Name: Detectie van eiwit ubiquitinering (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-19T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Leer betrouwbare methoden om eiwitubiquitinering te detecteren in gekweekte cellen en in vitro. Deze technieken helpen onderzoekers bij het bestuderen van ubiquitineligases en hun rol in ziekteprocessen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door NIH subsidie ​​RO1 DC006497, RO1 NS057289, en PO1 ES016738 (tot Z. Zhang); California Institute for Regeneratieve Geneeskunde beurzen RS1-00331-1 en RL1-00682-1 (tot Z. Zhang), de Amerikaanse Parkinson Disease Association (tot Z. Zhang en YS Choo) en de Michael J. Fox Foundation voor onderzoek van Parkinson (Z. Zhang).

Detectie van eiwit ubiquitinatie in gekweekte cellen <ol><li> Transfecteren gekweekte cellen met plasmiden uiting van de eiwit van belang en (epitoop-gemerkte versie van) ubiquitine. </li><li> Compleet te maken cellysis buffer (2% SDS, 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0) met 2 mM natrium orthovanadate, 50 mM natrium-fluoride, en proteaseremmers. </li><li> Lyse cellen met 100 pl cellysis buffer per plaat (6 cm schotel). Als er een grotere schotel wordt gebruikt, dienovereenkomstig aan te passen volume. Swirl de schotel voorzichtig te laten de lysis buffer bestrijken het gehele gebied van volwassen cellen. </li><li> Verzamel de cellen met een cel schraper en overdracht van de cellysaten in een 1,5 ml Eppendorf buis. Plaats de buis op een hete plaat direct aan de kook gedurende 10 minuten. </li><li> Shear de cellen met een sonicatie apparaat. </li><li> Voeg 900ul van verdunning buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% Triton). Incubeer monsters bij 4 ° C gedurende 30-60 minuten met rotatie. </li><li> Spin de verdunde monsters op 20.000 xg gedurende 30 minuten. Breng de resulterende supernatant naar een nieuwe eppendorfbuisje. Wees voorzichtig dat u de pellet te verstoren. </li><li> Meet de eiwit concentratie. </li><li> Bereid Proteïne A-of G-agarose bead-geconjugeerd antilichaam tegen het doelwit eiwit in een compatibele buffer (50% suspensie). Snijd het smalle uiteinde van een P-200 pipetpunt en overdracht 14-20 ul van hars aan 500-1,500 ug voorbereid cellysaten voor immunoprecipitatie. Voor cellen met een hoge transfectie-efficiëntie, zal 500 ug genoeg zijn. Voor cellen met een lage transfectie-efficiëntie, kunnen meer eiwit nodig. </li><li> Incubeer de cellysaat-kraal mengsel bij 4 ° C gedurende de nacht met rotatie. </li><li> Spin down de parels bij 5000 xg gedurende 5 minuten. Zuig het supernatant. Was de hars met het wassen buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40) twee keer. </li><li> Spin de kralen voor een laatste keer bij 20.000 xg gedurende 30 sec. Zuigen de resterende wasbuffer en kook de hars met 2X SDS laadbuffer. </li><li> Laad monsters op een SDS-PAGE gel voor immunoblot analyse. </li><li> Detecteren ubiquitine en het doelwit eiwit met de respectievelijke antilichamen. Voor immunoblotting, we doorgaans voor het eerst ontdekken ubiquitine. Het membraan zal vervolgens worden gebruikt om het eiwit neergeslagen op te sporen. </li></ol> Detectie van ubiquitinatie op doel eiwit door middel van in-vitro-assay ubiquitinering <ol><li> Maak 5x ubiquitinatie buffer (100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 25 mM MgCl2, 2,5 mM DTT, 10 mM ATP). Bewaar ze in kleine porties bij -20 ° C gedurende maximaal 6 maanden. Sommige protocollen ook toevoegen creatine fosfaat en creatine kinase in de buffer voor de ATP-regeneratie 1,2. </li><li> Voor elke reactie, een mengsel met de volgende: <table border="1"><tbody><tr><td> 8 ul </td><td> 5X ubiquitinering buffer </td></tr><tr><td> 250 ng </td><td> ubiquitinering E1 </td></tr><tr><td> 500 ng </td><td> ubiquitinering E2 </td></tr><tr><td> 0,5 ug </td><td> ubiquitine </td></tr><tr><td> 0,5 ug </td><td> eiwit van interesse </td></tr><tr><td></td><td> water tot 40 ui totaal volume </td></tr></tbody></table> Als controles, voor te bereiden soortgelijke reacties in de afwezigheid van een van beide E1, E2, of ubiquitine. </li><li> Incubeer dit mengsel bij 37 ° C gedurende 1 uur of langer. </li><li> Stop de reactie door het toevoegen van SDS-PAGE monsterbuffer en kook het monster gedurende 10 minuten. </li><li> Laad monsters op SDS-PAGE gel voor immunoblot analyse. </li><li> Detecteren ubiquitine en het doelwit eiwit met de respectievelijke antilichamen. </li></ol>

<ol><li>Xiong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1%2C+and+DJ-1+form+a+ubiquitin+E3+ligase+complex+promoting+unfolded+protein+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">PINK1, and DJ-1 form a ubiquitin E3 ligase complex promoting unfolded protein degradation.</a> J Clin Invest. 119, 650-660 (2009).</li>
<li>Xirodimas, D. P., Saville, M. K., Bourdon, J. C., Hay, R. T., Lane, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mdm2-mediated+NEDD8+conjugation+of+p53+inhibits+its+transcriptional+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mdm2-mediated NEDD8 conjugation of p53 inhibits its transcriptional activity.</a> Cell. 118, 83-97 (2004).</li>
<li>Didier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNF5%2C+a+RING+finger+protein+that+regulates+cell+motility+by+targeting+paxillin+ubiquitination+and+altered+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">RNF5, a RING finger protein that regulates cell motility by targeting paxillin ubiquitination and altered localization.</a> Mol Cell Biol. 23, 5331-5345 (2003).</li>
<li>Laney, J. D., Hochsetrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unit+14.5+Analysis+of+Protein+Ubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Unit 14.5 Analysis of Protein Ubiquitination.</a> Current Protocols in Protein Science. , 14.5.1-14.5.11 (2002).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te melden.

In deze presentatie hebben we voor het eerst beschreven stappen die toelaten het detecteren van ubiquitine modificatie op een eiwit van interesse in gekweekte zoogdiercellen. Met het oog op ubiquitinatie specifiek te sporen op het eiwit van belang, niet op non-covalent interagerende eiwitten, gebruikten we een strikte voorwaarde voor cellysis, immunoprecipitatie en wassen 1,3. Ubiquitinatie, gedetecteerd door immunoprecipitatie van target eiwit in zulk een harde voorwaarde, gevolgd door anti-ubiquitine immuno...

detectie van eiwit ubiquitinering

Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitinatie, de covalente bevestiging van de polypeptide ubiquitine aan eiwitten richten, is een belangrijke posttranslationele modificatie uitgevoerd door een set van drie enzymen. Zij omvatten ubiquitine-activerend enzym E1, ubiquitine-conjugatie enzym E2 en E3 ubiquitine ligase. In tegenstelling tot bij E1 en E2, E3 ubiquitine ligasen weer te geven substraat specificiteit. Aan de andere kant, een groot aantal deubiquitylating enzymen hebben rollen in de verwerking polyubiquitinated eiwitten. Ubiquitinatie kan leiden tot een verandering van eiwitten stabiliteit, cellulaire lokalisatie en de biologische activiteit. Mutaties van genen die betrokken zijn bij de ubiquitinatie / deubiquitination pad of gewijzigd ubiquitine-systeem de functie worden geassocieerd met vele verschillende ziekten bij de mens, zoals verschillende soorten kanker, neurodegeneratie, en metabole stoornissen. De detectie van een veranderde of normale ubiquitinatie van target eiwitten kunnen voorzien in een beter inzicht in de pathogenese van deze ziekten. We beschrijven hier protocollen aan eiwit ubiquitinatie te detecteren in gekweekte cellen<em&gt; In vivo</em&gt; En reageerbuizen<em&gt; In vitro</em&gt;. Deze protocollen zijn ook nuttig voor andere ubiquitine-achtige kleine molecule wijziging, zoals sumolyation en neddylation op te sporen.

Ubiquitinatie is een belangrijke posttranslationele modificatie uitgevoerd door een set van drie enzymen. Mutaties van genen die betrokken zijn in deze wijziging worden geassocieerd met vele verschillende ziekten bij de mens. We beschrijven hier protocollen aan eiwit ubiquitinatie te detecteren in gekweekte cellen<em&gt; In vivo</em&gt; En reageerbuizen<em&gt; In vitro</em&gt;.

Detectie van eiwit ubiquitinering

Ubiquitinering, de covalente binding van het polypeptide ubiquitine aan doelwitproteïnen, is een cruciale posttranslationele modificatie die wordt uitgevoerd door een set van ...

Hoi, ik ben Chu van het laboratorium van Jo aan het Birmingham Institute for Medical Research. Vandaag laten we u een procedure zien voor het detecteren van proteïne-nucleatie. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om parkine of UBI three ligases en hun substraat te bestuderen.Laten we beginnen. Om dit protocol te starten, transfecteert u de cellen met plasmiden die zowel het doeleiwit als een epitoop-getagde versie van ubiquitine tot expressie brengen. Laat de cellen ongeveer 40 uur groeien, ga vervolgens naar de laboratoriumbank om de cellen te lyseren, aspireer het vloeibare medium af en was de cellen tweemaal met PBS.Lyseren de cellen vervolgens door per plaat van zes centimeter 100 µL cellysebuffer toe te voegen, waarin 2% SDS is opgenomen. Draai elke plaat voorzichtig zodat de buffer de cellen volledig bedekt. Gebruik daarna een celschraper om de gelyseerde cellen te verzamelen en breng deze over naar een Eppendorfbuis van 1,5 mL.Plaats de buis onmiddellijk op een warmteblok en kook de lys-cellen gedurende 10 minuten om eiwitten verder te denatureren en op te lossen. Gebruik na het koken een sonicatieapparaat om de cellen en hun DNA te fragmenteren. Deze stap vermindert de viscositeit van de cellysaten.Voeg na sonicatie 900 µL verdunningsbuffer toe en laat de monsters 30 tot 60 minuten roteren bij 4 °C. Centrifugeer de verdunde monsters na de incubatie 30 minuten bij 20,000 ×g en 4 °C om de oplosbare eiwitten te verkrijgen. Draag vervolgens het supernatant over naar een nieuwe eppendorf, waarbij u er zorg voor draagt dat het pellet niet wordt verstoord.Meet tot slot de eiwitconcentratie in het supernatant met een methode zoals de gemodificeerde Lowry-assay die we hier gebruiken. Nu bent u klaar om immunoprecipitatie te gebruiken om uw doeleiwit te isoleren van de andere eiwitten in het supernatant. De eerste stap bij immunoprecipitatie is het voorbereiden van de beads die geconjugeerd zijn aan antilichamen tegen uw doeleiwit.U kunt commercieel verkrijgbare antilichaamgeconjugeerde beads gebruiken of uw eigen geïmmobiliseerd antilichaam maken met behulp van crosslinkers. Bereid het geïmmobiliseerde antilichaam, zoals wij hier hebben gedaan, in een compatibele buffer om een slurry van 50% te maken voor het opzetten van de aminoprecipitatiereactie. Knip het smalle uiteinde van een P 200 pipetpunt af en breng 14 tot 20 µL hars over naar 500 tot 1500 µg van de bereide cellysaten.Pas de hoeveelheid cellysaat die u gebruikt aan op basis van de transfectie-efficiëntie van uw cellen. Laat het mengsel van cellysaat en beads een nacht roteren bij vier graden Celsius. Gedurende deze tijd zal het aan de beads geconjugeerde antilichaam specifiek binden aan uw doeleiwit.Centrifuge de volgende dag de kraaltjes de volgende dag 5 minuten bij 5.000 Gs bij vier graden Celsius om uw eiwit te pelletteren. Nu het eiwit aan de kraaltjes is gebonden, zuigt u het supernatant af en wast u de hars twee keer met de high salt washing buffer door te centrifugeren bij 5.000 Gs gedurende vijf minuten. Centrifugeer de kraaltjes bij vier graden Celsius voor een laatste maal 30 seconden bij 20.000 GS en zuig de resterende wasbuffer af.Nu u uw doeleiwit heeft gezuiverd, is het tijd om het eiwit te analyseren via een SDS-PAGE-gel. Kook eerst de kraalharpix met twee volumes SDS-laadbuffer om de eiwitten te denatureren en ze een negatieve lading te geven. Laad de voorbereide monsters op een SDS-PAGE-gel.Breng de eiwitten via gel-transfer over naar een membraan volgens het protocol voor western blotting van uw laboratorium. Probeer het blot vervolgens met antilichamen tegen ubiquitine of het doeleiwit en ontwikkel het membraan op film om geubiquitineerde eiwitten te visualiseren. We hebben u zojuist laten zien hoe u eiwitubiquitinering in gekweekte cellen kunt detecteren.Ditzelfde experiment kan in vitro in een reageerbuis worden uitgevoerd. Deze reactie heeft een totaal volume van 40 µL en kan in een PCR-buis worden gedaan. Bereid elke reactie als volgt voor.Voeg eerst vijf keer UBIQUITINATION-buffer toe, die een TP en het reductiemiddel DIO three etol, DTT bevat. Voeg vervolgens de ubiquitineringsenzymen E one en E two toe. Voeg de substraten, ubiquitine en het doeleiwit toe.Breng het totale reactievolume aan met water tot 40 µL als controles. Bereid soortgelijke reacties voor in de afwezigheid van ubiquitin E1, E2 of het doeleiwit. Incubeer het mengsel gedurende één uur of langer bij 37 °C.Stop de reactie door SDS-PAGE monsterbuffer toe te voegen. Kook het monster gedurende 10 minuten. Breng de monsters aan op een SDS-PAGE gel en ga verder met de immunoblot-analyse zoals gedaan bij het in vivo experiment.Hier is een voorbeeldresultaat van dit protocol. Parkinson. Een eiwit dat geassocieerd is met de ziekte van Parkinson is hier het eiwit van belang. En baan vier toont geubiquitineerde parine.De typische sterke smears of ladders worden weergegeven boven het molecuulgewicht van het ongemodificeerde parine om verschillende experimentele condities, de cellulaire expressieniveaus van het ongemodificeerde doeleiwit, parine en ubiquitine te vergelijken, die voor elke conditie ook in overweging moeten worden gebracht. Dit is een voorbeeld van in vitro parine-ubiquitinering waarbij affiniteitsgezuiverd parine werd getest op in vitro ubiquitinering in aanwezigheid van recombinant E1, E2 en biotin-tag ubiquitine. Biotin-geubiquitineerd parine werd gedetecteerd met streptavidine-HRP. Het geubiquitineerde parine verschijnt als ladders boven het molecuulgewicht van het ongemodificeerde parine. Baan één, twee en vier zijn controles die respectievelijk geen ubiquitine, E1 of E2 bevatten.We hebben zojuist laten zien hoe u de eiwit-nvaccinatie in kweekcellen kunt detecteren. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat het cellulair lysaat onder streng detergente omstandigheden moet worden geprepareerd en dat het cellulair lysaat moet worden verdund voordat de gemobiliseerde antilichamen worden toegevoegd. Dat is alles.Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experiment.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This video describes a method to extract and purify ubiquitinylated peptides containing remnant di-glycine peptides from a complex peptide mixture. The presented method may help in identifying original ubiquitination sites in the protein.

Immunoaffinity Based Extraction of Ubiquitinylated Peptides: A Technique to Selectively Extract Ubiquitin Tagged Peptides from Purified Peptide Fractions

Het huidige protocol Gegevens een werkwijze voor het meten van de activiteit van functioneel homoloog ubiquitinerings enzymen. Gespecialiseerde probes covalent enzym passen en zorgen voor detectie. Deze methode heeft de potentie om nieuwe therapeutische targets te identificeren.

Methode voor het meten van de activiteit van ubiquitinerings Enzymen in cellijnen en weefselmonsters

We presenteren een methode voor de zuivering, detectie en identificatie van diGly peptiden die afkomstig zijn van ubiquitinated eiwitten uit complexe biologische monsters. De gepresenteerde methode is reproduceerbaar, robuust en presteert beter dan gepubliceerde methoden met betrekking tot het diepteniveau van de ubiquitinomenanalyse.

Detectie van eiwitubiquitinatiesites door peptideverrijking en massaspectrometrie

Ubiquitination is een post-translationele modificatie die belangrijke rollen speelt in cellulaire processen en nauw gecoördineerd wordt door deubiquitination. Defecten in beide reacties ten grondslag liggen aan menselijke pathologieën. Wij bieden protocollen voor het uitvoeren van Ubiquitination en deubiquitinisatie reactie in vitro met behulp van gezuiverde componenten.

In vitro Ubiquitination en Deubiquitinisatie assays van Nucleosomale histonen

Dit protocol is gericht op het opzetten van ubiquitine (UB) en ubiquitine-likes (Ubls) specifieke proteomes om veranderingen van dit soort post-translationele modificaties (Ptm's) te identificeren, geassocieerd met een specifieke aandoening zoals een behandeling of een fenotype.

Profilering van Ubiquitin en Ubiquitin-achtige afhankelijke post-translationele modificaties en identificatie van belangrijke veranderingen

Deze methode beschrijft de beoordeling van wereldwijde veranderingen in de ubiquitin ketentopologie. De beoordeling wordt uitgevoerd door de toepassing van een op massaspectrometrie gebaseerde gerichte proteomics-benadering.

Ubiquitin-ketenanalyse door parallelle reactiemonitoring

We bieden een gedetailleerd protocol voor een alomtegenwoordyleringstest van een specifiek substraat en een E3-ubiquitine-ligase in zoogdiercellen. HEK293T-cellijnen werden gebruikt voor eiwitoverexpressie, het polyubiquityleerde substraat werd gezuiverd uit cellysaten door immunoprecipitatie en opgelost in SDS-PAGE. Immunoblotting werd gebruikt om deze posttranslationele modificatie te visualiseren.

Evaluatie van substraatubiquitylering door E3 Ubiquitine-ligase in zoogdiercellysaten

Het protocol beschrijft een stapsgewijze methode om ubiquitinated eiwitten uit zoogdiercellen te zuiveren met behulp van het p53 tumor suppressor-eiwit als voorbeeld. Ubiquitinated p53-eiwitten werden gezuiverd uit cellen onder strenge niet-condenserende en denaturerende omstandigheden.

Zuivering van ubiquitinated p53-eiwitten uit zoogdiercellen

Het huidige protocol belicht een gemodificeerde methode voor het detecteren en kwantificeren van DNA-eiwit crosslinks (DPC's) en hun posttranslationele modificaties (PTM's), waaronder ubiquitylering, SUMOylation en ADP-ribosylatie geïnduceerd door topoisomeraseremmers en door formaldehyde, waardoor de vorming en reparatie van DPC's en hun PTM's kan worden bestudeerd.

Kwantitatieve detectie van DNA-eiwit crosslinks en hun posttranslationele modificaties

Het experiment dat hier wordt gebruikt, toont een methode van moleculaire docking in combinatie met sondetechnologieën om de interactie tussen kleine moleculen van de traditionele Chinese geneeskunde en eiwitdoelen te voorspellen en te valideren.

Screening van traditionele Chinese geneeskundige verbindingen op remming van UCHL3-activiteit op basis van moleculaire docking en deubiquitinerende enzymsondetechnologie

Ubiquitinatie is een cruciale regulator van de functies van intracellulaire eiwitten. Hier beschrijven we twee cellysemethoden om substraatproteïneniveaus te detecteren in zoogdiercellen en vergelijken we hun effectiviteit bij het analyseren van ubiquitinatieniveaus. Eiwitoverexpressie in HEK293T cellen werd geïnduceerd door tijdelijke transfectie, en ubiquitinatieve eiwitten werden gedetecteerd door western blot-analyse.

Vergelijkende strategieën voor ubiquitinatiedetectie in zoogdiercellysaten met SMAD2/SMURF2 als model

Leer betrouwbare methoden om eiwitubiquitinering te detecteren in gekweekte cellen en in vitro. Deze technieken helpen onderzoekers bij het bestuderen van ubiquitineligases en hun rol in ziekteprocessen.

Detectie van eiwit ubiquitinering

Meer video's verkennen