Name: Brain Banking: Het maken van de meeste van uw onderzoek Specimens (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-24T16:02:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Leer systematische hersenmonsters voorbereiden voor cryostaatsecties in de neurowetenschap. Deze methode maximaliseert onderzoeksmateriaal en behoudt antigeen voor onbevooroordeelde stereologische analyse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag Ikiel Ptito bedanken voor zijn voortdurende technische ondersteuning.

Deel 1: Pre-verwerking van weefsel <ol><li> Weefsel moet goed worden geperfuseerd met paraformaldehyde, glutaaraldehyde, of formaline. Dit kan worden bereikt door middel van standaard transcardial perfusie meestal gebruikt om andere organen te oogsten. In de huidige studie het onderwerp was diep gesedeerd met ketamine hydrochloride (10 mg / kg, im), gedood met een overdosis natrium pentobarbital (25 mg / kg, iv) en perfusie transcardially met 0,1 M PBS tot het volledig exsanguinated. Dit wordt gevolgd door een 4% paraformaldehyde oplossing in PBS gedurende 5 minuten (~ 1 liter). </li><li> De hersenen moeten stereotaxically worden geblokkeerd, verwijderd uit de schedel, gewogen, en het volume bepaald 2. Het weefsel moet dan cryoprotected in gesorteerd sucrose oplossingen met een uiteindelijke concentratie van 30% sucrose in fosfaatbuffer. Blokken van weefsel moet dan worden bevroren in isopentaan bij -65 ° C en opgeslagen bij -80 ° C tot u klaar bent om te snijden. </li></ol> Deel 2: systematische bemonstering <ol><li> Systematische steekproef is gebaseerd op een goed plan voorafgaand aan snijden. De hele regio van belang, zowel in de rostrale-caudale en dorsale-ventrale mate moet goed worden gedefinieerd. Een stereotaxische atlas van de soorten in gebruik is nuttig om de regio van belang te definiëren en de lengte van de regio van belang vast te stellen. Zodra de lengte van de regio van belang is bepaald is het noodzakelijk om de sampling interval vast te stellen. Bijvoorbeeld, uit de atlas stereotaxische bepaalt u dat de hele rostro-caudale de omvang van de regio van belang is ongeveer 3 mm in de lengte als snijden in het frontale vlak. U kunt vervolgens beslissen om de cryostaat ingesteld om sectie op 50μm, in dit tempo heb je 60 secties met betrekking tot de rostrale-caudale de omvang van de regio van belang. Voor een typische onpartijdige stereological studie 60-10 systematisch bemonsterd secties nodig zijn om betrouwbare resultaten te verkrijgen. In dit voorbeeld 10 delen gelijkmatig verspreid over de rostro-caudale mate resulteren in een sampling interval van 1 / 6 secties. </li></ol> Deel 3: Oprichting van de hersenen bank <ol><li> Zodra de sectie sampling frequentie is vastgesteld, is de volgende stap is om te bepalen welke vlekken zal onmiddellijk worden uitgevoerd. Bijvoorbeeld, als u kleuren met cresyl violet u vastleggen 1 / 6 onderdelen op een dia. Dit wordt een serie. Als u weet dat er misschien verschillende potentiële antilichamen die je zou willen lopen, maar of de gegevens wilt zien dat uw primaire vlek geeft of simpelweg niet de tijd om de immunohistochemie uit te voeren, de resterende 5-serie van secties plaats in de volgorde waarin ze werden gesneden in putten met het antigen te behouden (1% polyvinylpyrrolidon, 50% ethyleenglycol in o.1M PBS, pH 7,4). De onderstaande tabel geeft een bemonsteringsschema, bestaande uit een glijbaan en een plaat (standaard 48-well plaat) van delen, als onderdeel van een brain bank (tabel 1). <img src="/files/ftp_upload/1260/table1.jpg" alt="Tabel 1" /> Tabel 1. De sectie bemonsteringsfrequentie hier is 1 / 6. Het eerste deel is geplaatst op een glijbaan voor cresyl violet kleuren en de volgende vijf hoofdstukken worden geplaatst in antigeen te behouden. Sectie nummer 7 wordt vervolgens opgevangen op de dia en delen 9-12 zijn geplaatst in antigeen te behouden. Deze cyclus wordt herhaald tot de regio van belang of blok van weefsel is uitvoerig deelbaar. </li><li> De volgende stap is om uitvoerig hoofdstuk het blok van weefsel. Plaats een kleine hoeveelheid van de inbedding medium op de boorkop en laat het bevriezen. Plaats de boorkop in de microtoom hoofd en genoeg afscheren van de bevroren medium op een vlakke ondergrond te hebben. Haal de boorkop uit de microtoom hoofd en plaats vlak binnen de cryostaat. Giet inbedding medium op de boorkop en stevig in de hersenen blokkeren plaats met de gesneden kant stereotaxically vlak gepositioneerd op de boorkop. Langzaam en volledig insluiten van de hersenen bij het monteren van medium. Plaats de boorkop met de hersenen in de microtoom hoofd en deel met behulp van de vooraf bepaalde parameters voor de sectie sampling frequentie. </li><li> Zodra het blok van weefsel is uitgebreid coupes en secties worden geplaatst in putten, bedek de plaat met het deksel, wikkel de deksel met parafilm, en plaats in een -20 ° C vriezer. Log het totale aantal secties die voor elke serie, de sectie-sampling interval, en het aantal reeksen voor elk dier. Dit logboek zal van vitaal belang om bij te houden van latere verwijdering van delen van de hersenen bank voor de toekomst immunohistochemie. </li></ol> Deel 4: representatieve resultaten: Systematische bemonstering op deze manier is een gangbare praktijk in ons laboratorium in de afgelopen 3 jaar. We hebben een veel succes uitvoeren van immunohistochemie op materiaal dat is opgeslagen in het antigeen te behouden drie jaar nadat het werd gesneden, zonder verslechtering van het signaal (Figuur 1). Bovendien, als onderdeel van onze hersenen bank hebben we ingelogd bijna 20.000 systematisch delen van de niet-menselijkeprimaat hersenen (figuur 2) als onderdeel van onze lange-termijn onderzoek plannen. <img src="/files/ftp_upload/1260/1260figure1.jpg" alt="" /> Figuur 1. Dit is een gedeelte van de occipitale pool van de niet-menselijke primaat immunostained voor Neun laten zien zowel laag VI en interstitiële witte stof neuronen. Deze bijzondere sectie werd opgeslagen in het antigeen te bewaren bij -20 ° C voor een periode van 2 jaar. Schaalbalk = 100 urn. <img src="/files/ftp_upload/1260/1260fig2.jpg" alt="Figuur 2" /> Figuur 2. Onze vervet hersenen bank bestaat nu uit bijna 20.000 systematische secties van meer dan 30 apen.

<ol><li>West, M., Slomianka, L., Gundersen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+stereological+estimation+of+the+total+number+of+neurons+in+the+subdivisions+of+the+rat+hippocampus+using+the+optical+fractionator.+Aat+Rec%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Aat Rec.</a> 231, 482-497 (1991).</li>
<li>Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+Non-human+Primate+Brain+in+Stereotaxic+Space%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissecting the Non-human Primate Brain in Stereotaxic Space.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te melden.

Systematische steekproef is een goedkope methode bedoeld om onderzoeksmateriaal te maximaliseren. Deze bemonstering strategie is ontworpen om te voldoen aan de regels van onpartijdige stereology dat systematische bemonstering in de hele regio nodig heeft. Het is cruciaal dat de volgorde van de secties voor elke serie wordt gehandhaafd. In ons laboratorium hebben we met succes gebruik gemaakt van deze methode voor banken zowel de hamster en niet-menselijke primaat hersenen secties. Tot nu toe hebben we verzameld bijna 20...

<table><tbody><tr><td>Ethyleenglycol</td><td>Fisher Scientific</td><td>E178-4</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylpyrrolidon</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP431-500</td><td></td></tr><tr><td>Thermal Scientific inbedmedium</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

brain banking: het maken van de meeste van uw onderzoek specimens

Brain Banking: Making the Most of your Research Specimens

Onpartijdige stereology is een methode voor het nauwkeurig en efficiënt schatting van het totaal aantal neuron (of een ander celtype) in een bepaald gebied van belang<sup&gt; 1</sup&gt;. Om dit doel te bereiken 60-10 systematische rubrieken moeten gegevens worden gepeild over de gehele structuur. Normaal gesproken is dit gaat om de verwerking van 1 / 5 secties die een aanzienlijke hoeveelheid materiaal onbewerkte bladeren. Om het materiaal te maximaliseren, stellen we een goedkope methode voor het conserveren van vaste weefsels, als onderdeel van een lange-termijn opslag onderzoeksplan. Omdat de weefsel is gesneden en verwerkt voor de gewenste vlek of antilichaam, alternatieve onderdelen moeten systematisch worden geplaatst in antigeen te bewaren bij -20 ° C voor verdere verwerking. Met behulp van 24-well platen, kunnen delen worden geplaatst, zodat de toekomst terug te vinden. Met behulp van deze methode kan weefsel worden opgeslagen en verwerkt voor immunohistochemie in de loop der jaren.

Brain bank-en systematische bemonstering van biologisch materiaal vormt de basis voor onpartijdige stereology en maximaliseert de mogelijkheden gegevens van elk exemplaar.

Brain Banking: Het maken van de meeste van uw onderzoek Specimens

Onbevooroordeelde stereologie is een methode voor het nauwkeurig en efficiënt schatten van het totale aantal neuronen (of een ander celtype) in een bepaald interessegebied1. Om ...

Om deze procedure te starten, moet het hersenblok worden voorbereid voor de cryostaat en moet de frequentie van de sectiebestekking worden bepaald. Vervolgens moeten het antigeenconserveermiddel en de objectglazen worden klaargemaakt. Het hersenblok moet op de houder in de cryostaat worden geplaatst.Zodra de hersenen stevig zijn ingebed op het chuck-gedeelte bij een vooraf ingestelde dikte, moeten systematische coupes worden genomen, waarbij de eerste serie op een objectglas wordt geplaatst en verdere series worden geplaatst in putjes die vooraf zijn gevuld met antigeenconserveermiddel. Wanneer het blok volledig is verbruikt, plaatst u de plaat in een vriezer van -20 °C als onderdeel van uw hersenenbank. Hallo, ik ben Dr. Mark Burke van het Visual Neurosciences Laboratory aan de School of Optometry van de Universiteit van Montreal.Hoi, ik ben Dr. Shahin Zur, eveneens van het Visual Neurosciences Laboratory aan de School of Optometry van de Universiteit van Montreal. Hallo, ik ben Dr. Mo Petto, directeur van het Visual Neuroscience Laboratory aan de School of Optometry van de Universiteit van Montreal. Vandaag laten we u een procedure zien voor het systematisch banken van hersenweefsel in antigen preserve.Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om onderzoeksmateriaal te maximaliseren en als basis voor het uitvoeren van onbevooroordeelde theology. Laten we beginnen. Dit protocol beschrijft hoe hersenweefsel dat is gefixeerd, stereotactisch geblokkeerd in plakken van één centimeter dik en ingevroren is, systematisch kan worden bemonsterd.Om deze eerdere stappen in detail te bekijken, kunt u ons recente JoVE-artikel raadplegen over het ontleden van de hersenen van niet-menselijke primaten in stereotaxische ruimte. De eerste stap bij systematische bemonstering is het opstellen van uw bemonsteringsschema, waarbij u bepaalt hoe u het weefsel zal doorsnijden, hoe u deze secties zult verdelen in series of monsters, en hoe u deze monsters zult ordenen en bijhouden. Raadpleeg eerst, indien nodig, een stereotaxische atlas.Definieer duidelijk uw interessegebied in de rostrale, caudale en dorso-ventrale dimensies en kies uw doorsnedevlak. Bepaal vervolgens hoe dik de coupes worden gemaakt en bereken hoeveel coupes u uit uw interessegebied kunt verkrijgen. Stel bijvoorbeeld dat u uit de stereotaxische atlas vaststelt dat de volledige rostro-caudale omvang van uw gebied ongeveer drie millimeter bedraagt.Vervolgens stelt u de cryostaat in om coupes van 50 µm te maken, waardoor u bij deze dikte 60 coronale coupes krijgt die de gehele regio bestrijken. Op dit punt kunt u het bemonsteringsinterval vaststellen. Voor een typische onbevooroordeelde stereologische studie zijn zes tot 10 systematisch bemonsterde coupes nodig om betrouwbare resultaten te verkrijgen.In dit voorbeeld resulteren 10 secties die gelijkmatig over de gehele lengte van de Ros-coddle zijn verdeeld in een bemonsteringsinterval van één op zes secties. Zodra u deze bemonsteringsfrequentie van de secties heeft bepaald, moet u vervolgens beslissen welke kleuringen u wilt uitvoeren. De secties die u onmiddellijk wilt kleuren, monteert u direct op objectglazen tijdens het snijden van het weefsel.Als u bijvoorbeeld kleurt met bijvoorbeeld kristalviolet, legt u één van de zes coupes op een objectglas. Dit wordt serie één. De overige coupes bewaart u in plaatjes met antigeenpreserveermiddel voor toekomstige immunohistochemie.Het hier getoonde bemonsteringsschema bestaat uit twee objectglazen en één standaard 24-wells plaat met coupes als onderdeel van een hersenbank, voor in totaal zes series voor dit weefselblok. De volgende stap is om het weefselblok volledig in coupes te snijden met behulp van de cryostaat-microtoom. Eerst moet u uw bevroren weefselmonster monteren op het onderdeel dat de chuck wordt genoemd, dat in de kop van de microtoom past en dient als tafel voor uw monster.Begin met het aanbrengen van een kleine hoeveelheid inbeddingsmedium op de houder en laat dit bevriezen. Plaats de houder in de kop van de microtoom en snijd voldoende van het bevroren medium weg om een vlak oppervlak voor uw monster te creëren. Verwijder de houder uit de kop van de microtoom en plaats deze vlak in de cryostaat.Giet het inbedmedium op de houder en druk dit stevig aan. Plaats het hersenblok langzaam en volledig met de snijkant naar beneden op de houder. Bed het hersenfragment in het montagemedium.Plaats de houder met het gemonteerde brein in het kopgedeelte van de microtoom, gebruikmakend van de vooraf bepaalde bemonsteringsfrequentie. Wees zeer zorgvuldig om de coupes in de juiste volgorde te houden, of ze nu op een objectglas worden gemonteerd of worden toegevoegd aan een specifieke serie in de plaat met antigeenconserveermiddel. Snijd de coupes zodanig dat u later kunt terugkeren naar de breinbank om een andere systematische steekproef te nemen.Zodra u het weefsel volledig heeft gesneden en de coupes in de putjes heeft geplaatst, sluit u de plaat met het deksel, wikkelt u het deksel in Parafilm en plaatst u deze in een vriezer van -20 °C. Registreer het totaal aantal coupes in elke serie, het bemonsteringsinterval van de coupes en het aantal series per dier. Dit logboek is essentieel om de coupes bij te houden wanneer u deze uit de hersenenbank haalt voor toekomstige experimenten.Systematisch bemonsteren op deze wijze is een standaardpraktijk in ons laboratorium. In de afgelopen drie jaar hebben we veel succes behaald bij het uitvoeren van immunohistochemie op materiaal dat drie jaar lang in antigen preserve is bewaard zonder verslechtering van het signaal. Bovendien hebben we, als onderdeel van onze hersenbank, bijna 20.000 systematische coupes van de hersenen van niet-menselijke primaten geregistreerd.Als onderdeel van onze langetermijnonderzoeksplannen hebben we zojuist gedemonstreerd hoe u systematisch een biologisch specimen bemonstert en bewaart. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om een gedetailleerd logboek bij te houden van het totale aantal series dat is genomen en het totale aantal coupes per serie. Noteer bovendien in het logboek wanneer een coupe verloren gaat of beschadigd raakt, om zo een systematische bemonsteringsprocedure te waarborgen.Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

brain-banking-making-the-most-of-your-research-specimens

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We beschrijven een rat model van post-traumatische stress-stoornis (PTSS) dat de aanhoudende veranderingen in neuro-endocriene functie en de vertraagde lange termijn, overdreven angst reactie, kenmerkend voor PTSS-patiënten laat zien. Het diermodel en de hier beschreven methoden zijn nuttig voor het correleren van biomarkers in hersenkernen, die mechanisch maar kan niet worden gemeten in patiënten met biomarkers in perifere witte bloedcellen, die kan.

Biomarkers in een diermodel voor het openbaren van Neural, hematologische, en gedragsmatige correlaten van PTSS

The video demonstrates a step-by-step procedure for symmetrically dissecting a fixed postmortem human brain, preparing smaller tissue blocks for further analysis.

Symmetric Bihemispheric Sectioning of the Human Postmortem Brain

Een gemeenschappelijke eiwitextractie protocol met behulp van ureum / thioureum / SDS buffer voor menselijke en muizen hersenweefsel maakt het identificeren van eiwitten door 2D-DIGE en de daaropvolgende karakterisering door mini 2DE immunoblotting. Deze methode maakt een meer reproduceerbare en betrouwbare resultaten te verkrijgen van menselijke biopsies en experimentele modellen.

Consensus Brain-afgeleide eiwit, Extraction Protocol voor de studie van mensen en muizen Brain Proteome behulp Zowel 2D-DIGE en Mini 2DE Immunoblotting

Georganiseerd hersenen snijden procedures zijn noodzakelijk om specifieke neuropsychiatrische verschijnselen met definitieve neuropathologische diagnoses te correleren. Brain stekken worden anders uitgevoerd op basis van diverse clinico-academische onvoorziene uitgaven. Dit protocol beschrijft een symmetrische bihemispheric hersenen snijden procedure hemisferische verschillen in de menselijke hersenen pathologieën te onderzoeken en de huidige en toekomstige biomoleculaire / neuroimaging...

Symmetrische Bihemispheric postmortaal Brain snijden om gezond en pathologisch Brain Voorwaarden-studie bij mensen

Hier presenteren we een protocol om te bevriezen en afdeling hersenweefsel van meerdere dieren als een tijdbesparende alternatief voor één hersenen verwerken. Dit vermindert kleuring variabiliteit tijdens immunohistochemistry en vermindert de tijd cryosectioning en beeldvorming.

Gelijktijdige Cryosectioning van meerdere knaagdier hersenen

Dit protocol beschrijft een methode om individuele hersenverouderingstrajecten te volgen via een hersendonatieprogramma en de juiste karakterisering van hersenen. Hersendonoren zijn betrokken bij een langdurige longitudinale studie met inbegrip van seriële multi-dimensionale beoordelingen. Het protocol bevat een gedetailleerde beschrijving van de verwerking van de hersenen en een nauwkeurige diagnostische methodologie.

Abbiategrasso Brain Bank Protocol voor het verzamelen, verwerken en karakteriseren van veroudering hersenen

Deze procedure beschrijft de verzameling van discrete bevroren hersengebieden om hoogwaardige eiwitten en RNA te verkrijgen met behulp van goedkope en algemeen beschikbare tools.

Verzameling van bevroren knaagdierhersengebieden voor downstreamanalyses

Biobanken zijn cruciale bronnen voor biomedisch onderzoek en de Biobank for Translational and Digital Medicine Unit van het European Institute of Oncology is een model op dit gebied. Hier geven we een gedetailleerde beschrijving van de standaard operationele procedures van biobanken voor het beheer van verschillende soorten menselijke biologische monsters.

Biobank voor translationele geneeskunde: standaard operationele procedures voor optimaal monsterbeheer

Een methode voor de isolatie van neurale stamcellen en oligodendrocytenvoorlopercellen uit de hersenen van levende ratten wordt hier in experimenteel detail gepresenteerd. Het maakt meerdere verzamelingen van deze cellen van dezelfde dieren mogelijk zonder hun welzijn in gevaar te brengen.

De "Brain Milking"-methode voor de isolatie van neurale stamcellen en voorlopercellen van oligodendrocyten uit levende ratten

Dit protocol beschrijft een methode om het verzamelen van monsters van radicale prostatectomiemonsters te vergemakkelijken. Het doel is om weefselmonsters van de monsters in kaart te brengen, te karakteriseren en micro-macro te ontleden op basis van anatomopathologische criteria voordat ze in een biobank worden opgeslagen.

Verbetering van de betrouwbaarheid van biobanking van prostaattumoren met verbeterde bemonsteringstechniek en histologische karakterisering

Moderne neurowetenschappen moeten verschillen onderzoeken tussen veel soorten, waaronder laboratoriumknaagdieren en mensen. Toch ontstaan er technische problemen wanneer groothersenzoogdieren betrokken zijn. Deze benadering richt zich op intersoortelijke variatie van neuronale populaties bij zeer verschillende zoogdieren, wat vergelijkbare resultaten oplevert die in kaart kunnen worden gebracht om evolutionaire patronen te onthullen.

Een vergelijkende benadering voor kwantitatieve celtellingsstudies in zeer verschillende zoogdierhersenen

Leer systematische hersenmonsters voorbereiden voor cryostaatsecties in de neurowetenschap. Deze methode maximaliseert onderzoeksmateriaal en behoudt antigeen voor onbevooroordeelde stereologische analyse.

Brain Banking: Het maken van de meeste van uw onderzoek Specimens

Meer video's verkennen