Voorbereiding van de Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron en Glia Development Studies
30 september 2009
Een protocollen voor een embryonale hersenen van de rat totale cultuur-systeem is beschreven. Multipotente voorlopercellen in de aggregaten kunnen ontwikkelen en differentiëren tot neuronen, astrocyten en oligodendrocyten.
Wij introduceren een systeem voor het kweken van CNS-neuroprogenitoren terwijl zij zich ontwikkelen en differentiëren tot mature neuronen en glia. De procedure begint met het isoleren van vier hersenen van E 16 rat-foetussen en het verteren ervan met propane. De weefsels worden omgezet in een single-cell suspensie, gefiltreerd, geteld en verdeeld over een zes.
Cellen in de weidplaat worden één keer per dag gedurende twee tot drie dagen voorzichtig geresuspendeerd om de vorming van aggregaten mogelijk te maken. De aggregaten worden vervolgens verzameld en gezeefd door een mesh van 200 micrometer, waarbij kleine klonters en celresten door wassing worden verwijderd. Ten slotte worden de aggregaten geteld en geplaatst op met matrigel gecoate dekglasjes.
Hoi, ik ben Coto van het laboratorium van Dr. John L van de afdeling Veterinary Integrated Biosciences aan de Texas A&M University. Vandaag tonen we u een procedure voor hersenaggregatenkweken. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om endocyt-lijnen, celontwikkeling en cellulaire interacties te bestuderen.
Laten we beginnen. Zorg dat u vóór aanvang de volgende zaken op de werkbank klaar heeft staan: steriele instrumenten, 70% ethanol, een absorberende onderlegger om op te werken en petri-schalen van 10 centimeter met dissectiemedium op ijs.
Bereid in de zuinetkast een dissectiemicroscoop voor met een ijsplatform en verschillende schaaltjes van 10 centimeter met dissectiemedium, eveneens op ijs. Maak tot slot de oplossingen die u zult gebruiken en warm het plaatmedium op tot 37 °C in een waterbad. U begint dit protocol met het oogsten van embryo's op embryonale dag 16 (E16) van een Sprague Dawley-rat.
Euthanaseer eerst een drachtig vrouwelijk dier volgens een procedure die is goedgekeurd door de commissie voor dierexperimenten van uw instelling. Leg de geëuthanaseerde rat op een absorberende onderlegger en bespuit de buik met alcohol om deze te reinigen. Gebruik vervolgens een pincet om de huid van de buik samen te knijpen en knip met de andere hand met een schaar alleen door de huid; spreid de huid open en gebruik een andere set gesteriliseerde pincetten en een schaar om door de spierlaag heen te knippen.
Verwijder vervolgens de uterus en plaats deze in een schaal van 10 centimeter met ijskoud dissectiemedium. De volgende stap vindt plaats in de zuivkap met behulp van microsdissectiescharen. Verwijder voorzichtig elke embryo uit de uterus.
Nu is het tijd om de oogst te starten. Werk met de embryonale hersenen. Oogst de hersenen van elk embryo en plaats de vrijgemaakte hersenen in een schone schaal van 10 centimeter met dissectiemedium op een ijsplatform. Voltooi de dissectie van de hersenen onder de dissectiemicroscoop.
Verwijder de secties van de middenhersenen en de achterhersenen. Gebruik een fijne pincet om de menes te verwijderen en breng het resterende deel van de voorhersenen over naar een Falcon-buis van 50 milliliter met dissectiemedium. Het weefsel is nu gereed voor de volgende stap.
Dissociatie van cellen door enzymatische digestie. Vlak voordat u klaar bent om de digestie te starten, maakt u verse oplossingen van propaan en trypsineremmerfilter. Steriliseer deze en warm ze op tot 37 °C in een waterbad.
Verwijder het overtollige medium uit de gedisseceerde hersenen. Voeg vervolgens vier milliliter van de bereide propaan-digestieoplossing toe aan uw buis van 50 milliliter. Incubeer de buis in een waterbad van 37 °C gedurende precies vijf minuten.
Wanneer de tijd is verstreken, gebruik dan een pipet om de propaanoplossing te verwijderen. Voeg vervolgens vijf milliliter vers bereide trypsineremmeroplossing toe en plaats de buis nog twee tot drie minuten terug in het waterbad van 37 °C. Wanneer de tijd is verstreken, wordt de trypsineremmeroplossing verwijderd.
Herhaal de incubatie met de trypsine-remmingsoplossing nog drie keer. Nadat u de trypsine-remmingsoplossing voor de laatste keer heeft verwijderd, voegt u 20 milliliters voorverwarmd plaatmedium (pm) toe aan uw buis.
Nu is het tijd om uw cellen te resuspenderen en te wassen. Resuspendeer de cellen met een pipet van 10 milliliter ongeveer 20 tot 30 keer, totdat alle klontjes zijn verdwenen. Centrifugeer ze vervolgens gedurende zeven minuten bij 100 ×g.
Op dit punt moeten uw cellen goed van elkaar gescheiden zijn. Verwijder na zeven minuten het supernatant en resuspendeer de pellet in 10 milliliter platingmedium om de cellen te wassen.
Centrifugeer ze vervolgens opnieuw. Verwijder het supernatant en herhaal het wassen en centrifugeren. Stap na de tweede wasbeurt.
Resuspendeer de pellet in 10 milliliter aggregaatcultuurmedium en breng de cellen door een cellzeef van 70 micrometer. Tel tot slot de levende cellen met behulp van een hemocytometer.
Nu bent u klaar om de gedissocieerde hersencellen aggregaten te laten vormen. Suspendeer na het tellen de gedissocieerde cellen in aggregaatkweekmedium bij een dichtheid van 2 x 10⁶ cellen per milliliter. Breng twee milliliter van de cel-suspensie over in elke put van een ongecoate zes-puts kweekplaat.
Resuspendeer de cellen gedurende drie nachten elke dag voorzichtig. Wanneer een P 1000 pipette wordt gebruikt, zullen de cellen op de dag van het uitplaten van de aggregaten aggregaten beginnen te vormen. Nadat de cellen drie nachten zijn gegroeid, resuspendeer de cellen opnieuw voorzichtig en breng de suspensie via een 200 micrometer mesh over in een 50 milliliter falcon tube.
Laat de aggregaten gedurende ongeveer drie tot vijf minuten naar de bodem van de buis bezinken. Verwijder vervolgens voorzichtig het supernatant, voeg medium toe, resuspendeer de aggregaten voorzichtig en laat ze opnieuw bezinken. Herhaal deze procedure meerdere keren.
Om dode cellen, individuele cellen en debris te verwijderen, gebruikt u de microscoop om te controleren of de supernatten nog steeds niet-geaggregeerde cellen en debris bevatten. Zodra u de aggregaten grondig heeft gewassen, resuspendeert u ze voorzichtig in hetzelfde medium en telt u de aggregaten om hun concentratie te bepalen. Pas vervolgens de dichtheid van de aggregaten aan naar ongeveer 25 tot 30 aggregaten per 50 microliters.
Nu is het tijd om de dekglasjes met aggregaten te zaaien. Breng aliquoten van 1000 µL van de aggregaatsuspensie over naar twee milliliter eend Dwarf-buisjes; aangezien aggregaten hebben de neiging om naar de bodem van de buisjes te zinken, is het cruciaal om meerdere buisjes met de aggregaatsuspensie te maken voor het uitplaten. De dekglasjes die in deze stap worden gebruikt, zijn gecoat met een celcultuursubstraat, matrigel, door een incubatie van een nacht bij 37 °C.
Nadat u de aliquoten van de aggregaatsuspensie heeft gemaakt, haalt u de kweekplaat met de Matrigel-gecoate dekglasjes uit de incubator. Verwijder de oplossing uit elke put. Was de dekglasjes met warme PBS en vervolgens met DD H2O.
Ze zijn nu klaar voor het zaaien van aggregaten om het dekglas met aggregaten te bezaaien. Keer de buis met de aggregaatsuspensie om om de aggregaten te mengen en gelijkmatig te verspreiden. Breng vervolgens 50 µL van de aggregaatsuspensie aan in het midden van elk dekglas.
Plaats de plaat voorzichtig terug in de incubator zonder verdere verstoring, zodat de aggregaten gelijkmatig aan het dekglas kunnen hechten. De dichtheid van de aggregaten is cruciaal; als aggregaten te dicht bij elkaar staan of als de hechtingsdichtheid te hoog is, neigen ze samen te smelten terwijl ze groeien vier tot zes uur na de initiële hechting. Voeg 500 µL cultuurmedium toe aan elke put.
Om de aggregaatkweek in stand te houden, wordt het medium elke drie tot vier dagen voor de helft ververst. Voeg het medium bij het verversen langs de wand van de put toe om te voorkomen dat de aggregaten worden verstoord. Een paar uur nadat de aggregaten zich aan het dekglas hebben gehecht, kan uitgroei vanuit de aggregaten worden waargenomen.
Axonen groeien snel in de eerste twee weken en vormen overvloedige verbindingen tussen de aggregaten. Ggl-progenitoren migreren radiaal vanuit de aggregaten en differentiëren na verloop van tijd tot astrocyten en mature oligodendrocyten. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u CS-aggregaten kunt cultiveren.
Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om op de juiste capaciteit te quoten en het aggregaat gelijkmatig te verdelen. Dat is alles.
Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experiment.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een protocol voor het kweken van aggregaten van embryonaal rattenbrein. De multipotente progenitoren binnen deze aggregaten kunnen differentiëren tot neuronen, astrocyten en oligodendrocyten.
Belangrijke componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Celkweek
- Ontwikkelingsbiologie
Achtergrond
- Het begrijpen van de ontwikkeling van het centraal zenuwstelsel (CZS) is cruciaal voor neurowetenschappelijk onderzoek.
- Multipotente progenitorcellen kunnen aanleiding geven tot diverse celtypen in het zenuwstelsel.
- Aggregaatkweken bieden een model voor het bestuderen van cellulaire differentiatie.
- Deze methode maakt het mogelijk om het celgedrag in een gecontroleerde omgeving te observeren.
Doel van de studie
- Om een betrouwbaar culturesysteem voor CNS-neuroprogenitoren vast te stellen.
- Om de studie naar differentiatie tot mature neuronen en glia te faciliteren.
- Om een protocol te bieden dat in andere laboratoria gereproduceerd kan worden.
Gebruikte methoden
- Isolatie van hersenen uit ratfoetussen van E16.
- Digestie van hersenweefsel om een enkelcellige suspensie te creëren.
- Filtreren en tellen van cellen vóór de vorming van aggregaten.
- Uitplaten van aggregaten op met matrigel gecoate dekglasjes voor verdere analyse.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle vorming van aggregaten uit geïsoleerde progenitorcellen.
- Aantoonbare differentiatie naar neuronen en gliacellen.
- Vestiging van een reproduceerbaar protocol voor toekomstige studies.
- Potentiële toepassingen bij het begrijpen van de ontwikkeling van het centrale zenuwstelsel en aanverwante aandoeningen.
Conclusies
- Het beschreven cultuursysteem is effectief voor het bestuderen van CNS-progenitorcellen.
- Aggregaten kunnen dienen als model voor neuronale en gliale differentiatie.
- Deze methode kan het onderzoek in de ontwikkelingsneurowetenschap verbeteren.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de sector
Dit protocol vestigt een reproduceerbaar in vitro model van de ontwikkeling van het centraal zenuwstelsel (CZS), dat mechanistische analyse van neuro-gliale interacties en de progressie van de oligodendrogliale lijn mogelijk maakt. Door de differentiatie van progenitoren tot neuronen, astrocyten en oligodendrocyten in een serumvrij systeem na te bootsen, ondersteunt het de validatie van targets en fenotypische screening in onderzoek naar neurodegeneratieve ziekten. Het systeem biedt een schaalbaar platform voor het beoordelen van de effecten van verbindingen op myelinisatie en gliale rijping, wat bijdraagt aan strategieën voor preklinische risicoreductie.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt functionele validatie van CZS-targets mogelijk door de differentiatie van multipotente progenitoren tot mature neuronale en gliale fenotypes te observeren.
- Operationele waarde: Biedt een mens-relevant, serumvrij cultuursysteem om soortspecifieke translatierisico's bij studies naar target engagement te verminderen.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantificeerbare resultaten van axonale uitgroei, gliale migratie en de vorming van de myelineschede voor screeningscampagnes van verbindingen.
- Operationele waarde: Ondersteunt de standaardisatie van de assay via een gedefinieerde aggregaatdichtheid (25–30 aggregaten/50 µL) en tijdige mediumverversingen elke 3–4 dagen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Modelleert axo-gliale interacties en de rijping van oligodendrocyten, waardoor een ziekterelevant systeem wordt geboden voor onderzoek naar demyeliniserende aandoeningen.
- Operationele waarde: Maakt longitudinale tracking van cellulaire differentiatie over 3–4 weken mogelijk, wat tijdsonafhankelijke profielen van effectiviteit en toxiciteit ondersteunt.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot leadidentificatie en biedt een biologisch ontlast platform voor vroege evaluatie van verbindingen voordat men overgaat tot complexe preklinische modellen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothese-testen van gliale-neurale signaleringspaden via gecontroleerde differentiatie van CNS-progenitoren.
- Screening: Maakt reproduceerbare, kwantitatieve beoordeling mogelijk van de effecten van verbindingen op de integriteit van aggregaten en de expressie van lineage-specifieke markers.
- Analytics: Genereert meetbare output, waaronder axonlengte, gliale radiale migratie en rijpingsstadia van oligodendrocyten voor datagestuurde besluitvorming.
- Translationeel Onderzoek: Slaat een brug tussen ontdekking en preklinische validatie door mens-relevante CNS-ontwikkelingsprocessen en myeline-gerelateerde paden te modelleren.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een schaalbare, gestandaardiseerde workflow voor de productie van aggregaten, toepasbaar op meerdere neurowetenschappelijke projecten en therapeutische gebieden.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in doelmechanismen door de afhankelijkheid van overbelaste cellijnen te verminderen en fysiologische differentiatiedynamiek vast te leggen.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde procedures voor dissociatie, aggregatie en uitplating met behulp van gedefinieerde celdichtheden en rijpingstermijnen.
- Strategische waarde: Ondersteunt go/no-go beslissingen door vroegtijdig inzicht te bieden in de effecten van verbindingen op kritieke processen in het centraal zenuwstelsel, zoals myelinisatie en gliale ondersteuningsfuncties.
- Impact op portfolio: Maakt risicogestuurde prioritering van kandidaten mogelijk op basis van aangetoonde activiteit in een fysiologisch relevant gliale-neuronaal co-culturesysteem.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in embryonale weefseldissectie, enzymatische dissociatie en steriele aggregaatkweektechnieken.
- Afhankelijk van toegang tot tijdsgebonden zwangere Sprague-Dawley ratten, dissectie-apparatuur en CO2-incubators voor kweekonderhoud gedurende 3–4 weken.
- Vereist standaardisatie van protocollen voor het wassen van aggregaten, de plaatdichtheid en mediumverversing tussen gebruikers om fenotypische consistentie te garanderen.
- Aanpassing aan andere soorten of ontwikkelingsstadia zou re-optimalisatie van de enzymatische digestietijden en plaatdichtheden vereisen.
- Beperkt door de afwezigheid van vasculaire en immuuncomponenten, wat de modellering van neuro-inflammatoire aspecten van CZS-stoornissen kan beïnvloeden.
Veelgestelde vragen over Biopharma
Chapters in this video
0:52
Introduction
0:00
Title
1:27
Preparing for Dissection
2:02
Harvesting the E16 Rat Embryos
3:19
Isolating the Forebrains
4:25
Digesting and Triturating the Forebrain Tissue
6:09
Washing, Filtering, and Counting the Dissociated Cells
7:03
Culturing the Dissociated Cells to Promote Aggregation
7:54
Preparing the Coverslips and Washing the Aggregates
9:15
Seeding the Coverslips with the Aggregates
11:06
Representative Connections Formed Among Aggregates
11:29
Conclusion
