Name: Een high-throughput methode om wereldwijd de studie van de morfologie organel in S. cerevisiae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-02T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Leer een high-throughput methode voor het visualiseren van organel-morfologie in Saccharomyces cerevisiae met behulp van GFP-markers en confocale microscopie. Deze aanpak versnelt genetische screenings aanzienlijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de biotechnologie en biologische wetenschappen Research Council (subsidie ​​31/C15982), de Canadese Institutes of Health Research, de Canada Foundation for Innovation, de British Columbia Kennis Ontwikkeling, het Michael Smith Foundation for Health Research (te verlenen aan CJR Loewen) en Fight For Sight.

Materialen en methoden: <ol><li> Giststammen: <ul><li> Acp1-GFP (GFP:: Zijn): C-terminale GFP-tagging van Acp1 werd gegenereerd door een PCR-gemedieerde homologe recombinatie met behulp van plasmide pKT128 (bevat GFP en HIS5). Positieve transformanten werden bevestigd door confocale microscopie en kolonie PCR. De stam achtergrond was BY7043 (MAT alpha can1Δ:: STE2pr-lue2 lyp1Δ his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0) uit Boone lab (Tong en Boone, 2006). </li><li> Deletiemutant Array (DMA) (xxx:: KanR): het is een serie van ongeveer 5.000 deletiemutanten van niet-essentiële genen. Al deze niet-essentiële genen waren uitgeschakeld op G418. De spanning achtergrond van de array is BY4741 (MATA his3_1 leu2_0 met15_0 ura3_0). Onze DMA kwam oorspronkelijk uit Boone lab. </li></ul></li><li> Waarin Acp1-GFP in de DMA: Het volgende protocol voor het maken van een GFP-array is een bewerking van de Synthetic Genetic Analysis (SGA) technologie (Tong en Boone, 2006) met wijzigingen. Alle replica pinning stappen zijn gedaan met behulp van een Singer ROTOR high-density arraying robotsysteem. Als alternatief kan manueel pinning of een vloeistof op basis van high-density arraying robot gebruikt worden. Acroniemen: YPD, gistextract-pepton-dextrose, SD, synthetische uitval, LRK, Lue / Arg / Lys uitval media; LHRK, Lue / Zijn / Arg / Lys uitval media Voorbereiding <ol><li> Groeien een grasveld van Acp1-GFP-cellen door het gieten van een 5 ml &#39;s nachts Acp1-GFP cultuur op een YPD plaat. Laat de plaat voldoende droog zijn door een vlam of in een biologisch zuurkast. </li><li> Incubeer de plaat bij 30 ˚ C &#39;s nachts. </li><li> Met behulp van een robot, array Acp1-GFP zeef in 1536 kolonies per plaat. Op hetzelfde moment, bereiden een nieuwe kopie van de DMA door replica pinnen aan YPD + G418 platen. </li><li> Incubeer de platen bij 30 ˚ C gedurende de nacht. Paring en diploïde selectie </li><li> Mate van de Acp1-GFP stam met de DMA door replica pinnen en over-leggen van de kolonies op YPD platen. </li><li> Incubeer de platen bij 30 ˚ C gedurende de nacht. </li><li> Replica-plaat de kolonies op SD - Zijn + G418 platen om diploïde cellen (MATA / MATalpha) te selecteren. </li><li> Incubeer de platen bij 30 ˚ C gedurende de nacht. Sporulationg en kieming </li><li> Replica-plaat van de diploïde kolonies op verbeterde sporulatie media, die verlaagde niveaus van koolstof en stikstof-bronnen om de vorming van meiotische sporen opwekken bevat. </li><li> Incubeer de platen bij 25 ˚ C voor een minimum van 5 dagen. </li><li> Ontkiemen de Mata meiotische nakomelingen van replica-plating de kolonies op LRK media en incubeer de platen bij 30 ˚ C voor twee dagen. </li><li> Deze media zal leiden de kieming van haploïde cellen van sporen. Aangezien een LUE2 opening reading frame (ORF) is geïntegreerd in de Mata-specifieke STE2 promotor, zullen alle ontkiemd de haploiden worden Mata. Selectie van beide allelen </li><li> Het is nu nodig om zowel de GFP-allel en het ene mutant allel te selecteren. Om dit te bereiken, Mata cellen replica-uitgeplaat op LRK + G418 media, die selecteert voor haploïde cellen die het gen deletie (xxx:: kanR) dragen. </li><li> Incubeer de platen bij 30 ˚ C gedurende de nacht. </li><li> Tot slot, de Mata meiotische nakomelingen zijn replica-uitgeplaat op LHRK + G418 media te selecteren voor de groei van enkele mutanten (xxx:: kanR) ook herbergen Acp1-GFP (GFP:: Zijn). Deze platen kunnen worden opgeslagen bij 4 ˚ C voor maximaal 3 maanden. </li></ol> Het volgende protocol voor het maken van een GFP-array is een bewerking van de Synthetic Genetic Analysis (SGA) technologie (Tong en Boone, 2006) met wijzigingen. Alle replica pinning stappen zijn gedaan met behulp van een Singer ROTOR high-density arraying robotsysteem. Als alternatief kan manueel pinning of een vloeistof op basis van high-density arraying robot gebruikt worden. Acroniemen: YPD, gistextract-pepton-dextrose, SD, synthetische uitval, LRK, Lue / Arg / Lys uitval media; LHRK, Lue / Zijn / Arg / Lys uitval media Voorbereiding </li><li> Microscopie: <ol><li> Kies de gewenste mutant (s) uitdrukken Acp1-GFP rechtstreeks uit plaat. </li><li> Grow-cellen bij 30 ° C in YPD of SD - Zijn de media te vroeg log-fase. </li><li> Visualiseren door confocale microscopie met het GFP filterset. Een voorbeeld van verwachte resultaat is weergegeven in figuur 1. </li></ol></li></ol> SGA media: De groei van media (YPD) en het selecteren van media (SD) die in dit protocol wordt routinematig gebruikt in gist moleculaire biologie. Verwijzen wij u naar Methods in Yeast (Amberg et al.., 2005) voor gedetailleerde beschrijvingen. LRK, LHRK media (voor 400 ml totaal) <table border="0"><tbody><tr><td> Toe te voegen om </td><td> Aantal </td></tr><tr><td> Gist stikstofbase met ammoniumsulfaat </td><td> 2,7 g </td></tr><tr><td> Aminozuurmengen </td><td> 0,8 g </td></tr><tr><td> Agar-agar </td><td> 8 g </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> 360 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclaaf </td></tr><tr><td> 20% Dextrose </td><td> 40 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Afkoelen tot 65 ˚ C </td></tr><tr><td> 100 mg / ml Canavanine </td><td> 0,2 ml </td></tr><tr><td> 100 mg / ml thialysine </td><td> 0,2 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Mix, giet 50 ml per plaat </td></tr></tbody></table> LRK, LHRK + G418 media (voor 400 ml totaal) <table border="0"><tbody><tr><td> Toe te voegen om </td><td> Aantal </td></tr><tr><td> Gist stikstofbase zonder ammoniumsulfaat </td><td> 0,7 g </td></tr><tr><td> Aminozuur mix </td><td> 0,8 g </td></tr><tr><td> Mononatriumglutamaat </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> Agar-agar </td><td> 8 g </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> 360 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclaaf </td></tr><tr><td> 20% Dextrose </td><td> 40 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Afkoelen tot 65 ˚ C </td></tr><tr><td> 100 mg / ml Canavanine </td><td> 0,2 ml </td></tr><tr><td> 100 mg / ml thialysine </td><td> 0,2 ml </td></tr><tr><td> 200 mg / ml G418 </td><td> 0,4 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Mix, giet 50 ml per plaat </td></tr></tbody></table> Verrijkt sporulatie media (voor 400 ml totaal) <table border="0"><tbody><tr><td> Toe te voegen om </td><td> Aantal </td></tr><tr><td> Kaliumacetaat </td><td> 4 g </td></tr><tr><td> Gistextract </td><td> 0,4 g </td></tr><tr><td> Dextrose </td><td> 0,2 g </td></tr><tr><td> Sporulatie aminozuur mix </td><td> 0,04 g </td></tr><tr><td> Agar-agar </td><td> 8 g </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> 360 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclaaf </td></tr><tr><td colspan="2"> Afkoelen tot 65 ˚ C </td></tr><tr><td> 200 mg / ml G418 </td><td> 0,4 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Mix, giet 50 ml per plaat </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAmberg%2C+DC+%22Methods+in+yeast+genetics+%3A+a+Cold+Spring+Harbor+Laboratory+course+manual%22">Methods in yeast genetics : a Cold Spring Harbor Laboratory course manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2005).</li>
<li>Tong, A. H., Boone, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+genetic+array+analysis+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthetic genetic array analysis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Mol Biol. 313, 171-192 (2006).</li>
</ol>

Deze methode kan efficiënt te voorzien van een mitochondriale marker, Acp1-GFP in verschillende mutant achtergronden. Zij baseert zich op het gebruik van een robotsysteem, en kan gemakkelijk aangenomen voor gebruik met een robotsysteem. Deze procedure kan ook worden gebruikt voor het opnemen van andere soorten markers. Bijvoorbeeld, om te visualiseren ER, we regelmatig gebruik maken van de marker ERG11-GFP. In onze representatieve beelden, een mutant en een wild-type met de Acp1-GFP maker werden visualiz ed door confoca...

<table><tbody><tr><td>SGA-media</td><td></td><td></td><td>De groeimedia (YPD) en synthetische dropout-media (SD), inclusief LRK en LHRK, en de verrijkte sporulatiemedia die in dit protocol worden gebruikt, zijn gangbaar in de gistmoleculaire biologie. Raadpleeg voor gedetailleerde beschrijvingen Methods in Yeast (Amberg et al., 2005).</td></tr></tbody></table>

een high-throughput methode om wereldwijd de studie van de morfologie organel in s. cerevisiae

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methoden voor het eiwit lokalisatie of organel morfologie te onderzoeken is een effectief instrument voor het bestuderen van eiwit-interacties en kan helpen om een ​​uitgebreide kennis van de moleculaire pathways. In Saccharomyces cerevisiae, met de ontwikkeling van de niet-essentiële gendeletie array, kunnen we wereldwijd de studie van de morfologie van de verschillende organellen zoals het endoplasmatisch reticulum (ER) en de mitochondriën met behulp van GFP (of variant)-merkers in de verschillende genen achtergronden. Echter, waarin GFP markers in elke afzonderlijke mutant is individueel een arbeidsintensief proces. We beschrijven hier een procedure die routinematig gebruikt wordt in ons laboratorium. Door het gebruik van een robotsysteem voor high-density gist arrays en drugs selectie technieken te behandelen, kunnen we aanzienlijk verkorten van de tijd die nodig is en de verbetering van de reproduceerbaarheid. Kortom, steken we een GFP-gelabelde mitochondriale marker (Apc1-GFP) om een ​​hoge dichtheid array van 4672 niet-essentiële genen deletiemutanten door robotachtige replica pinnen. Door middel van diploïde selectie, sporulatie, kiemkracht en dubbele marker selectie, we herstellen beide allelen. Als gevolg daarvan, elk haploïde enkele mutant bevat Apc1-GFP opgenomen in zijn genomische locus. Nu kunnen we de studie van de morfologie van de mitochondria in alle niet-essentiële mutant achtergrond. Met behulp van deze high-throughput benadering, kunnen we gemakkelijk bestuderen en af ​​te bakenen van de paden en genen die betrokken zijn bij de erfenis en de vorming van organellen in een genoom-brede setting.

GFP-fusie-eiwitten worden op grote schaal gebruikt om de organellen visualiseren door confocale microscopie. Echter, screening voor mutaties die de morfologie van organellen invloed vereist in het algemeen individueel mutagenese en is tijdrovend. Hier tonen we een methode om simultaan te nemen organel-GFP markers in bijna 5.000 niet-essentiële genen in gist.

Een high-throughput methode om wereldwijd de studie van de morfologie organel in S. cerevisiae

High-throughputmethoden om de eiwitlokalisatie of organelmorfologie te onderzoeken, vormen een effectief instrument voor het bestuderen van eiwitinteracties en kunnen helpen ...

Deze procedure begint met het voorbereiden van een array van een CP one GFP door eerst een cellijn te kweken en vervolgens de array op een nieuwe plaat uit te zetten. Bereid gelijktijdig een nieuwe kopie van DMA voor. Vervolgens paren we de ACP one GFP-array met de DMA en selecteren we diploïden, die daarna worden gesporuleerd op sporulatiemedium.Vijf dagen later worden de myotische nakomelingen uitgezaaid op LRK-medium, waarop alleen MAT A haploïden zullen groeien. Via twee aanvullende selectierondes isoleren we haploïde cellen die zowel ACP one GFP dragen als een gene-knock-out voor canmycine. Ten slotte kunnen individuele stammen direct van de plaat worden gepikt om de mitochondriale morfologie via confocale microscopie te observeren.Hallo, ik ben Chap T van het Law Lab van de Afdeling Cel- en Ontwikkelingsbiologie aan het Life Science Institute van de University of British Columbia. Hallo, ik ben Jesse Chao, ook van het Loan Lab. Vandaag laten we u een high-throughput methode zien voor het inbouwen van GFP-markers in diverse mutant-achtergronden in gist met behulp van een robotisch systeem.We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de morfologie van organellen zoals D,

a-high-throughput-method-to-globally-study-organelle-morphology-s

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Gendeletie en eiwit overexpressie zijn gemeenschappelijke methoden voor het bestuderen van functies van eiwitten. In dit artikel beschrijven we een protocol voor de analyse van fenotype ontwikkeling als een functie van de proteïne concentratie op de bevolking en de single-cell niveau...

Analyse van de ontwikkeling van een morfologische fenotype als een functie van de eiwitconcentratie in gist

Een robuuste benadering van de levering van organellen monitor aan op de zure lumen van de gist vacuole voor afbraak en recycling wordt beschreven. De methode is gebaseerd op de specifieke etikettering van target organellen met een genetisch gecodeerd dual-emissie fluorescentie pH-biosensor, en visualisatie van individuele cellen met behulp van fluorescentie microscopie.

Een fluorescentie microscopie Assay voor de bewaking Mitophagy in de Gist Saccharomyces cerevisiae

Kwantitatieve Live Cell Fluorescentie-microscopie analyse van Fission Yeast

Dit protocol beschrijft de analyse van fluorescently gelabelde intracellulaire compartimenten in ontluikende gist met behulp van Multi-Color 4D (time-lapse 3D) confocale microscopie. De beeldvormings parameters worden gekozen om adequate signalen vast te leggen en foto schade te beperken. Met aangepaste ImageJ-plug-ins kunnen gelabelde structuren worden bijgehouden en kwantitatief worden geanalyseerd.

4D microscopie van gist

Hier presenteren we live-celbeeldvorming die een niet-toxische microscopie methode is die onderzoekers in staat stelt om eiwit gedrag en nucleaire dynamiek in levende splijting gistcellen te bestuderen tijdens mitose en meiosis.

Onderzoek van de kern dynamiek van de mitotische en Meiotische splijtstof gist door fluorescentie-Live-cel microscopie

Gistgroei fenotypes worden nauwkeurig gemeten door middel van zeer parallelle time-lapse beeldvorming van geïmmobiliseerde cellen die uitgroeien tot microkolonnies. Tegelijkertijd kunnen stresstolerantie, eiwitexpressie en eiwitlokalisatie worden gemonitord, waardoor geïntegreerde datasets worden gegenereerd om te bestuderen hoe omgevings- en genetische verschillen, evenals genexpressie heterogeniteit tussen isogene cellen, de groei moduleren.

Live imaging met hoge doorvoer van microkolonnies om heterogeniteit in groei en genexpressie te meten

Ondanks recente vooruitgang blijven veel mitochondriale gisteiwitten nog steeds met hun functies volledig onbekend. Dit protocol biedt een eenvoudige en betrouwbare methode om de submitchondriale lokalisatie van eiwitten te bepalen, wat fundamenteel is geweest voor de opheldering van hun moleculaire functies.

Beoordeling van submitchondrial protein localization in ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae

Time-lapse microscopie is een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van meiose in ontluikende gist. Dit protocol beschrijft een methode die celcyclussynchronisatie, time-lapse-microscopie en voorwaardelijke uitputting van een doeleiwit combineert om aan te tonen hoe de functie van een specifiek eiwit tijdens meiotische chromosoomsegregatie kan worden bestudeerd.

Gebruik van time-lapse microscopie en stadiumspecifieke nucleaire uitputting van eiwitten om meiose in S. cerevisiae te bestuderen

Splijtingsgist wordt hier gebruikt als een heterologe gastheer om bacteriële cytoskeletale eiwitten zoals FtsZ en MreB tot expressie te brengen als translationele fusie-eiwitten met GFP om hun polymerisatie te visualiseren. Ook worden verbindingen die de polymerisatie beïnvloeden geïdentificeerd door beeldvorming met behulp van een fluorescentiemicroscoop.

Splijtingsgist als platform voor antibacteriële geneesmiddelenschermen gericht op bacteriële cytoskeleteiwitten

Dit protocol beschrijft twee methoden voor het stoppen van de gistcelcyclus en optionele afgifte, en gaat dieper in op het gebruik van fluorescentiemicroscopie om celcyclusafhankelijke processen in S. cerevisiae te bestuderen.

Manipulatie en analyse van celcyclusafhankelijke processen in ontluikende gist

Leer een high-throughput methode voor het visualiseren van organel-morfologie in Saccharomyces cerevisiae met behulp van GFP-markers en confocale microscopie. Deze aanpak versnelt genetische screenings aanzienlijk.

Een high-throughput methode om wereldwijd de studie van de morfologie organel in S. cerevisiae

Meer video's verkennen