Name: Zebravis hele Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridisatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-25T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 31 s
Description: Leer een dubbele fluorescentie in situ hybridisatie methode voor genexpressie-analyse in zebravisembryo's met hoge resolutie. Deze techniek maakt gedetailleerde visualisatie van overlappende expressiedomeinen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We willen graag de bijdragen van Dörthe Jülich, Jennifer Ronde en Andrew Mara erkennen in de ontwikkeling van dit protocol. Ondersteuning van het onderzoek door de NICHD, de American Cancer Society en de March of Dimes.

1. FIXATION <ol><li> Fix embryo&#39;s overnacht bij 4 ° C met 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS. </li><li> Verwijder de fix en was 2 x PBS, 5 minuten bij kamertemperatuur (RT). </li><li> Handmatig dechorionate embryo&#39;s in PBS in een glazen plaat met behulp van depressie horlogemaker tang. Na dechorionation, worden embryo&#39;s met behulp van een brand-gepolijst glas Pasteur pipet omdat ze kunnen blijven plakken aan polypropyleen pipetten. </li><li> Overdracht van embryo&#39;s door middel van een serie van 25%, 50% en 75% methanol in PBS gedurende 5 minuten elk. </li><li> Vervang de vloeistof met 100% methanol, incubeer 5 minuten en daarna vervangen door verse methanol. </li><li> Plaats embryo&#39;s bij -20 ° C voor minimaal een uur. (We overnachten meestal uitbroeden van de embryo&#39;s. Standaard in situ hybridisatie zal werken op embryo&#39;s worden opgeslagen gedurende meer dan een jaar, maar we hebben niet onderzocht of de hoge-resolutie van de fluorescente in situ hybridisatie verloren gaat door langdurige opslag.) </li><li> Was embryo&#39;s voor elk 5 minuten in 75%, 50%, 25% methanol in PBST bij RT. Was twee keer gedurende 5 minuten in PBST bij RT. </li><li> Fix opnieuw gedurende 20 minuten in 4% PFA in PBS bij RT. </li><li> Was twee keer gedurende 5 minuten in PBST bij RT. </li></ol> OPMERKING OVER PFA: Wij slaan 4% PFA in porties bij -20 º C (zie tabel van de reagentia). Voor de eerste fixatie, gebruiken we alleen PFA die nog nooit eerder is ontdooid. Voor de daaropvolgende fixaties, gebruiken we vaak PFA die eerder is ontdooid. De initiële fixatie lijkt te zijn essentieel voor een succesvolle kleuring met dit protocol. 2. Proteïnase EN POSTFIXATION <ol><li> Digest met proteinase K (5μg/ml in PBST) bij RT gedurende 3 tot 12 minuten om de embryo&#39;s permeabilize. (De incubatietijd is afhankelijk van de leeftijd van de embryo&#39;s als jongere stadia zijn gevoeliger. Het hangt ook af van de partij enzym.) Voor somitogenesis stadium embryo&#39;s, meestal we permeabilize voor 3-4 minuten. Tijdens deze incubatie, leggen we de microcentrifugebuis op zijn kant. </li><li> Spoel kort in PBST en was een keer voor 5 minuten in PBST. </li><li> Fix opnieuw gedurende 20 minuten in 4% PFA in PBS bij RT. </li><li> Was twee keer, gedurende 5 minuten elk, in PBST bij RT. </li></ol> 3. Prehybridisatie <ol><li> Incubeer de embryo&#39;s gedurende 5 minuten bij 65 º C in HYB-. </li><li> Prehybridize op 65 º C gedurende ten minste 1 uur in HYB +. </li></ol> 4. Hybridisatie <ol><li> Verwijder alle maar 50 ul van de preHYB, maar zorg ervoor dat de embryo&#39;s volledig onder water te houden. </li><li> Voeg 1-2 ul van elk riboprobe (digoxygenin-en fluoresceïne-gelabeld riboprobes) om de embryo&#39;s en meng door zachtjes flicking de buis. De hoogte van de sonde is typisch een-2μl van een 20μl sonde synthesereactie. </li><li> Gezien het feit dat fluoresceïne is licht-gevoelig is, moet de buizen worden verpakt in aluminiumfolie of op andere wijze blootgesteld aan een minimale licht van dit punt naar voren. </li><li> &#39;S nachts Incubeer de embryo&#39;s op 65 º C. </li></ol> 5. PROBE VERWIJDEREN Merk op dat de oplossingen van dit punt naar voren gebrek aan wasmiddel. Eliminatie van detergent lijkt te helpen de kleuring reacties, maar toe leidt dat de embryo&#39;s te worden nogal plakkerig. <ol><li> Verwijder de riboprobe. </li><li> Was 2 x 30 minuten bij 65 º C in 50% formamide/2xSSC. </li><li> Was gedurende 15 minuten bij 65 º C in 2 x SSC. </li><li> Was gedurende 30 minuten 65 º C in 0,2 x SSC. </li></ol> 6. ANTI-fluoresceïne ANTILICHAAM incubatie <ol><li> Blok voor ten minste 1 uur bij RT in 500μl van een oplossing van 1x maleïnezuur buffer verhoogd met 2% te blokkeren reagens (zie de tabel van de reagentia). </li><li> Voeg de anti-fluoresceïne-POD antilichaam, zoals geleverd door Roche, in een 1:500 verdunning in de blokkering oplossing. </li><li> Incubeer overnacht bij 4 º C. Tijdens deze incubatie, leggen we de microcentrifugebuis op zijn kant. </li><li> Was de 4 x 20 minuten in 1x maleïnezuur buffer. Was twee keer gedurende 5 minuten in PBS. </li></ol> 7. DETECTIE van fluoresceïne-ETIKETTEN PROBE <ol><li> Incubeer 30-60 minuten in TSA Plus Fluoresceïne Solution. (Naar beneden TSA substraat Spin alvorens kleuroplossing. Voor de reactie, verdunnen tyramide reagens 01:50 in Perkin Elmer versterking verdunningsmiddel buffer.) Tijdens deze incubatie, leggen we de microcentrifugebuis op zijn kant. Reactietijd dient empirisch te worden bepaald voor elke probe. Helaas kan de kleuring reactie niet visueel gecontroleerd te worden als de ondergrond is fluorescerend, en men zal alomtegenwoordige groene fluorescentie te zien in de vlekken reactie. </li><li> Was gedurende 10 minuten elk in 30%, 50%, 75% en 100% methanol in PBS. </li><li> Incuberen in een oplossing van 1% H 2 0 2 in methanol gedurende 30 minuten om de eerste peroxidase inactiveren. </li><li> Was 10 minuten elk in 75%, 50% en 30% methanol in PBS. Dan twee keer wassen gedurende 10 minuten elk in PBS. Het is belangrijk dat alle gehaaldhanol worden verwijderd. </li></ol> TOELICHTING OP DE tyramide signaalversterking: We zijn met behulp van de Perkin Elmer TSA Kits. We vinden dat de Alexa-tyramide substraten goed vlek met behulp van de Perkin Elmer versterking verdunningsmiddel buffer, maar we hebben geen succes gehad met de kleuring buffer die bij de Invitrogen / Molecular Probes Kits. Tot slot hebben we gevonden dat Cy5 fluorescentie wordt geëlimineerd door de volgende methanol / H 2 O 2 behandeling, terwijl fluoresceïne en Alexa-647 blijven ongewijzigd. Cy3 kan ook negatief worden beïnvloed door de methanol / H 2 O 2 behandeling als het structureel gerelateerd is aan Cy5. Om deze reden moet Cy3 en Cy5 TSA reacties alleen worden gebruikt voor de tweede vlekken reactie in een dubbele fluorescente in situ protocol. 8. ANTI-Digoxygenin ANTILICHAAM incubatie <ol><li> Opnieuw te blokkeren de embryo&#39;s voor minstens 1 uur bij RT in een oplossing van 1x maleïnezuur buffer verhoogd met 2% te blokkeren reagens. </li><li> Voeg de anti-DIG POD antilichaam zoals geleverd door Roche op een verdunning van 1:1000 in boven het blokkeren van oplossing </li><li> Incubeer overnacht bij 4 º C. Tijdens deze incubatie, leggen we de microcentrifugebuis op zijn kant. </li><li> Was de 4 x 20 minuten in 1x maleïnezuur buffer. Was twee keer gedurende 5 minuten in PBS. </li></ol> 9. OPSPORING VAN Digoxygenin-ETIKETTEN PROBE <ol><li> Incubeer 30-60 minuten in TSA Plus Cy5 Solution (spin down TSA ondergrond alvorens kleuroplossing. Voor de reactie, tyramide reagens 01:50 in versterking verdunningsmiddel buffer verdund) Tijdens deze incubatie, leggen we de microcentrifugebuis op zijn kant. Reactietijd dient empirisch te worden bepaald voor elke probe. </li><li> Was drie keer voor 10 minuten elk in PBST. </li></ol> 10. Propidiumjodide KLEURING <ol><li> Was twee keer gedurende 5 minuten in 2 x SSC. </li><li> Incubeer embryo&#39;s gedurende 30 minuten bij 37 ° C in 50 ui 2 x SSCT met 10 ul RNAse (voor een uiteindelijke concentratie van 100μg/ml). </li><li> Was zes keer gedurende 3 minuten in 2 x SSC bij RT. </li><li> Vlek van embryo&#39;s voor 8 minuten in een oplossing van 330μg/ml propidiumjodide in 2 x SSC. </li><li> Was zes keer gedurende 3 minuten in 2 x SSC bij RT. </li><li> Fix voor 20 minuten in 4% PFA in PBS bij RT. </li><li> Was twee keer, gedurende 5 minuten elk, in PBST bij RT. </li></ol> 11. MONTAGE <ol><li> Incubeer de embryo&#39;s gedurende 10 minuten elk in 25% en 50% glycerol in PBST. Duidelijke &#39;s nachts in 75% glycerol bij 4 º C. </li><li> We ontleden en deyolk de embryo&#39;s en vlakke plak ze op een microscoopglaasje. De dooier kan aanzienlijke achtergrond fluorescentie. Dissectie is veel gemakkelijker na de embryo&#39;s ovenight zijn verdwenen in gylcerol. </li></ol> OPLOSSINGEN: <table border="1"><tbody><tr><td> PBST </td><td> PBS plus 0,1% Tween </td><td></td></tr><tr><td> SSCT </td><td> SSC plus 0,1% Tween </td><td></td></tr><tr><td> HYB- </td><td> 50% formamide 5xSSC 0,1% Tween-20 </td><td></td></tr><tr><td> HYB + </td><td> HYB- 5mg/ml Torula (gist) RNA 50μg/ml heparine </td><td style="width: 300px;"> De Torula RNA wordt bereid door proteinase K digestie van RNA met latere fenol-, fenol-chloroform-, en chloroform-extraction.The RNA is geprecipiteerd en opgelost in DEPC-behandeld water. </td></tr><tr><td> 1 x maleïnezuur buffer </td><td> 150mm maleïnezuur, 100mm NaCl (pH 7,5) </td><td></td></tr></tbody></table><img src="/files/ftp_upload/1229/Brend_Holley_Fig1.png" alt="Figuur 1" width="600" height="688" /> Figuur 1. Representatieve resultaten van de hele berg dubbele fluorescente in situ hybridisatie. (AC). Beelden tonen een confocale doorsnede door het achterste deel van een zebravis embryo bij de tien-somiet podium. Het uitzicht is dorsale met anterior naar de top. Kernen gekleurd met propidiumjodide zijn blauw gekleurd. (A) deltaC mRNA werd gedetecteerd met behulp van een digoxygenin-gelabeld riboprobe en TSA-Cy5 reagens. (B) mRNA getranscribeerd van de HER1 gen werd gedetecteerd met een fluoresceïne-gelabelde riboprobe en TSA-fluoresceïne reagens. (C) Het samenvoegen van de groene en rode kanalen eenduidig ​​identificeert de regio&#39;s van verschillende of overlappende gen-expressie van de twee genen. (D, E) Detail van HER1 expressie aantonen van de hoge resolutie van deze procedure. Subcellulaire lokalisatie van mRNA kan duidelijk worden onderscheiden. Pijlpunten wijzen op een cel vertoont actieve transcriptie, geopenbaard door punten van kleuring in de kern. Pijlen geven aan een cel met cytoplasmatische lokalisatie van mRNA. (F, G) Double kleuring voor HER1 en deltaC onthult cellen die transcriptie van beide genen (witte pijlpunt), of beide genen afzonderlijk (rood en groen pijlpunten).

<ol><li>Schulte-Merker, S., Ho, R. K., Herrmann, B. G., Nüsslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+product+of+the+zebrafish+homologue+of+the+mouse+T-gene+is+expressed+in+nuclie+of+the+germ+ring+and+the+notochord+of+the+early+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The protein product of the zebrafish homologue of the mouse T-gene is expressed in nuclie of the germ ring and the notochord of the early embryo.</a> Development. 116, 1021-1027 (1992).</li>
<li>Jowett, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+in+situ+hybridization+techniques+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Double in situ hybridization techniques in zebrafish.</a> Methods. 23, 345-358 (2001).</li>
<li>Jülich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beamter%2FdeltaC+and+the+role+of+Notch+ligands+in+the+zebrafish+somite+segmentation%2C+hindbrain+neurogenesis+and+hypochord+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">beamter/deltaC and the role of Notch ligands in the zebrafish somite segmentation, hindbrain neurogenesis and hypochord differentiation.</a> Dev Biol. 286, 391-404 (2005).</li>
<li>Mara, A., Schroeder, J., Chalouni, C., Holley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Priming%2C+Initiation+and+Synchronization+of+the+Segmentation+Clock+by+deltaD+and+deltaC%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Priming, Initiation and Synchronization of the Segmentation Clock by deltaD and deltaC.</a> Nat Cell Biol. 9, 523-530 (2007).</li>
<li>Lecuyer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+mRNA+localization+reveals+a+prominent+role+in+organizing+cellular+architecture+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function.</a> Cell. 131, 174-187 (2007).</li>
</ol>

Het protocol hier gepresenteerde werkt goed met probes die een schone sterk signaal te geven na kleuring voor 30-45 minuten in een typisch alkalische fosfatase-gemedieerde reactie. Voorafgaand aan het uitvoeren van de fluorescente in situ hybridisatie protocol, we altijd testen onze sondes met behulp van de standaard niet-fluorescerende protocol (voorzien in aanvullende materiaal, samen met de sonde synthese-protocol). We hebben minder succes met de fluorescente in situ hybridisatie protocol bij het gebruik van zwakkere...

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehyde 16% oplossing, EM-kwaliteit</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>Verdunnen tot 4% in 1,33x PBS (eindconcentratie 1x). Bewaren in aliquoten van 2ml bij &amp;#8211;20&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Proteïnase K, recombinant PCR-kwaliteit</td><td>Roche Group</td><td>03115879001</td><td>Maak een voorraadoplossing van 20mg/ml in water. Bewaren in aliquoten van 1ml bij &amp;#8211;20&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Blocking Reagent</td><td>Roche Group</td><td>11096176001</td><td>Maak een 10% voorraadoplossing in 1x maleïnezuurbuffer. Bewaren in aliquoten van 50ml bij &amp;#8211;20&amp;#x00B0;C. Stabiel bij herhaaldelijk invriezen en ontdooien.</td></tr><tr><td>Anti-Fluoresceïne-POD, Fab-fragmenten</td><td>Roche Group</td><td>11426346910</td><td>Verdelen in aliquoten en bewaren bij -20&amp;#x00B0;C. Houd één werkaliquot bij 4&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenine-POD, Fab-fragmenten</td><td>Roche Group</td><td>11207739910</td><td>Zoals hierboven.</td></tr><tr><td>TSA Plus Fluoresceïne-systeem</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>NEL741001KT</td><td>Bereid elk vial TSA-reagens pas wanneer nodig. Oplossen in 60&amp;#x03BC;l DMSO. Bewaren bij 4&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>TSA Plus Cyanine5-systeem</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>NEL745001KT</td><td>Zoals hierboven</td></tr><tr><td>TSA Plus Cyanine3-systeem</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>NEL744001KT</td><td>Zoals hierboven</td></tr><tr><td>TSA Kit #16 AlexaFluor647 tyramide (plus HRP-geit-anti-konijn IgG)</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>T20926</td><td>Los het tyramide-reagens op in 150&amp;#x03BC;l DMSO, verdeel in aliquoten en bewaar bij &amp;#8211;20&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>RNase, DNase-vrij</td><td>Roche Group</td><td>11119915001</td><td>Geleverd als 500&amp;#x03BC;g/ml oplossing</td></tr><tr><td>Propidiumjodide</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>P-3566</td><td>Geleverd als 1mg/ml oplossing in water.</td></tr></tbody></table>

zebravis hele mount high-resolution double fluorescent in situ hybridisatie

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie is een van de meest gebruikte technieken in de ontwikkelingsbiologie. Hier presenteren wij een hoge resolutie dubbele tl<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie protocol voor de analyse van de precieze expressiepatroon van een enkel gen en voor het bepalen van de overlap van de expressie-domeinen van twee genen. Het protocol is een aangepaste versie van de standaard<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie met behulp van alkalische fosfatase en substraten zoals NBT / BCIP en snelle Red<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Dit protocol maakt gebruik van standaard digoxygenin en fluoresceïne gelabelde probes, samen met tyramide signaalversterking (TSA)<sup&gt; 3</sup&gt;. De commercieel verkrijgbare TSA kits maken een flexibele opzet van het experiment fluorescentie-emissie van groen naar ver-rood kan worden gebruikt in combinatie met diverse nucleaire vlekken, zoals propidiumjodide, of fluorescentie immunohistochemie voor eiwitten. TSA produceert een reactieve fluorescent substraat die snel covalent bindt aan groepen, meestal tyrosine residuen, in de directe omgeving van de gelabelde antisense riboprobe. De resulterende kleurpatronen zijn hoge resolutie in die subcellulaire lokalisatie van het mRNA kan worden waargenomen met behulp van laser scanning confocale microscopie<sup&gt; 3,4</sup&gt;. Men kan waarnemen ontluikende transcripten in de chromosomale loci, onderscheiden nucleaire en cytoplasmatische kleuring en visualiseren andere patronen, zoals corticale lokalisatie van mRNA. Studies in<em&gt; Drosophila</em&gt; Geven aan dat ongeveer 70% van de mRNA&#39;s specifieke patronen van de subcellulaire lokalisatie die vaak samenhangen met de functie van het gecodeerde eiwit vertonen<sup&gt; 5</sup&gt;. In combinatie met computer-aided reconstructie van 3D-confocale datasets, ons protocol maakt een gedetailleerde analyse van mRNA distributie met sub-cellulaire resolutie in zijn geheel gewervelde embryo&#39;s.

Hele monteren in situ hybridisatie is een van de meest gebruikte technieken in de ontwikkelingsbiologie. Hier presenteren wij een hoge resolutie dubbele fluorescente in situ hybridisatie protocol voor de analyse van de precieze expressiepatroon van een enkel gen en voor het bepalen van de overlap van de expressie-domeinen van twee genen. We nemen een propidiumjodide nucleair anti-vlek weefsel organisatie te markeren.

Zebravis hele Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridisatie

Whole mount in situ hybridisatie is een van de meest gebruikte technieken in de ontwikkelingsbiologie. Hier presenteren wij een hoge-resolutie dubbele ...

Deze procedure stelt ons in staat om patronen van genexpressie in zebravisembryo's met een hoge resolutie te bepalen, waarbij een antisense riboprobe wordt gehybridiseerd met het complementaire doel-mRNA. De gelabelde riboprobe wordt herkend door een antilichaam dat is geconjugeerd aan een peroxidase-enzym; aramide-geconjugeerde fluoro four wordt aan de embryo's toegevoegd en het peroxidase zet de IDE om in een zeer reactieve verbinding. Dit leidt tot een stabiele depositie van de fluoro four; ongebonden IDE wordt weggewassen, waardoor het gedetailleerde subcellulaire patroon van de mRNA-distributie zichtbaar wordt.De expressie van een tweede gen kan worden waargenomen met behulp van een duidelijk gelabelde probe en een andere fluorescentie-marker, waardoor een gedetailleerde vergelijking van de expressie mogelijk is. Hallo, ik ben Tim Brent van het laboratorium van Scott Holly van de afdeling Moleculaire, Cellulaire en Ontwikkelingsbiologie aan de Yale University. Vandaag laten we u een procedure zien voor whole mount high resolution dubbele fluorescentie in situ hybridisatie van zebravissenembryo's in het laboratorium.We gebruiken deze procedure om de segmentatie van zebravis te

zebrafish-whole-mount-high-resolution-double-fluorescent-situ

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Met behulp van Whole Mount In situ Hybridisatie aan Moleculaire Biologie en organismale Link

De zebravis, een kleine tropische vissen, is uitgegroeid tot een populair model voor het bestuderen van gen-functie tijdens gewervelde ontwikkeling en ziekte. De ruimtelijke en temporele expressie van de doelwitgenen worden...

Hoge resolutie Hele Mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie in zebravis embryo&#39;s om genexpressie en functie te bestuderen

De ontwikkeling van de zebravis kan over dagen met licht blad microscopie wanneer embryo's zijn ingebed in optisch heldere polymeer buizen met een lage concentratie agarose worden gevolgd.

Multilayer Montage voor langdurig licht Sheet Microscopie van zebravis

Hier beschreven is een protocol voor de semi-geautomatiseerde beeldvorming van weefsel-specifieke fluorescentie in zebravis embryo's.

Semi-geautomatiseerde beeldvorming van Tissue-specifieke fluorescentie in zebravis embryo&#39;s

De zebravis embryo is een uitstekend model voor ontwikkelingsbiologie onderzoek. Tijdens de embryogenese, zebravissen ontwikkelen met een dooier massa, die driedimensionale uitdagingen voor monster observatie en analyse presenteert. Dit protocol beschrijft hoe twee-dimensionale platte mount voorbereidingen van ganse berg in situ (WISH) gekleurd zebravis embryo exemplaren maken.

Flat Mount Voorbereiding voor observatie en analyse van de zebravis embryo Exemplaren gekleurd door Whole Mount<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie

De interrenal klier in de zebravis is de teleostean tegenhanger van de zoogdieren bijnier. Dit protocol wordt beschreven hoe de 3-β-hydroxysteroïdedehydrogenase (Δ 5-4 isomerase, 3β-Hsd) verricht enzymatische activiteit test, die gedifferentieerde steroïdogene cellen in zebravisembryo detecteert.

Het visualiseren van de Interrenal steroïdogene Tissue en haar Vasculaire Microenvironment in zebravis

Cilia ontwikkeling is essentieel voor goede organogenese. Dit protocol beschrijft een geoptimaliseerde methode om te etiketteren en ciliated cellen van de zebravis visualiseren.

Visualiseren van Multiciliated cellen in de zebravis via een gecombineerde Protocol van hele Mount fluorescentie In Situ hybridisatie en immunofluorescentie

Dit artikel beschrijft een methode voor het monteren van fragiele zebravis embryo's voor uitgebreide time-lapse confocale microscopie. Deze voordelige methode is eenvoudig uit te voeren met behulp van regelmatige glazen bodem microscopie gerechten voorbeeld vorming op elke omgekeerde Microscoop. De montage wordt uitgevoerd in lagen van agarose bij verschillende concentraties.

Een gelaagde montagemethode voor de uitgebreide time-lapse confocale microscopie van hele zebravis embryo's

Hier presenteren we een protocol voor fluorescerende antilichaamgemedieerde detectie van eiwitten in hele preparaten van zebravissen embryo's en larven.

Hele mount immunohistochemie in zebravissen embryo's en larven

Dit protocol beschrijft hoe beelden kunnen worden verkregen door in situ hybridisatie en immunohistochemie van embryonale secties van zebravissen te combineren. In situ hybridisatie werd uitgevoerd voorafgaand aan cryosectie, gevolgd door antilichaamkleuring. Het is nuttig om de expressiepatronen van twee genen in zebravissen te detecteren als er een tekort aan antilichamen is.

Ter plaatse Hybridisatie gecombineerd met immunohistochemie in cryosectie zebravisembryo's

Er wordt een strategie voor de voorbereiding van monsters beschreven voor het afbeelden van vroege zebravisembryo's in een intact chorion met behulp van een light-sheet-microscoop. Het analyseert de verschillende oriëntaties die embryo's verwerven in het chorion in de 70% epiboly- en knopstadia en beschrijft beeldvormingsstrategieën voor het verkrijgen van resolutie op cellulaire schaal in het hele embryo met behulp van het light-sheet-systeem.

Light Sheet Microscopie, beeldvorming en montagestrategieën voor vroege zebravisembryo's

Leer een dubbele fluorescentie in situ hybridisatie methode voor genexpressie-analyse in zebravisembryo's met hoge resolutie. Deze techniek maakt gedetailleerde visualisatie van overlappende expressiedomeinen mogelijk.

Zebravis hele Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridisatie

Meer video's verkennen