Een high-throughput methode om wereldwijd de studie van de morfologie organel in S. cerevisiae
2 maart 2009
GFP-fusie-eiwitten worden op grote schaal gebruikt om de organellen visualiseren door confocale microscopie. Echter, screening voor mutaties die de morfologie van organellen invloed vereist in het algemeen individueel mutagenese en is tijdrovend. Hier tonen we een methode om simultaan te nemen organel-GFP markers in bijna 5.000 niet-essentiële genen in gist.
Deze procedure begint met het voorbereiden van een array van een CP one GFP door eerst een cellijn te kweken en vervolgens de array op een nieuwe plaat uit te zetten. Bereid gelijktijdig een nieuwe kopie van DMA voor. Vervolgens paren we de ACP one GFP-array met de DMA en selecteren we diploïden, die daarna worden gesporuleerd op sporulatiemedium.
Vijf dagen later worden de myotische nakomelingen uitgezaaid op LRK-medium, waarop alleen MAT A haploïden zullen groeien. Via twee aanvullende selectierondes isoleren we haploïde cellen die zowel ACP one GFP dragen als een gene-knock-out voor canmycine. Ten slotte kunnen individuele stammen direct van de plaat worden gepikt om de mitochondriale morfologie via confocale microscopie te observeren.
Hallo, ik ben Chap T van het Law Lab van de Afdeling Cel- en Ontwikkelingsbiologie aan het Life Science Institute van de University of British Columbia. Hallo, ik ben Jesse Chao, ook van het Loan Lab. Vandaag laten we u een high-throughput methode zien voor het inbouwen van GFP-markers in diverse mutant-achtergronden in gist met behulp van een robotisch systeem.
We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de morfologie van organellen zoals D, het endoplasmatisch reticulum en mitochondriën te bestuderen. Laten we beginnen. Voor dit protocol gebruiken we twee verschillende giststammen.
Een CP one GFP is een stam met een GFP-tag aan de C-terminus van ACP one, gegenereerd door PCR-gemedieerde homologe recombinatie met behulp van plasmide PKT 1 28. De stamachtergrond is BY 7 0 4 3. We maken daarnaast gebruik van de DMA-stam of deletion mutant array, wat een verzameling is van ongeveer 5 000 deletiemutanten van niet-essentiële genen.
Al deze niet-essentiële genen werden uitgeschakeld in G four 18. De stamachtergrond van de array is BY 47 41. Begin met het kweken van een colony van ACP one GFP-cellen door 5 mL van een overnight ACP one GFP-cultuur op een hiss-plaat te gieten.
Laat de plaat voldoende drogen met een vlam of in een biologische zuurkast. Zodra deze droog is, wordt de plaat gedurende de nacht geïncubeerd bij 30 °C. Na incubatie wordt een robot gebruikt om de A CP one GFP-stam te arrayen in 1.536 kolonies per plaat.
Bereid tegelijkertijd een verse kopie van de DMA voor door middel van replica-pinning op vier YPDG 18-platen. Incubeer de platen vervolgens gedurende de nacht bij 30 °C tot de stammen zijn gegroeid. Maak de A CP one GFP-stam met de DMA door replica-pinning en door de kolonies over te leggen op YPD-platen; incubeer de platen gedurende de nacht bij 30 °C.
Na incubatie wordt de replica-plaat met kolonies op SD hiss G four 18-platen geplaatst om gedeployeerde cellen te selecteren; incubeer de platen gedurende één nacht bij 30 °C. Om de sporulatie en kieming te starten, worden de diploïden eerst via replica-plating op YPDG four 18-platen geplaatst om de efficiëntie van de sporulatie in de volgende stap te verhogen. Na incubatie bij 30 °C gedurende één dag worden de diploïden via replica-plating overgebracht naar een medium voor verbeterde sporulatie, dat lagere concentraties koolstof- en stikstofbronnen bevat om de vorming van meiotische sporen te induceren.
Incubeer de platen vervolgens minimaal vijf dagen bij 25 °C. Laat na incubatie het matje, een myotisch nageslacht, kiemen door de kolonies via replica-plating over te brengen op LRK-medium. Dit medium induceert de kieming van tabloidcellen uit sporen; incubeer de platen twee dagen bij 30 °C om cellen te selecteren die zowel het GFP-allel als het enkelvoudige mutant-allel dragen.
Matt A-cellen worden via replica-plating overgebracht naar lade G four 18-medium, dat selecteert op haploïde cellen die de gen deletie dragen; incubeer deze platen gedurende één nacht bij 30 °C. Voer vervolgens replica-plating uit van het mat A-meiotische nageslacht op L-H-R-K-G four 18-medium om de groei van enkelvoudige mutanten te selecteren die tevens ACP1-GFP bevatten; incubeer gedurende één nacht bij 30 °C.
De platen kunnen vervolgens tot drie maanden worden bewaard bij vier graden Celsius. Om de gewenste mutanten die een CP one GFP tot expressie brengen direct vanaf de plaat te visualiseren, begint u met het selecteren van de gewenste kolonies van de platen. Kweek de cellen bij 30 graden Celsius in YPD- of SD hiss-medium tot de vroege logaritmische fase.
Visualiseer tot slot de mutanten met behulp van confocale microscopie met de GFP-filterset; in deze confocale afbeelding werden een mutant en een wildtype met de ACP1-GFP-marker gevisualiseerd via confocale microscopie om de mitochondriale morfologie te bestuderen. Deze specifieke mutant vertoont een verstoord mitochondriaal fenotype en is daarom een goede kandidaat voor verder onderzoek. We hebben u getoond hoe u efficiënt een multiclonaal label, ACP1-GFP, in de deletiemutant-array kunt incorporeren door gebruik te maken van een robotisch systeem.
Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de media vers te bereiden en de platen voldoende tijd te geven om te drogen. Als ze te vochtig zijn, zal er condensvorming optreden, wat de kans op contaminatie vergroot. Controleer daarnaast dubbel of alle selectiemedia correct zijn bereid, aangezien deze cruciaal zijn voor dit protocol.
Deze procedure kan ook worden gebruikt voor andere typen markers. Om bijvoorbeeld er te visualiseren, gebruiken we routinematig de markers air 11 en GSP. Dat is alles.
Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een methode voor het inbouwen van organel-GFP-markers in bijna 5.000 niet-essentiële genen in gist, waardoor het proces van het visualiseren van de organelmorfologie wordt gestroomlijnd. Door deze aanpak te gebruiken, kunnen onderzoekers efficiënt screenen op mutaties die de organelstructuur beïnvloeden.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Genetica
Achtergrond
- GFP-fusie-eiwitten zijn essentiële instrumenten voor het visualiseren van cellulaire structuren.
- Traditionele methoden voor het screenen van mutaties zijn arbeidsintensief.
- Gist dient als modelorganisme voor genetische studies.
- Confocale microscopie maakt gedetailleerde beeldvorming van organellen mogelijk.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een methode voor de gelijktijdige incorporatie van organelmarkers.
- Het faciliteren van de screening van mutaties die de morfologie van organellen beïnvloeden.
- Het verhogen van de efficiëntie van genetische studies in gist.
Gebruikte methoden
- Bereiding van een CP one GFP-array uit gekweekte cellen.
- Kruising van de GFP-array met een DMA om diploïden te selecteren.
- Sporulatie van diploïden op specifieke media.
- Observatie van de mitochondriële morfologie met behulp van confocale microscopie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle incorporatie van organel-GFP-markers in gistgenen.
- Efficiënte recuperatie van haploïde cellen met de gewenste genetische modificaties.
- Visualisatie van de organelmorfologie via confocale microscopie.
- Gestroomlijnd proces voor het screenen van genetische mutaties.
Conclusies
- De methode vermindert de benodigde tijd voor genetische screening aanzienlijk.
- Het biedt een robuust kader voor het bestuderen van de organelfunctie.
- Deze benadering kan worden toegepast op diverse genetische studies in gist.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Deze high-throughput methode voor de morfologie van gistorganellen maakt systematisch onderzoek naar genfuncties bij de biogenese van organellen mogelijk, wat targetvalidatie in vroege discovery-fasen ondersteunt. Door robotgestuurde array-handling te integreren met dual-marker selectie, levert het schaalbare, reproduceerbare fenotypische data voor mechanistische de-risking van genetische hits. De aanpak versnelt pathway-mapping en de prioritering van targets die de mitochondriale functie of de functie van het ER beïnvloeden in preklinische programma's.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt genoombrede beoordeling van gen-deleties op de mitochondriële morfologie mogelijk om targets die betrokken zijn bij de overerving van organellen te valideren.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van robotische pinning om 4.672 mutanten efficiënt te verwerken, waardoor handmatige arbeid wordt verminderd en de doorvoer wordt verhoogd.
- Voorspellende waarde: Identificeert genetische modulatoren van de organelstructuur om targets in een vroeg stadium van de discovery-pipeline te de-risken.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantificeerbare read-outs van de organelmorfologie via confocale microscopie voor standaardisatie van de assay.
- Operationele waarde: Produceert homozygote deletiestammen met geïntegreerde GFP-markers, wat een consistente expressie van de reporter over de gehele array waarborgt.
- Assay-gereedheid: Levert in arrays georganiseerde haploïde mutanten die klaar zijn voor compound-screening of genetische interactie-mapping.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele Continuïteit: Koppelt organelfenotypen in gist aan geconserveerde pathways die relevant zijn voor menselijke ziekte modellen.
- Mechanistische Risicoreductie: Verduidelijkt genfuncties bij de biogenese van organellen ter ondersteuning van targetselectie voor preklinische validatie.
- Pathway-elucidatie: Brengt genetische netwerken in kaart die de mitochondriële dynamiek aansturen om mechanisme-gebaseerde screening van verbindingen te informeren.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen de fase van vroege ontdekking tot aan de identificatie van leads door morfologische gegevens van organellen te verschaffen, die informatie geven over de betrouwbaarheid van het target en de relevantie van de signaalroute voorafgaand aan de screening van verbindingen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing van genfunctie bij organelvorming via systematische morfologische profilering.
- Screening: Maakt reproduceerbare, array-gebaseerde organelbeeldvorming mogelijk voor high-content screening van genetische of chemische perturbaties.
- Analytics: Levert op beeldvorming gebaseerde fenotypische read-outs waarmee mutantcondities kunnen worden vergeleken met wild-type controles.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt defecten in gist-organellen met geconserveerde cellulaire processen met potentiële relevantie voor preklinische ziektemodellen.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een herbruikbaar platform voor fenotypische screening van organellen over meerdere GFP-getagde markers.
Operationele en zakelijke impact
- Wetenschappelijke waarde: Biedt voorspellend vertrouwen bij targetvalidatie door genotype op schaal te koppelen aan het organelfenotype.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde robotische handling en een dual-selection workflow.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door parallelle evaluatie van duizenden genetische achtergronden mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Faciliteert risico-gecorrigeerde prioritering van targets op basis van organelmorfologie-fenotypes.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in gistgenetica, paring, sporulatie en fluorescentiemicroscopie.
- Is afhankelijk van robotische pinning-systemen en gecontroleerde incubatieomgevingen voor de verwerking van arrays.
- Vereist gestandaardiseerde mediapreparatie en selectieprotocollen om contaminatie te voorkomen en het herstel van mutanten te waarborgen.
- Omvat overwegingen voor adaptatie bij het toepassen van de methode op verschillende organelmarkers (bijv. ER versus mitochondria).
- Beperkt tot niet-essentiële genachtergronden; essentiële genen vereisen alternatieve benaderingen zoals conditionele allelen of CRISPRi.
