drosophila-embryo's mogelijk te maken, ondersteunt deze methode de mechanistische risicoreductie van genetische en farmacologische interventies in een schaalbaar en kosteneffectief formaat.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om genetische regulatie in dynamische processen zoals weefselmorfogenese en celadhesie te onderzoeken zonder mechanische artefacten door compressie.
- Operationele waarde: Handhaaft de levensvatbaarheid van het embryo gedurende meer dan vier uur, wat longitudinale observatie van genfuncties en pathway-dynamiek ondersteunt.
- Voorspellende waarde: Vermindert fout-positieven door stress-geïnduceerde fenotypes, waardoor het vertrouwen in target-validatie-assays wordt vergroot.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Biedt een gestandaardiseerd, reproduceerbaar platform voor live-imaging op basis van GFP dat omgevingsvariabiliteit minimaliseert.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van goedkope, toegankelijke materialen (halogeenkoolstofolie, polycarbonaatkamer, tape) die geschikt zijn voor aanpassing aan high-throughput toepassingen.
- Assay-gereedheid: Maakt gebruik van het drijfvermogen van embryo's in olie om de positionele stabiliteit te behouden, waardoor drift wordt verminderd en de signaalconsistentie bij time-lapse acquisitie wordt verbeterd.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Ondersteunt beeldvorming van geconserveerde ontwikkelingsprocessen die relevant zijn voor menselijke ziektemodellen, wat extrapolatie tussen soorten vergemakkelijkt.
- Mechanische risicoreductie: Maakt observatie van cellulaire gedragingen (bijv. celdood, adhesie) onder fysiologische omstandigheden mogelijk, waardoor het voorspellend vertrouwen voor downstream preklinische modellen wordt verbeterd.
- Ziekterelevant systeem: Drosophila-embryo's die ziekte-geassocieerde GFP-reporters tot expressie brengen, kunnen worden gebruikt om modulatie van signaalpaden in vivo te monitoren.
Integratie van Pipeline & Workflow
Het hanging drop-protocol past binnen het continuüm van ontdekkingen, van targetvalidatie tot lead-identificatie, in het bijzonder voor assays die dynamische, niet-gecomprimeerde beeldvorming van genetisch gecodeerde reporters vereisen.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt het testen van hypothesen door directe visualisatie van de effecten van gene knockdown of overexpressie op de embryonale morfogenese mogelijk te maken.
- Screening: Levert kwantitatieve, tijdopgeloste fluorescentie-uitlezingen die essentieel zijn voor het vergelijken van de effecten van verbindingen of genetische condities.
- Analytiek: Genereert stabiele timelapse-gegevens van hoge kwaliteit die geschikt zijn voor morfometrische analyse en fenotypische kwantificering.
- Translationeel onderzoek: Verbindt genetische bevindingen in Drosophila met geconserveerde pathways, wat bijdraagt aan de selectie van targets voor vertebratenmodellen.
- Bedrijfsmatige hergebruik: De eenvoud en de lage kosten van het protocol maken brede adoptie door teams mogelijk als een gestandaardiseerde methode voor beeldpreparatie.
Operationele & Bedrijfsmatige Impact
- Wetenschappelijke waarde: Verbetert het voorspellend vertrouwen door compressie-artefacten te elimineren en fysiologische omstandigheden tijdens de beeldvorming te handhaven.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde vochtigheidsregeling, gasuitwisseling en embryohandtering.
- Strategische waarde: Vermindert biologische ruis in screeningscampagnes, wat de gevoeligheid van de assay verhoogt en het aantal fout-positieven verlaagt.
- Impact op portfolio: Maakt betrouwbaardere go/no-go-beslissingen mogelijk bij targetvalidatie door het leveren van fenotypische gegevens met een hogere getrouwheid.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in de hantering van Drosophila-embryo's en dechorioneringstechnieken.
- Afhankelijk van de toegang tot halokoolstofoliën en basisinstrumenten voor microfabricage voor de preparatie van de kamer.
- Vereist standaardisatie van de embryo-leeftijd, het genotype en de consistentie van de montage tussen verschillende gebruikers.
- Aanpassing aan andere modelsystemen kan optimalisatie van het drijfvermogen van de olie en de geometrie van de kamer vereisen.
- Praktische beperking: Meest geschikt voor embryo's die blijven drijven in halokoolstofolie; niet toepasbaar op dichtere of adhesieve celtypen.
Veelgestelde vragen over biofarmaceutica
Chapters in this video
0:00
Title
0:15
Introduction
1:52
Step 1: Collect Embryos
2:24
Step 2: Prepare a Dechorionation Slide
2:51
Step 3: Prepare Imaging Chamber
3:32
Step 4: Place Halocarbon Oil on a Coverslip
4:05
Step 5: Picking Embryos From Plates
4:38
Step 6: Place Embryos onto Tape
5:01
Step 7: Roll Embryos to Remove the Chorion
6:15
Step 8: Transfer Embryos to Halocarbon Oil
6:47
Step 9: Push Embryos to Bottom of Oil
7:14
Step 10: Invert Coverslip on Live Imaging Chamber
7:38
Step 11: Secure Coverslip with Tape
