Name: De voorbereiding van Drosophila Embryos voor Live-Imaging Met behulp van de Opknoping Drop Protocol (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-13T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Leer de hanging drop methode voor live-imaging van Drosophila embryo's met behoud van vocht en gaswisseling. Dit protocol voorkomt compressie en is geschikt voor GFP-gebaseerde fluorescentiemicroscopie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij dankbaar erkennen steun aan BHR door middel van een Discovery Grant als een research tools en Instrument Grant van het Natural Sciences and Engineering Research Council van Canada (NSERC). Erkennen wij ook H. Oda en de Bloomington Drosophila voorraad Centrum voor het aanbieden van genetische aandelen die werden gebruikt in het voorbeeld live-imaging sequenties.

Voorbereiding <ol><li> Verzamel embryo&#39;s op standaard druivensap agarplaten 4. Het is handig om een ​​geautomatiseerde Drosophila Egg Collector (flymax Scientific Equipment BV) te gebruiken. Met behulp van synchrone geënsceneerde embryo collecties zal het aantal dechorionations die moeten worden uitgevoerd om voldoende aantallen embryo&#39;s te verkrijgen bij de gewenste ontwikkelingsstadium te verminderen. </li><li> Bereid een dechorionation dia door het aanbrengen van een stukje dubbelzijdige tape op een objectglaasje, verwijder de steun van de tape. </li><li> De voorbereiding van de live-imaging kamer door het snijden van een stukje weefsel te passen in de put van de kamer. Plaats het weefsel in de put en nat met gedestilleerd water. </li><li> Mix halogene olie (Halocarbon Products Corp) viscositeit serie 700 en serie 56 in een verhouding van 1:1. Het mengsel kan worden opgeslagen en voor onbepaalde tijd worden gebruikt. </li><li> Plaats een aantal kleine druppels halogene olie op het oppervlak van een dekglaasje (22 X 40 mm, nr. 2). Het volume is niet kritisch, maar moet in de orde van 20-40 ul. </li></ol> Procedure <ol><li> Met behulp van een stereomicroscoop, het verzamelen van embryo&#39;s uit het druivensap-agar platen met behulp van een paar van juwelier de pincet (nr. 5) of een zeer fijn penseel. Embryo&#39;s hebben de neiging vast te houden aan elkaar en aan de tang &#39;tips, ze zijn gemakkelijk te verzamelen in groepjes. </li><li> Met behulp van een stereomicroscoop, voorzichtig lager de pollen van de embryo&#39;s die aan de uiteinden van de tang gehandeld op het oppervlak van de tape op de dechorionation dia. </li><li> Opnieuw met behulp van de stereomicroscoop, zacht duwtje of een beroerte de embryo&#39;s met de zijkant van de tang, om open te breken de buitenste wasachtige chorion zonder open te barsten de binnenste vitelline membraan (het embryo zal barsten wanneer de vitelline membraan is gescheurd). </li><li> Zodra de buitenste chorion is gescheurd, plagen het embryo uit het chorion, de dechorionated embryo heeft de neiging om zich aan het oppervlak van de tang. Zorg ervoor om te voorkomen dat het aanraken van de dechorionated embryo aan het oppervlak van de tape. </li><li> Zodra een embryo dechorionated is, zo snel mogelijk in de vooraf bereide druppel halogene olie op het dekglaasje. Raak het uiteinde van de tang het dragen van de dechorionated embryo aan het oppervlak van de halogene oliedruppel - dit loskomt het embryo uit de tang in de olie. </li><li> Bevestigen dat de overdracht van het embryo om de olie te laten vallen. Dit kan gedaan worden met het blote oog op voorwaarde dat je werkt op een zwarte achtergrond en het gebruik van een glasvezel-verlichting bron ingesteld op een schuine hoek. </li><li> Voordat u probeert om een ​​ander embryo dechorionate, schoon geen olie uit de tang. Pincet gecoat in olie minder te kopen op het chorion oppervlak, waardoor dechorionation moeilijker. </li><li> Dechorionated embryo&#39;s worden drijfvermogen in de halogene olie. Met behulp van een tang of een penseel en terwijl u door middel van een stereomicroscoop, het embryo druk aan de onderkant van de olie te laten vallen en regelen in de gewenste positie. </li><li> Snel omdraaien van de dekglaasje over de bron van de live imaging kamer. Bevestigen dat de embryo&#39;s rusten tegen de dekglaasje in de gewenste richting. Door hun drijfvermogen in de olie, zal de embryo&#39;s zweven nu tegen de onderkant van het dekglaasje. Bevestig de dekglaasje naar de live imaging kamer met tape. Ventileer de kamer door te snijden gaten in de tape in het gebied waar de tape overspant de kloof tussen het einde van de dekglaasje en het einde van de bron van de live imaging kamer. </li><li> Een rechtopstaande fluorescentie microscoop of een fluorescentie stereomicroscoop kan nu gebruikt worden om het imago van de embryo&#39;s. </li></ol>

<ol><li>Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+forces+contribute+to+cell+sheet+morphogenesis+for+dorsal+closure+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila.</a> J. Cell Biol. 149, 471-490 (2000).</li>
<li>Schock, F., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+processes+associated+with+germ+band+retraction+in%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Cellular processes associated with germ band retraction in.</a> , 248-2429 (2002).</li>
<li>Reed, B. H., Wilk, R., Schock, F., Lipshitz, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-dependent+apposition+of+Drosophila+extraembryonic+membranes+promotes+morphogenesis+and+prevents+anoikis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrin-dependent apposition of Drosophila extraembryonic membranes promotes morphogenesis and prevents anoikis.</a> Curr. Biol. 14, 372-380 (2004).</li>
<li>Wieschaus, E. p, Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWieschaus%2C+Ep+%22Drosophila%3A+a+practical+approach%22">Drosophila: a practical approach</a>. Roberts, D. B. , IRL Press Limited. Oxford, England. 199-227 (1986).</li>
</ol>

Beschrijven we een nieuwe methode voor het bereiden Drosophila embryo&#39;s voor live-imaging-analyse, die we de opknoping druppel protocol. Helaas is het niet mogelijk om de opknoping druppel protocol te gebruiken bij het werken met een omgekeerde microscoop. In dit geval de daartussen techniek (zoals beschreven in de samenvatting hierboven) moet worden gebruikt en compressie van de embryo&#39;s blijft een punt van zorg. In experimenten waar de cel vorm en grootte worden gemeten om krachten...

Standaard uitrusting en materialen die nodig zijn om embryo&#39;s voor te bereiden op live-imaging met behulp van de opknoping druppel protocol zijn de volgende items: microscoopglaasjes, dekglaasjes (22 x 40 mm, nr. 2), dubbelzijdig plakband, juwelier pincet (Dumont stijl nr. 5 ), halogene olie-serie 56 en serie 700 (Halocarbon Products Corp), een mes of een enkele rand scheermesje, tissue papier, schaar, gedestilleerd water, voor algemeen gebruik tape, en een pipet geschikt is voor het leveren van 20 tot 40 pl. De live imaging protocol vereist ook een custom-made live-imaging kamer. Dit wordt voorbereid door het snijden van een 5 mm denk polycarbonaat plastic folie aan de afmetingen van een standaard microscoop slide (75 x 25 mm) en met behulp van een rotor met een 3 mm diepe depressie te creëren in de foto (20 x 55 mm). Toegang tot een stereomicroscoop (dissectiemicroscoop) en een glasvezel-verlichting bron is ook vereist.

de voorbereiding van drosophila embryo&#39;s voor live-imaging met behulp van de opknoping drop protocol

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Groen fluorescerend eiwit (GFP)-gebaseerde timelapse live-imaging is een krachtige techniek voor het bestuderen van de genetische regulatie van dynamische processen zoals weefsel morfogenese, cel-cel adhesie, of celdood. Drosophila embryo&#39;s uitdrukken GFP zijn gemakkelijk beeld gebracht met behulp van stereoscopische of confocale microscopie. Een doel van een live-imaging protocol is het minimaliseren van nadelige effecten zoals uitdroging en hypoxie. Eerdere protocollen voor het bereiden van Drosophila embryo&#39;s voor live-imaging analyse hebben betrokken plaatsen dechorionated embryo&#39;s in halogene olie en daartussen ze tussen een halogene gas-permeabel membraan en een dekglaasje<sup&gt; 1-3</sup&gt;. De introductie van compressie door de montage van embryo&#39;s op deze manier is een ongewenste complicatie voor een biomechanische-gebaseerde analyse van morfogenese. Onze methode, die we de opknoping druppel protocol, resulteert in uitstekende levensvatbaarheid van de embryo&#39;s tijdens live beeldvorming en vereist niet dat embryo&#39;s worden gecomprimeerd. Kortom, de opknoping druppel protocol heeft betrekking op de plaatsing van embryo&#39;s in een daling van de halogene olie die is opgehangen aan een dekglaasje, die op zijn beurt, gefixeerd in positie over een vochtige kamer. Naast het leveren van gas uit te wisselen en het voorkomen van uitdroging, dit arrangement maakt gebruik van het drijfvermogen van de embryo&#39;s in halogene olie om te voorkomen dat ze drijven uit positie tijdens timelapse overname. Deze video beschrijft in detail hoe het verzamelen en Drosophila embryo&#39;s voor te bereiden op live-imaging met behulp van de opknoping druppel protocol. Dit protocol is geschikt voor de beeldvorming dechorionated embryo&#39;s met behulp van stereomicroscopie of rechtop samengestelde fluorescentie microscoop.

Een eenvoudige, goedkope en effectieve methode voor de bereiding Drosophila embryo&#39;s voor live-imaging analyse wordt gepresenteerd. Onze-protocol zorgt voor vochtigheid en gas uit te wisselen en comprimeert niet de Drosophila embryo. Deze methode is geschikt voor het GFP-gebaseerde live beeldvorming van Drosophila embryo&#39;s met behulp van een stereomicroscoop of rechtop samengestelde microscoop.

De voorbereiding van Drosophila Embryo&#39;s voor Live-Imaging Met behulp van de Opknoping Drop Protocol

Timelapse live-imaging op basis van groen fluorescent eiwit (GFP) is een krachtige techniek voor het bestuderen van de genetische regulatie van dynamische processen zoals ...

Hallo. Mijn naam is Bruce Reed. Ik ben universitair docent bij de Afdeling Biologie van de University of Waterloo in Waterloo, Ontario, Canada. Vandaag maken we dit videoarchief om een nieuwe techniek te documenteren die we hebben ontwikkeld voor het prepareren van your softly-embryo's voor live-imaginganalyse.Bij het uitvoeren van live-imaginganalyse met drosophila-embryo's maken we frequent gebruik van time-lapse acquisitie, wat enkele uren kan duren. Daarom is het belangrijk om een techniek te hebben waarbij de embryo's worden beschermd tegen zowel uitdroging als hypoxie. Daarnaast willen we een techniek ontwikkelen die elke compressie van het embryo voorkomt.Voor het monteren hebben we een zeer eenvoudige, goedkope en effectieve methode ontwikkeld die we de 'hanging drop'-preparatie noemen. De hanging drop-preparatie is geschikt voor live-imaginganalyse van embryo's met behulp van stereomicroscopie of elke rechtopstaande compoundmicroscoop. Deze time-lapse movie laat acht GFP-expresserende embryo's zien die zijn geprepareerd volgens het hanging drop-protocol en zijn vastgelegd met time-lapse fluorescentiemicroscopie.Deze beeldsequentie representeert een verstreken tijd van meer

the-preparation-drosophila-embryos-for-live-imaging-using-hanging

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Drosophila hemocytes verspreiden over het geheel van de zich ontwikkelende embryo. Dit protocol laat zien hoe te monteren en het imago van deze migraties met behulp van embryo's met fluorescent gelabelde hemocytes.

Live-beeldvorming van Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migraties

Voorbereiden Individuele Drosophila Egg Chambers voor Live Imaging

De kinetochoor is waar de SAC initieert het signaal het toezicht op de mitotische segregatie van de zuster chromatiden. Een methode wordt beschreven om de werving en de omzet van een van de kinetochoor eiwitten en de coördinatie te visualiseren met het chromosoom beweging...

Studeren Mitotische Checkpoint door te laten zien Dynamic kinetochoor Protein Gedrag en Chromosoom Motion in Living<em&gt; Drosophila</em&gt; Syncytieel Embryo&#39;s

Deze video beschrijft hoe u micro-invoegingen uitvoert die reagentia leveren in levende Drosophila-embryo's. Onderzoekers kunnen deze methode gebruiken om exogene verbindingen zoals nucleïnezuren en eiwitten te introduceren tijdens de vroege stadia van embryo-ontwikkeling. Het aanbevolen protocol demonstreert hoe de procedure voor injectie van een oplosbaar reagens moet worden opgezet en uitgevoerd - hier een fluorescerend eiwit voor live beeldvormingsexperimenten.

Micro-injection van Levende Embryo's Drosophila: Vroege Levering van Reagentia aan het Ontwikkelende Embryo

Hier beschrijven we een effectieve methode voor het bestuderen dynamica van apoptotische cel...

Wonen Imaging van apoptotische cel Clearance tijdens<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

Dit protocol presenteert een efficiënte methode voor het beeldvormen van het levende Drosophila pupale oogneuro-epitheel. Deze methode compenseert voor weefselbeweging en ongelijke topologie, verbetert de visualisatie van celgrenzen door het gebruik van meerdere GFP-gelabelde junctie-eiwitten en maakt gebruik van een eenvoudig te monteren beeldvormingsopstelling.

Live-beeldvorming van de Drosophila Pupal Eye

Hier gepresenteerd is een protocol om micro-injectie en tegelijkertijd beeld meerdere Drosophila embryo's tijdens de embryonale ontwikkeling met behulp van een plaat-gebaseerde, hoog gehalte imager.

Drosophila Embryo Preparatuur en microinjectie voor live celmicroscopie uitgevoerd met behulp van een geautomatiseerde high content analyzer

Op lichtplaten gebaseerde fluorescentiemicroscopie is het meest waardevolle hulpmiddel in de ontwikkelingsbiologie. Een belangrijk probleem in vergelijkende studies is de variantie van de omgeving. Ons protocol beschrijft een experimenteel kader voor gelijktijdige live beeldvorming van meerdere specimens en pakt dit probleem daarom proactief aan.

Gelijktijdige live beeldvorming van meerdere insectenembryo's in op de kamer gebaseerde fluorescentiemicroscopen

Hier bieden we een dissectieprotocol dat nodig is om de late embryonale Drosophila mannelijke geslachtsklier live in beeld te brengen. Dit protocol zal observatie van dynamische cellulaire processen onder normale omstandigheden of na transgene of farmacologische manipulatie mogelijk maken.

Dissectie en live-imaging van de late embryonale drosophila gonad

In het vroege Drosophila-embryo zijn veel organellen beweeglijk. In principe kunnen ze live worden afgebeeld via specifieke fluorescerende sondes, maar de eierschaal voorkomt directe toepassing op het embryo. Dit protocol beschrijft hoe dergelijke sondes via micro-injectie kunnen worden geïntroduceerd en vervolgens bulk organelbeweging kan worden geanalyseerd via deeltjesbeeld velocimetrie.

Visualisatie van cytoskeletafhankelijke handel in lipidenbevattende organellen in drosophila-embryo's

Dit protocol beschrijft de op maat gemaakte op antilichamen gebaseerde fluorescentie-etikettering en injectie in vroege Drosophila-embryo's om live beeldvorming van eiwitten met een lage abundantie of posttranslationele modificaties mogelijk te maken die moeilijk te detecteren zijn met behulp van traditionele GFP/mCherry-tag-benaderingen.

Visualisatie van eiwitten met een lage abundantie en posttranslationele modificaties in levende Drosophila-embryo's via fluorescerende antilichaaminjectie

Leer de hanging drop methode voor live-imaging van Drosophila embryo's met behoud van vocht en gaswisseling. Dit protocol voorkomt compressie en is geschikt voor GFP-gebaseerde fluorescentiemicroscopie.

De voorbereiding van Drosophila Embryo's voor Live-Imaging Met behulp van de Opknoping Drop Protocol

Meer video's verkennen