Name: Voorbereiding van de Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron en Glia Development Studies (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-30T23:59:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Leer een betrouwbaar protocol voor het kweken van embryonale rattenhersenaggregaten. Deze methode maakt differentiatie naar neuronen, astrocyten en oligodendrocyten mogelijk voor neurowetenschappelijk onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd deels gefinancierd door start-up middelen uit Texas A &amp; M University

Voorbereiding voor dissectie Chirurgische instrumenten: steriliseren alle dissectie schaar en pincet door de autoclaaf Dekglaasje reiniging: <ol><li> Geniet van alle dekglaasjes (15 mm in diameter voor de 24-wells plaat) in 1L gras beker in 33% HCl voor minimaal 24 uur </li><li> Wassen met stromend water gedurende 10 minuten met af en toe te schudden alle overblijvende HCl te verwijderen </li><li> Spoelen met Millipore water </li><li> Drainwater uit </li><li> Geniet van coverslips in 95-98% ethanol </li><li> Overdracht coverslips een schone tissue op een vlakke plaat en de lucht droog de dekglaasjes </li><li> Overdracht coverslips naar een glazen beker, dek af met aluminiumfolie en autoclaaf Opmerking: Dekglaasjes kunnen worden opgeslagen in dit stadium </li><li> Plaats individuele dekglaasje in de cultuur platen. Klaar voor het coaten </li></ol> Dekglaasje coating: <ol><li> Verdun 100 x voorraad van poly-D-lysine (PDL, 10 mg / ml in 0,5% bovine serum albumine in PBS, opgeslagen als fracties bij -20 ° C) met PBS en filter-gesteriliseerd (0,22 pm) </li><li> Coat coverslips met 1 x PDL-oplossing (~ 0,15 ml / cm 2) gedurende 2 uur bij 37 ° C in een incubator </li><li> Verwijder de PDL oplossing weg en was 3 keer met steriele DDH 2 O en droog coverslips volledig </li></ol> Let op: Coat genoeg dekglaasjes / platen voor elke dissectie. PDL-gecoate dekglaasjes kunnen worden opgeslagen voor een paar weken bij 4 ° C. Media en oplossingen Dissectie medium (DM): Gebruik Balanced Salt steriele ijskoud Hank&#39;s Solution (w / o Ca 2 +, Mg 2 +) (HBSS, Invitrogen 14175), aangevuld met 10 mM HEPES (Invitrogen 15630). Aggregate cultuur media: De DMEM/NBB27 medium bevat DMEM / Neurobasal (1:1 vol: vol), 2% B27, 1 x Sato, 0,5 mM natrium pyruvaat, 0.75mm Glutamax, 60μg/ml N-acetylcysteïne, 5 ng / ml insuline, 10nm d-biotine en 1% penicilline / streptomycine. Om 100 ml van de totale cultuur medium, mix 50 ml DMEM (w / o pyruvaat / glutamine, Invitrogen 11960), 50 ml Neurobasal medium (Invitrogen 211.034), 375 pl Glutamax (100 x, Invitrogen 35.050), 5,5 mg natrium pyruvaat (Sigma P2256), 2 ml B27 (Invitrogen 17.504), 6,3 mg N-acetylcysteïne (Sigma A8199), 1 ml op voorraad Sato (100 x voorraad, zie hieronder), 25 ul van d-biotine voorraad (4000 x voorraad, 40 uM in PBS opgeslagen als fracties bij -20 ° C. Sigma B4639), 100 ul van insuline (1000 x voorraad, 5 mg / ml in 0,01 N HCl opgeslagen als fracties bij -20 ° C, Sigma 16.634), en 1 ml penicilline / streptomycine (100 x voorraad, Invitrogen 15.140), filter-steriliseer en bewaar bij 4 ° C. Sato 100 x stamoplossing: Om 40 ml van de voorraad te maken: meng 40 ml Neurobasal met 400 mg apo-transferrine (Sigma T2252), 400 mg BSA (Sigma A9647), 10 ul van progesteron (25 mg / ml ethanol, opgeslagen als fracties bij -20 ° C. Sigma P8783), 64 mg putrescine (Sigma P7505) en 40 pi van natrium seleniet (30 uM in PBS, opgeslagen als fracties bij -20 ° C, Sigma S5261). Filter steriliseren van de Sato voorraad oplossing, en op te slaan als fracties bij -20 ° C. Neuron plating medium (PM): Neurobasal Medium, 2% B27, 2 mM glutamine (100x voorraad, porties bewaard bij -20 ° C, Invitrogen 25.030), 25μM glutaminezuur (100 aandelen, porties bewaard bij -20 ° C) en 1% penicilline / streptomycine. Neuron kweekmedium (CM): Neurobasal Medium, 2% B27, 2 mM glutamine (100x voorraad, porties bewaard bij -20 ° C) en 1% penicilline / streptomycine. 5-FDU voorraad: 100x voorraad, 1 mM 5-fluoro-2&#39;-deoxyuridine (Sigma F0503) and1mM uridine (Sigma U3003) in Neurobasal medium. Filter gesteriliseerd en opgeslagen als fracties bij -20 ° C. Papaïne spijsvertering oplossing (het maken van verse voorafgaand aan de dissectie): <ol><li> Los 3,2 mg L-Cysteïne (Sigma C-7352) in 4 ml DM </li><li> Breng de pH tot circa 7,4 met 1 N NaOH (pH-test op teststrips) en plaats in een waterbad bij 37 ° C Let op: Voer de volgende stap recht voor weefsel spijsvertering (zie hieronder). </li><li> Voeg papaïne tot een uiteindelijke concentratie van 20 eenheden / ml </li><li> Filter steriliseren (0.22mm), en plaats in een waterbad bij 37 ° C </li></ol> Trypsine-remmer oplossing (het maken van verse voorafgaand aan de dissectie): <ol><li> Los 0,2 g trypsine-remmer (Sigma T7295) in 20 ml DM </li><li> Controleer de pH en de pH instellen op ~ 7,4 met 1 N NaOH </li><li> Filter steriliseren, en plaats in een waterbad bij 37 ° C </li></ol> Brain Dissection Setup: <ul><li> Gesteriliseerd pincet en schaar </li><li> 70% ethanol </li><li> Schone tissue papier en DIAPER pad op de bank </li><li> 10cm petrischalen met ijs-koud DM voor de baarmoeder en de foetus op de bank </li><li> Ijs platform op dissectie microscoop </li><li> 2-3 6cm gerechten met DM op het ijs </li><li> Warm PM in een 37 ° C waterbad </li></ul><ol><li> Euthanaseren een zwangere Sprague-Dawley rat (E16), volgens een procedure goedgekeurd door uw Institutional Animal Care en ons Comite (IACUC) </li><li> Leg de rat op de luier pad en sterilisatie alcohol op de buikstreek </li><li> Gebruik een pincet om de buikhuid en een schaar te houden om een ​​V-vorm incisie te snijden alleen de huid </li><li> Uit elkaar de huid en gebruik een ander gesteriliseerd pincet en een schaar te snijden door de spierlaag </li><li> Pak de keten van de embryo zakken en breng ze in een 10 cm schotel met ijskoud DM </li><li> Met behulp van een schaar microdissection, verwijder voorzichtig elk embryo uit de zak en de hersenen van elk embryo, en plaats bevrijd hersenen in een schoon 10cm schotel met DM op een ijs-platform </li><li> In een Laminar motorkap en onder een microscoop dissectie, verwijder dan middenhersenen / achterhersenen secties, en gebruik fijne tang om hersenvliezen te verwijderen, en de overdracht van de gereinigde cortex / hippocampus aan een nieuwe 6 cm schotel met DM op een ice-pack Let op: in dit stadium, het weefsel is klaar voor enzymdigestie. </li><li> Maak papaïne en trypsine-remmer oplossing en filter steriliseren </li><li> Verwijder overtollige DM uit cortices / hippocampus </li><li> Voeg 4 ml van de bereide papaïne spijsvertering oplossing </li><li> Breng alle inhoud naar een 50 ml buis en de Falcon buis in een waterbad plaats bij 37 ° C gedurende precies 5 minuten </li><li> Verwijder papaïne oplossing met pipet </li><li> Voeg 5 ml trypsine-remmer oplossing, draai de buis, en plaats in een waterbad bij 37 ° C gedurende 2-3 min </li><li> Verwijder de trypsine-remmer oplossing </li><li> Herhaal stap 13 en 14 drie keer </li><li> Voeg 20ml warm PM </li><li> Vermaal totdat alle klonten zijn verdwenen (~ 20-30 keer) </li><li> Centrifugeer bij 100xg voor 7min </li><li> Resuspendeer de pellet in 10 ml PM en was twee keer door middel van centrifugeren </li><li> Resuspendeer de pellet in 10 ml PM voor reguliere neuron culturen of in NBB27/DMEM voor gezamenlijk culturen </li><li> Passeren de cellen door middel van een 70μm cel zeven </li><li> Count levende cellen </li><li> Ga verder naar de totale culturen, zoals hieronder beschreven of het bord van de cellen voor de reguliere neuron culturen Let op: Bij deze stap, hoogverrijkt neuron culturen kan worden bereikt door uitplating de gedissocieerde cellen op PDL-coating platen op dichtheid van 200 tot 640 cellen / mm 2 afhankelijk van het doel van de experimenten. Na de cellen hebben bevestigd (~ 2-4h), vervangen door medium met warm PM. Als kweken voor langere tijd, op dag 4, vervangt u de helft van het medium met warme CM. Voor zeer gezuiverde neuronale culturen, mitotische inhibitor 5-FDU (eindconcentratie 10 uM) kunnen worden toegevoegd aan DIV2 aan niet-neuronale celproliferatie te remmen (dat wil zeggen, tijdens DIV2-3). Na herstel in CM voor 2 dagen worden de cellen pols opnieuw behandeld met 5-FDU nog 2 dagen (DIV 6-7), gevolgd door een volledig medium te veranderen. Daarna vervang de helft van het medium met verse, warme CM om de 3-4 dagen. Neuronen zijn haalbaar voor maximaal 4 weken. </li></ol> Aggregaten voorbereiding en plating <ol><li> Suspend gedissocieerde cellen in NBB27/DMEM medium dat 1x Sato, 10ng/ml CNTF en 10μM forskoline bij een dichtheid van 2x10 6 cellen / ml </li><li> Overdracht 2 ml celsuspensie in elk putje van een ongecoate 6-wells plaat </li><li> Cultuur voor 3 nachten. Elke dag, zachtjes resuspendeer de cellen een keer met behulp van een P1000 Pipetman Noot: Cellen begin tot aggregaten (figuur 1) te vormen. </li><li> Op de dag voor aggregaat plating, coat plaat / dekglaasjes met Matrigel: <ul><li> Verdunnen voorraad Matrigel (groeifactor gereduceerd, BD Biosciences 354230) 1:20 met koud DMEM op het ijs Let op: Matrigel aliquots moeten bereid zijn per fabrikant protocol. Alle tips, moet Eppendorf buizen en oplossingen voor het maken van fracties van de voorraad worden koud om Matrigel polymerisatie te voorkomen. Hoeveelheden van Matrigel worden bewaard bij -80 ° C en ontdooid bij 4 ° C. </li><li> Coat eerder PDL-beklede dekglaasjes met 300μl/well van de verdunde oplossing Matrigel &#39;s nachts in een 37 ° C incubator </li><li> Wassen met warm PBS, daarna wassen plaat met warm steriele DDH 2 O en laat de platen in de incubator. </li></ul></li><li> 3 dagen na de totale formatie, opnieuw voorzichtig resuspendeer cellen en zeef de suspensie door middel van een 200μm maas in een 50 ml Falcon buis. Laat aggregaten naar de bodem van de buis af te wikkelen door de zwaartekracht (~ 3-5min) </li><li> Verwijder voorzichtig supernatant </li><li> Voeg medium, zacht resuspendeer de aggregaten en laat ze weer af te wikkelen. Herhaal deze procedure een paar keer om de dode cellen, individuele cellen en vuil te verwijderen. Gebruik microscoop om te controleren of het supernatant nog niet-geaggregeerde cellen en debri bevattens </li><li> Voorzichtig resuspendeer de aggregaten in dezelfde NBB27/DMEM medium (figuur 1) en tel aggregaten </li><li> Pas de dichtheid van de aggregaten naar ongeveer 25-30 aggreggats/50ul </li><li> Transfer porties (500-1000μl) van de totale suspensie 2 ml Eppendorf buizen voor plating Opmerking: Aangezien aggregaten hebben de neiging om neer te strijken op de bodem van de buizen, is het cruciaal om meerdere buizen van de totale ophanging te maken voor plating. Voorzichtig resuspendeer de aggregaten vaak nog voordat het zaaien ze op beklede dekglaasjes of cultuur platen vergelijkbaar aantal aggregaten uitgeplaat op elk dekglaasje te verzekeren. </li><li> Haal de cultuur plaat met Matrigel-gecoate dekglaasjes van incubator. Verwijder de oplossing van elk putje, was de dekglaasjes met warme PBS en DDH 2 O, en dan droog kort. Ze zijn nu klaar voor de totale zaaien </li><li> Omgekeerde een buis met aggregaat schorsing zodat ze gelijkmatig worden verdeeld voordat zaaien. Belasting 50μl van de totale suspensie in het midden van elke dekglaasje, en voorzichtig weer de plaat incubator zonder verdere verstoring te laten aggregaten gelijkmatig hechten aan de dekglaasje Opmerking: De dichtheid van aggregaten is van cruciaal belang. Als aggregaten zijn gezaaid te dicht bij elkaar of als het zaaien dichtheid is hoog, ze lijken over te gaan samen als ze groeien. </li><li> Voeg extra DMEM/NBB27medium (500 pl) aan elke well 4-6 uur later of vroeg de volgende ochtend </li><li> Handhaving van de totale cultuur, half verandering het medium om de 3-4 dagen. Bij het veranderen medium, wees niet te verstoren en de aggregaten dit wordt gedaan door voorzichtig toe te voegen medium langs de zijwand van de put. Let op: Enkele uren na de aggregaten aan de plaat, neurietuitgroei van de aggregaten kunnen worden waargenomen. Axonen groeien snel in de eerste twee weken en vormen overvloedig verbindingen tussen aggregaten (figuur 2). Gliale voorouders radiaal migreren uit de aggregaten en differentiëren loop van de tijd in de astrocyten en volwassen oligodendrocyten. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1304/1304fig1.jpg" alt="figuur 1" /> Figuur 1. Fase contrastrijke beelden van cellen vormen van aggregaten bij verschillende dag-en aggregaten na het wassen. <img src="/files/ftp_upload/1304/1304fig2.jpg" alt="figuur 2" /> Figuur 2. Fase contrastrijke beelden van een aggregaat cultuur 2 en 12 dagen na gezaaid op Matrigel-gecoate dekglaasjes.

<ol><li>Matthieu, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+in+rat+brain+aggregating+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Myelination in rat brain aggregating cell cultures.</a> Neuroscience. 3, 565-56 (1978).</li>
<li>Chen, Y. ing <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+rat+and+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> Nat. Protocols. 2, 1044-10 (2007).</li>
<li>Watkins, T. A., Emery, B., Mulinyawe, S., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+stages+of+myelination+regulated+by+gamma-secretase+and+astrocytes+in+a+rapidly+myelinating+CNS+coculture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Distinct stages of myelination regulated by gamma-secretase and astrocytes in a rapidly myelinating CNS coculture system.</a> Neuron. 60, 555-55 (2008).</li>
<li>Svenningsen, A. F., Shan, W. ei-S. ong, Colman, D. avidR., Pedraza, L. iliana <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+method+for+culturing+embryonic+neuron-glial+cell+cocultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Rapid method for culturing embryonic neuron-glial cell cocultures.</a> Journal of Neuroscience Research. 72, 565-56 (2003).</li>
</ol>

Vroege studies de vorming van synapsen en volwassen myeline in rotatie-gemedieerde vrij zwevende aggregaat culturen 1. De CNS totale cultuur beschreven systeem hier een combinatie van serum-vrij groei van multipotente progenitorcellen in drie dimensionale aggregaten met het gemak van de traditionele 2D-culturen om analyses van cel-ontwikkeling, migratie en differentiatie in vitro te vergemakkelijken. Het systeem kan worden aangepast en gebruikt voor neurale voorloper cel-onderzoek en voor on...

voorbereiding van de rat brain aggregate cultures for neuron en glia development studies

Preparation of Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron and Glia Development Studies

Een in vitro systeem dat recapituleert de ontwikkeling en differentiatie van voorlopers tot rijpe neuronen en glia in het centrale zenuwstelsel (CZS), zou een krachtig platform voor neurowetenschappers aan Axo-gliale interacties, eigenschappen en differentiatie van multipotente voorlopercellen, en de progressie van oligodendrogliale onderzoeken lijn cellen op cellulair en moleculair niveau. We beschrijven hier een CNS aggregaat cultuur systeem van embryonale rat forebrains, die kan worden gehandhaafd in een serum-vrij medium tot 3-4 weken en wordt in ons laboratorium als een model om neuron-glia interactie en CNS myelinisatie te bestuderen. Deze video clip zal tonen hoe te isoleren en deze CNS geaggregeerde culturen groeien van E16 rat hersenen. Bovendien, uit dezelfde hersenen dissectie, kan hoogverrijkt regelmatig los neuronale culturen gemakkelijk worden verkregen en gebruikt voor diverse studies over CNS neuronen of gebruikt worden voor co-culturen met andere cellen.

Een protocollen voor een embryonale hersenen van de rat totale cultuur-systeem is beschreven. Multipotente voorlopercellen in de aggregaten kunnen ontwikkelen en differentiëren tot neuronen, astrocyten en oligodendrocyten.

Voorbereiding van de Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron en Glia Development Studies

Een in vitro-systeem dat de ontwikkeling en differentiatie van progenitorcellen tot mature neuronen en glia in het centrale zenuwstelsel (CZS) nabootst ...

Wij introduceren een systeem voor het kweken van CNS-neuroprogenitoren terwijl zij zich ontwikkelen en differentiëren tot mature neuronen en glia. De procedure begint met het isoleren van vier hersenen van E 16 rat-foetussen en het verteren ervan met propane. De weefsels worden omgezet in een single-cell suspensie, gefiltreerd, geteld en verdeeld over een zes.Cellen in de weidplaat worden één keer per dag gedurende twee tot drie dagen voorzichtig geresuspendeerd om de vorming van aggregaten mogelijk te maken. De aggregaten worden vervolgens verzameld en gezeefd door een mesh van 200 micrometer, waarbij kleine klonters en celresten door wassing worden verwijderd. Ten slotte worden de aggregaten geteld en geplaatst op met matrigel gecoate dekglasjes.Hoi, ik ben Coto van het laboratorium van Dr. John L van de afdeling Veterinary Integrated Biosciences aan de Texas A&M University. Vandaag tonen we u een procedure voor hersenaggregatenkweken. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om endocyt-lijnen, celontwikkeling en cellulaire interacties te bestuderen.Laten we beginnen. Zorg dat u vóór aanvang de volgende zaken op de werkbank klaar heeft staan: steriele instrumenten, 70% ethanol, een absorberende onderlegger om op te werken en petri-schalen van 10 centimeter met dissectiemedium op ijs.Bereid in de zuinetkast een dissectiemicroscoop voor met een ijsplatform en verschillende schaaltjes van 10 centimeter met dissectiemedium, eveneens op ijs. Maak tot slot de oplossingen die u zult gebruiken en warm het plaatmedium op tot 37 °C in een waterbad. U begint dit protocol met het oogsten van embryo's op embryonale dag 16 (E16) van een Sprague Dawley-rat.Euthanaseer eerst een drachtig vrouwelijk dier volgens een procedure die is goedgekeurd door de commissie voor dierexperimenten van uw instelling. Leg de geëuthanaseerde rat op een absorberende onderlegger en bespuit de buik met alcohol om deze te reinigen. Gebruik vervolgens een pincet om de huid van de buik samen te knijpen en knip met de andere hand met een schaar alleen door de huid; spreid de huid open en gebruik een andere set gesteriliseerde pincetten en een schaar om door de spierlaag heen te knippen.Verwijder vervolgens de uterus en plaats deze in een schaal van 10 centimeter met ijskoud dissectiemedium. De volgende stap vindt plaats in de zuivkap met behulp van microsdissectiescharen. Verwijder voorzichtig elke embryo uit de uterus.Nu is het tijd om de oogst te starten. Werk met de embryonale hersenen. Oogst de hersenen van elk embryo en plaats de vrijgemaakte hersenen in een schone schaal van 10 centimeter met dissectiemedium op een ijsplatform. Voltooi de dissectie van de hersenen onder de dissectiemicroscoop.Verwijder de secties van de middenhersenen en de achterhersenen. Gebruik een fijne pincet om de menes te verwijderen en breng het resterende deel van de voorhersenen over naar een Falcon-buis van 50 milliliter met dissectiemedium. Het weefsel is nu gereed voor de volgende stap.Dissociatie van cellen door enzymatische digestie. Vlak voordat u klaar bent om de digestie te starten, maakt u verse oplossingen van propaan en trypsineremmerfilter. Steriliseer deze en warm ze op tot 37 °C in een waterbad.Verwijder het overtollige medium uit de gedisseceerde hersenen. Voeg vervolgens vier milliliter van de bereide propaan-digestieoplossing toe aan uw buis van 50 milliliter. Incubeer de buis in een waterbad van 37 °C gedurende precies vijf minuten.Wanneer de tijd is verstreken, gebruik dan een pipet om de propaanoplossing te verwijderen. Voeg vervolgens vijf milliliter vers bereide trypsineremmeroplossing toe en plaats de buis nog twee tot drie minuten terug in het waterbad van 37 °C. Wanneer de tijd is verstreken, wordt de trypsineremmeroplossing verwijderd.Herhaal de incubatie met de trypsine-remmingsoplossing nog drie keer. Nadat u de trypsine-remmingsoplossing voor de laatste keer heeft verwijderd, voegt u 20 milliliters voorverwarmd plaatmedium (pm) toe aan uw buis.Nu is het tijd om uw cellen te resuspenderen en te wassen. Resuspendeer de cellen met een pipet van 10 milliliter ongeveer 20 tot 30 keer, totdat alle klontjes zijn verdwenen. Centrifugeer ze vervolgens gedurende zeven minuten bij 100 ×g.Op dit punt moeten uw cellen goed van elkaar gescheiden zijn. Verwijder na zeven minuten het supernatant en resuspendeer de pellet in 10 milliliter platingmedium om de cellen te wassen.Centrifugeer ze vervolgens opnieuw. Verwijder het supernatant en herhaal het wassen en centrifugeren. Stap na de tweede wasbeurt.Resuspendeer de pellet in 10 milliliter aggregaatcultuurmedium en breng de cellen door een cellzeef van 70 micrometer. Tel tot slot de levende cellen met behulp van een hemocytometer.Nu bent u klaar om de gedissocieerde hersencellen aggregaten te laten vormen. Suspendeer na het tellen de gedissocieerde cellen in aggregaatkweekmedium bij een dichtheid van 2 x 10⁶ cellen per milliliter. Breng twee milliliter van de cel-suspensie over in elke put van een ongecoate zes-puts kweekplaat.Resuspendeer de cellen gedurende drie nachten elke dag voorzichtig. Wanneer een P 1000 pipette wordt gebruikt, zullen de cellen op de dag van het uitplaten van de aggregaten aggregaten beginnen te vormen. Nadat de cellen drie nachten zijn gegroeid, resuspendeer de cellen opnieuw voorzichtig en breng de suspensie via een 200 micrometer mesh over in een 50 milliliter falcon tube.Laat de aggregaten gedurende ongeveer drie tot vijf minuten naar de bodem van de buis bezinken. Verwijder vervolgens voorzichtig het supernatant, voeg medium toe, resuspendeer de aggregaten voorzichtig en laat ze opnieuw bezinken. Herhaal deze procedure meerdere keren.Om dode cellen, individuele cellen en debris te verwijderen, gebruikt u de microscoop om te controleren of de supernatten nog steeds niet-geaggregeerde cellen en debris bevatten. Zodra u de aggregaten grondig heeft gewassen, resuspendeert u ze voorzichtig in hetzelfde medium en telt u de aggregaten om hun concentratie te bepalen. Pas vervolgens de dichtheid van de aggregaten aan naar ongeveer 25 tot 30 aggregaten per 50 microliters.Nu is het tijd om de dekglasjes met aggregaten te zaaien. Breng aliquoten van 1000 µL van de aggregaatsuspensie over naar twee milliliter eend Dwarf-buisjes; aangezien aggregaten hebben de neiging om naar de bodem van de buisjes te zinken, is het cruciaal om meerdere buisjes met de aggregaatsuspensie te maken voor het uitplaten. De dekglasjes die in deze stap worden gebruikt, zijn gecoat met een celcultuursubstraat, matrigel, door een incubatie van een nacht bij 37 °C.Nadat u de aliquoten van de aggregaatsuspensie heeft gemaakt, haalt u de kweekplaat met de Matrigel-gecoate dekglasjes uit de incubator. Verwijder de oplossing uit elke put. Was de dekglasjes met warme PBS en vervolgens met DD H2O.Ze zijn nu klaar voor het zaaien van aggregaten om het dekglas met aggregaten te bezaaien. Keer de buis met de aggregaatsuspensie om om de aggregaten te mengen en gelijkmatig te verspreiden. Breng vervolgens 50 µL van de aggregaatsuspensie aan in het midden van elk dekglas.Plaats de plaat voorzichtig terug in de incubator zonder verdere verstoring, zodat de aggregaten gelijkmatig aan het dekglas kunnen hechten. De dichtheid van de aggregaten is cruciaal; als aggregaten te dicht bij elkaar staan of als de hechtingsdichtheid te hoog is, neigen ze samen te smelten terwijl ze groeien vier tot zes uur na de initiële hechting. Voeg 500 µL cultuurmedium toe aan elke put.Om de aggregaatkweek in stand te houden, wordt het medium elke drie tot vier dagen voor de helft ververst. Voeg het medium bij het verversen langs de wand van de put toe om te voorkomen dat de aggregaten worden verstoord. Een paar uur nadat de aggregaten zich aan het dekglas hebben gehecht, kan uitgroei vanuit de aggregaten worden waargenomen.Axonen groeien snel in de eerste twee weken en vormen overvloedige verbindingen tussen de aggregaten. Ggl-progenitoren migreren radiaal vanuit de aggregaten en differentiëren na verloop van tijd tot astrocyten en mature oligodendrocyten. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u CS-aggregaten kunt cultiveren.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om op de juiste capaciteit te quoten en het aggregaat gelijkmatig te verdelen. Dat is alles.Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experiment.

preparation-rat-brain-aggregate-cultures-for-neuron-glia-development

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier hebben we een protocol voor het kweken van rat corticale neuronen in de aanwezigheid van een gliale feeder-laag. De gekweekte neuronen tot stand polariteit en creëren synapsen, en kan gescheiden worden van de glia voor gebruik in diverse toepassingen, zoals electrofysiologie, calcium imaging, overleving van de cel assays, immunocytochemie, en RNA / DNA / eiwit isolatie.

Bilaminar Co-cultuur van primaire Rat corticale neuronen en Glia

Het isoleren van primaire microglia van de cellulaire heterogeniteit van de hersenen is essentieel om hun rol te onderzoeken in zowel fysiologische en pathologische omstandigheden. Dit protocol beschrijft een mechanische isolatie en gemengde celkweek techniek die hoge opbrengst en een hoge zuiverheid, levensvatbare primaire microgliale cellen...

Primaire Microglia Isolatie van Mixed gliale celculturen van neonatale rat hersenweefsel

We beschrijven een snelle methode voor het isoleren en cultuur hippocampus en corticale neuronen van knaagdieren embryo's. Dit protocol stelt ons in staat uit te voeren experimenten waarbij bijna zuivere neuronale culturen zijn vereist.

Isolatie en Cultuur van Rat Embryonale neurale cellen: een Quick-protocol

This video demonstrates a technique to establish a three-dimensional culture of glial cells. Rat-brain-derived glial cells are encapsulated within a photocrosslinkable polymer matrix containing extracellular matrix components. Upon incubating in a growth medium, the glial cells proliferate within the supporting matrix to create a three-dimensional culture.

Establishing a Three-Dimensional Culture of Rat Brain-Derived Glial Cells

Het doel van deze studie was om de reproduceerbaarheid van een in vitro BBB model met een syngene ratten co-kweek van endotheelcellen en astrocyten valideren. De endotheelcellen monolaag gepresenteerd hoge TEER en lage LY permeabiliteit. Expressie van specifieke eiwitten TJ, functionele reacties op ontstekingen en functionaliteit van vervoerders en receptoren werden beoordeeld.

Oprichting van een<em&gt; In Vitro</em&gt; Model van Rat bloed-hersenbarrière (BBB): een focus op BBB Ondoordringbaarheid en receptor-gemedieerd transport

We beschrijven procedures voor etikettering en genotypering pasgeboren muizen en het genereren van primaire neuronale kweken van hen. De genotypering is snel, efficiënt en betrouwbaar, en maakt geautomatiseerde nucleïnezuur extractie. Dit is vooral handig neonataal dodelijke muizen en culturen die voorafgaande afronding genotyperen vereisen.

Snelle Genotypering van dieren Gevolgd door Vaststelling Primaire culturen van neuronen in de hersenen

Een protocol om een co-cultuursysteem te genereren dat bestaat uit neuronen afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's), primaire corticale neuronen en astrocyten wordt beschreven. Dit co-cultuursysteem maakt detectie mogelijk van de vorming van synaptische contacten en circuits tussen nieuwe, iPSC-afgeleide neuronen en reeds bestaande corticale neuronen die channelrhodopsine-2 tot expressie brengen.

Een optogenetische Aanpak voor het beoordelen van de vorming van neuronale verbindingen in een co-cultuur systeem

We wijzigen en implementeren van een eerder gepubliceerd protocol beschrijft de snelle, reproduceerbare en efficiënte differentiatie van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) in prikkelende corticale neuronen 12. Specifiek onze modificatie maakt regeling van neuronale celdichtheid en gebruik op micro-electrode arrays elektrofysiologische eigenschappen op netwerkniveau meten.

Rapid neuronale differentiatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen voor het meten van het netwerk activiteit op micro-electrode arrays

Dit artikel beschrijft het protocol voor het kweken van lage dichtheid primaire hippocampale neuronen groeien op dekglaasjes omgedraaid naar een gliale monolaag. Het neuron en gliale lagen worden gescheiden door paraffinewas kralen. De neuronen gekweekt volgens deze methode geschikt voor hoge-resolutie optische beeldvorming en functionele assays.

Low-Density primaire hippocampus Neuron Cultuur

Dit artikel beschrijft de isolatie en het kweken van embryonale rat sympathische neuronen van de superieure cervicale ganglia. Het biedt ook gedetailleerde protocollen voor immunocytochemische kleuring en voor de voorbereiding van neuronale extracten voor massaspectrometrische analyse.

Culturing Rat Sympathische Neuronen van Embryonale Superior Cervicale Ganglia voor morfologische en proteomische analyse

Hier presenteren we een eenvoudige aanpak met behulp van specifieke cultuurmedia die de oprichting van neuron- en astrocytenverrijkte culturen, of neuron-glia culturen uit de embryonale cortex, met hoge opbrengst en reproduceerbaarheid mogelijk maakt.

Een cel cultuur model voor het bestuderen van de rol van Neuron-Glia Interacties in Ischemie

Leer een betrouwbaar protocol voor het kweken van embryonale rattenhersenaggregaten. Deze methode maakt differentiatie naar neuronen, astrocyten en oligodendrocyten mogelijk voor neurowetenschappelijk onderzoek.

Voorbereiding van de Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron en Glia Development Studies

Meer video's verkennen