Zebravis hele Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridisatie
25 maart 2009
Hele monteren in situ hybridisatie is een van de meest gebruikte technieken in de ontwikkelingsbiologie. Hier presenteren wij een hoge resolutie dubbele fluorescente in situ hybridisatie protocol voor de analyse van de precieze expressiepatroon van een enkel gen en voor het bepalen van de overlap van de expressie-domeinen van twee genen. We nemen een propidiumjodide nucleair anti-vlek weefsel organisatie te markeren.
Deze procedure stelt ons in staat om patronen van genexpressie in zebravisembryo's met een hoge resolutie te bepalen, waarbij een antisense riboprobe wordt gehybridiseerd met het complementaire doel-mRNA. De gelabelde riboprobe wordt herkend door een antilichaam dat is geconjugeerd aan een peroxidase-enzym; aramide-geconjugeerde fluoro four wordt aan de embryo's toegevoegd en het peroxidase zet de IDE om in een zeer reactieve verbinding. Dit leidt tot een stabiele depositie van de fluoro four; ongebonden IDE wordt weggewassen, waardoor het gedetailleerde subcellulaire patroon van de mRNA-distributie zichtbaar wordt.
De expressie van een tweede gen kan worden waargenomen met behulp van een duidelijk gelabelde probe en een andere fluorescentie-marker, waardoor een gedetailleerde vergelijking van de expressie mogelijk is. Hallo, ik ben Tim Brent van het laboratorium van Scott Holly van de afdeling Moleculaire, Cellulaire en Ontwikkelingsbiologie aan de Yale University. Vandaag laten we u een procedure zien voor whole mount high resolution dubbele fluorescentie in situ hybridisatie van zebravissenembryo's in het laboratorium.
We gebruiken deze procedure om de segmentatie van zebravis te bestuderen. Laten we beginnen. Start de procedure met embryo's die een nacht in de koeling zijn gefixeerd in paraformaldehyde.
Het gebruik van een vers ontdooide voorraad paraformaldehyde voor deze fixatie is cruciaal voor een succesvolle kleuring. Verwijder de fixeeroplossing en was de embryo's bij kamertemperatuur twee keer gedurende vijf minuten per keer in PBS. Verwijder vervolgens het chorion van de embryo's.
De embryo's worden in glazen kuilplaatjes geplaatst. Gebruik vanaf nu horlogemakerspincetten om het chorion te verwijderen. Gebruik een vuurgepolijste glazen Pasteurpipet om de embryo's over te brengen.
Anders zullen de embryo's aan de reguliere polypropyleentips blijven kleven. De gedechloreerde embryo's worden overgebracht via een reeks wasstappen met een toenemende methanolconcentratie. De laatste wasstap vindt plaats in 100% methanol.
Ten slotte worden de embryo's in verse methanol geplaatst en gedurende één nacht bij -20 °C bewaard. Breng de embryo's de volgende dag over via een reeks wasstappen met een afnemende methanolconcentratie en twee wasbeurten van vijf minuten met PBST-buffer. Fixeer de embryo's vervolgens gedurende 20 minuten met paraformaldehyde.
Beëindig de korte fixatie met twee wasbeurten van vijf minuten met PBST. We kunnen nu overgaan tot het permeabiliseren van de embryo's. De gefixeerde embryo's worden permeabel door ze te incuberen met proteïne ACE K. Zorg ervoor dat de microcentrifugebuis op zijn zij wordt gelegd.
De duur van de digestiestap is afhankelijk van de leeftijd van het embryo. Embryo's in het stadium van somato-agenese worden bijvoorbeeld drie tot vier minuten geïncubeerd. Spoel kort met PBST en was eenmaal gedurende vijf minuten in PBST.
Fixeer de embryo's in paraformaldehyde. Was de embryo's tot slot twee keer gedurende vijf minuten in PBST. De embryo's zijn nu klaar voor hybridisatie met de RNA-probes.
Nu we de embryo's hebben gefixeerd en permeabiliseert, beginnen we het hybridisatieproces met een incubatie van vijf minuten in HI-minus bij 65 °C. Vergeet niet de HIIN-oplossing voor gebruik voor te verwarmen. Incubeer de embryo's vervolgens gedurende één uur in HI-plus.
Vergeet niet om de high plus-oplossing opnieuw voor te verwarmen. Verwijder nu het grootste deel van de hip plus-oplossing, maar laat 50 µL achter, waarbij u ervoor zorgt dat de embryo's volledig zijn ondergedompeld. Voeg één µL van elke probe toe en meng door zachtjes tegen de buis te tikken.
Bedek de buisjes vanaf nu met aluminiumfolie. Aangezien fluoresceïne lichtgevoelig is en de incubatie overnight bij 65 °C plaatsvindt, is de hybridisatie voltooid. Verwijder nu het overschot aan probes.
Het detergent wordt verwijderd om de kleuring te verbeteren. Merk echter op dat de embryo's plakkerig worden in de afwezigheid van detergent. Was tweemaal met een 50% formamide 2 XSSC-oplossing, telkens gedurende 30 minuten.
Was één keer met 2X SSC-oplossing gedurende 15 minuten. Was tenslotte twee keer met 0,2X SSC gedurende telkens 30 minuten. Vervolgens zullen we elke probe visualiseren.
Nu kunnen we beginnen met de detectie van de gehybridiseerde probes. Detecteer eerst de fluoresceïne-probe, omdat deze minder stabiel en zwakker is dan de digoxygenine-probe. Blokkeer eerst gedurende één uur bij kamertemperatuur met 500 µL van 2% blokkeringsreagens in maleïnezuurbuffer.
Voeg vervolgens het peroxidase-geconjugeerde anti-fluoresceïne-antilichaam toe in een verdunning van 1:500 in de blokkeersolutie. Incubeer dit gedurende de nacht bij 4 °C. Zorg ervoor dat de microcentrifugebuis op zijn zij wordt gelegd.
Start vervolgens de detectie met het tyrom-signaalversterkingssysteem of TSA TYROM IDE dat is geconjugeerd aan een fluorofoor. De mierikswortelperoxidase op het antilichaam zet het TY IDE om in een zeer reactief intermediair. Het reactieve TY IDE vormt een covalente binding met residuen in de directe nabijheid van het antilichaam, wat resulteert in een gelokaliseerde depositie van de fluorofoor.
Begin met vier wasbeurten van 20 minuten met een 1x maleïnezuurbuffer bij kamertemperatuur, gevolgd door twee keer wassen in PBS. De fluoresceïne TY IDE was eerder opgelost in DMSO voor bewaring. Centrifugeer dit TSA-substraat kort.
Verdun vervolgens het TSA-substraat 1 op 50 in de amplificatie-verdunningsbuffer. Voeg de oplossing toe aan de embryo's en incubeer gedurende 45 minuten. Leg de microcentrifugebuis op zijn zij.
Breng de embryo's tijdens deze incubatiestap over via een reeks wasstappen van 10 minuten met een toenemende methanolconcentratie. De laatste wasstap bestaat uit 10 minuten in 100% methanol; incubeer vervolgens 30 minuten in een oplossing van 1% waterstofperoxide om de peroxidase op het antilichaam te inactiveren. Anders kan dit de detectie van de dig-oxygenen verstoren.
Breng de embryo's via de sonde over door een reeks wasstappen met een afnemende methanolconcentratie en twee wasbeurten van 10 minuten met PBS-buffer. Dit garandeert dat alle methanol is verwijderd. De antilichaamlabeling van de digoxigenine en de sonde begint met blokkeren, net als bij het vorige antilichaam.
Voeg vervolgens het anti-digoxigenine-antilichaam toe in een verdunning van 1:1000. Leg de microcentrifugebuis op zijn zijkant en incubeer deze overnacht in de koeling. Was de volgende dag bij kamertemperatuur met maleïnezuurbuffer.
Spoel vervolgens met PBS en breng het SCI five tyrom-substraat aan. Verdun dit 1:50 en voeg het toe aan de embryo's. Incubeer gedurende 45 minuten terwijl de buis op zijn zij ligt.
Was tenslotte drie keer met PBST. Een laatste kleuringsstap met prop iodide markeert de kernen. Begin met twee wasbeurten van vijf minuten in twee XSSC.
Behandel vervolgens gedurende 30 minuten met RNA's bij 37 °C. Was zes keer met 2X SSC bij kamertemperatuur en voeg nu de propidiumjodide-oplossing toe en kleur gedurende acht minuten. Was zes keer met 2X SSC.
Fixeer de embryo's gedurende 20 minuten in paraformaldehyde. Volg dit op met twee wasbeurten van vijf minuten in PBST. Het mounten van de embryo's voor observatie begint met twee incubaties van 10 minuten in respectievelijk 25% en 50% glycerol.
Plaats de monsters vervolgens in 75% glycerol en incubeer ze een nacht bij vier graden Celsius. Deze stap voor het overnacht helder maken vergemakkelijkt de dissectie van de embryo's. Dissecteer tot slot de embryo's en verwijder de dooier.
Om de achtergrondfluorescentie te verminderen, worden de embryo's plat gemonteerd op een objectglas en onder de microscoop onderzocht. Deze afbeeldingen tonen een enkele confocale sectie door de posterieure tip van een zebravissenembryo in het 10-somietenstadium. De rode kleuring toont delta C mRNA, gedetecteerd met een digoxigenine-gelabelde probe en TSA-reagens.
De groene kleuring representeert het gedetecteerde mRNA met een fluoresceïne-gelabelde probe. En TSA-fluoresceïne-reagens; kernen gekleurd met propidiumjodide zijn blauw in een dubbel gekleurd embryo.
Regio's met aparte of overlappende expressie kunnen eenduidig worden bepaald. Deze procedure onthult de subcellulaire lokalisatie van mRNA, zoals te zien is in deze close-up beelden van de kleuring. Actieve transcriptie van het gen wordt zichtbaar gemaakt door stippen van kleuring in de nucleus.
Andere cellen vertonen een cytoplasmatische lokalisatie van het mRNA. In het dubbel gekleurde embryo kunnen we cellen zien die beide genen transcriberen, of slechts één van de twee genen.
Apart hiervan hebben we zojuist gedemonstreerd hoe een whole mount high resolution dubbele fluorescentie in situ hybridisatie van zebravissenembryo's kan worden uitgevoerd. Bij deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat we onze probes eerst testen met standaard alkalische fosfatase-gemedieerde kleuring; probes die een schoon en sterk signaal geven, zullen goed werken bij fluorescentie in situ.
We hebben ook met succes immunolocalisatie van bèta-catenine gebruikt in plaats van de propidiumjodide-kleuring. Wanneer we deze variatie uitvoeren, voeren we de hybridisatiereacties uit bij 55 °C in plaats van 65 °C. Dat is alles.
Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor dubbele fluorescente in situ hybridisatie met hoge resolutie voor het analyseren van genexpressiepatronen in zebravisembryo's. De methode maakt het mogelijk om de overlap van expressiedomeinen van twee genen te bepalen, waarbij een tegenkleuring van de kernen met propidiumjodide wordt gebruikt om de visualisatie van de weefselorganisatie te verbeteren.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Ontwikkelingsbiologie
- Genexpressieanalyse
- Fluorescentie-beeldvormingstechnieken
Achtergrond
- Whole mount in situ hybridisatie wordt op grote schaal toegepast in de ontwikkelingsbiologie.
- Deze techniek helpt bij het visualiseren van genexpressie in embryo's.
- Beeldvorming met een hoge resolutie is essentieel voor het begrijpen van geninteracties.
- Tegenkleuringstechnieken verbeteren de helderheid van de weefselorganisatie.
Doel van de studie
- Om een gedetailleerd protocol te bieden voor dubbele fluorescentie in situ hybridisatie.
- Om de expressiepatronen van individuele en overlappende genen te analyseren.
- Om de visualisatie van de mRNA-distributie in zebravisembryo's te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Hybridisatie van antisense riboprobes aan het doel-mRNA.
- Gebruik van peroxidase-geconjugeerde antilichamen voor detectie.
- Toepassing van aramide-geconjugeerd fluoro-four voor visualisatie.
- Wassen van ongebonden IDE om subcellulaire mRNA-patronen zichtbaar te maken.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van genexpressiepatronen in zebravisembryo's.
- Vermogen om de expressie van twee genen te vergelijken met behulp van verschillende probes.
- Hoge-resolutie beeldvorming onthult gedetailleerde subcellulaire distributie.
- Aangetoonde effectiviteit van het protocol in een laboratoriumomgeving.
Conclusies
- Het protocol biedt een betrouwbare methode voor de analyse van genexpressie.
- Beeldvorming met een hoge resolutie is essentieel voor studies naar ontwikkelingsbiologie.
- Toekomstige toepassingen kunnen vergelijkende studies naar genfunctie omvatten.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Hoge-resolutie dubbele fluorescentie in situ hybridisatie in zebravis maakt nauwkeurige ruimtelijke mapping van genexpressie mogelijk, wat vroege ontdekking en targetvalidatie in ontwikkelings- en ziektemodellen ondersteunt. Het vermogen van het protocol om overlappende en afzonderlijke genexpressiedomeinen op subcellulaire resolutie te onderscheiden, vergroot het voorspellende vertrouwen bij pathway-analyse en mechanische risicoreductie. Deze capaciteit is cruciaal voor portfoliotriage en het bevorderen van translationeel onderzoek in vertebraten.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutisch R&D
Vroegtijdige ontdekking & targetvalidatie
- Maakt het onderzoeken van overlap in genexpressie en pathway-relaties in intacte embryo's mogelijk.
- Ondersteunt functionele targetvalidatie door subcellulaire mRNA-lokalisatiepatronen te onthullen.
- Faciliteert mechanistische risicoreductie via ruimtelijke analyse met hoge resolutie van kandidaatgenen.
- Verbetert het voorspellende vertrouwen bij het prioriteren van targets in complexe ontwikkelingscontexten.
Screening & assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde zebravismodellen voor voor downstream screening van genfunctie en modulatie.
- Levert reproduceerbare, kwantitatieve imaging-outputs voor assay-standaardisatie.
- Maakt multiplexed detectie van genexpressie mogelijk, wat schaalbare screening-workflows ondersteunt.
- Biedt robuuste readouts voor het evalueren van compound-effecten op genexpressiedomeinen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt genexpressie-mapping uit met ziekterelateerde gewervelde modellen voor translationele continuïteit.
- Ondersteunt de ontdekking van biomarkers door mRNA-lokalisatie te correleren met functionele resultaten.
- Faciliteert risico-gecorrigeerde beslissingen over voortgang door genfuncties in vivo te verduidelijken.
- Verhoogt de voorspellende waarde voor de selectie en validatie van preklinische modellen.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit protocol integreert in het ontdekkingscontinuüm, van vroege hypothesetoetsing tot lead-identificatie en preklinische validatie, waarbij gebruik wordt gemaakt van zebravis als ziekterellevant systeem.
- Discovery Biology: Levert ruimtelijke gegevens met een hoge resolutie voor hypothesetesten en het verduidelijken van signaalpaden.
- Screening: Levert kwantitatieve, reproduceerbare imaging-resultaten ter voorbereiding op assays.
- Analytics: Maakt directe vergelijking van genexpressiedomeinen en overlap mogelijk met behulp van confocale microscopie.
- Translational Research: Slaat de brug tussen discovery en preklinisch onderzoek door genexpressie in volledige gewervelde embryo's in kaart te brengen.
- Enterprise Reuse: Biedt een gestandaardiseerde, herbruikbare workflow voor genexpressieanalyse over meerdere projecten heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij targetvalidatie.
- Operationele waarde: Standaardiseert beeldvorming en analyse voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen en verbetert de kapitaalefficiëntie door biologische risico's in een vroeg stadium te verduidelijken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en het verder brengen van assets in de ontdekkingsfase.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in het hanteren van zebravis, sonde-ontwerp en confocale beeldvorming.
- Toegang tot fluorescentiemicroscopie en infrastructuur voor beeldanalyse is noodzakelijk.
- Een standaardisatie van sonde-validatie en beeldvormingsprotocollen tussen teams is vereist.
- Aanpassing aan andere vertebrate modellen kan protocoloptimalisatie vereisen.
- Signaalspecificiteit en reductie van achtergrondruis zijn cruciaal voor een betrouwbare interpretatie.
