Name: Imaging exocytose in het netvlies bipolaire cellen met TIRF Microscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-09T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: Leer exocytose van synaptische blaasjes visualiseren in netvliesbipolaire cellen van goudvissen met TIRF-microscopie. Deze methode onthult dynamiek van neurotransmittervrijgave in neuronen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door NIH Grant EY 14.990.

Deel 1: Dissection en bipolaire celisolatie <ol><li> Bereid oplossingen opgenomen in tabel 2; De pH van Ringers &#39;(extern) oplossingen moeten worden aangepast aan de 7.4 met NaOH en de pH van de interne oplossing dient te worden aangepast tot 7,2 met CsOH. Bescherm de interne oplossing tegen licht af met aluminiumfolie en houd het bij 4 ° C tot gebruik; </li><li> Dark-aan te passen een goudvis minstens 30 minuten voor dissectie; </li><li> Terwijl het dier donker past, voor te bereiden 5 ml van de hyaluronidase (type V hyaluronidase, 1100 eenheden / ml in lage Ca 2 + beltoon&#39;s; Sigma, St. Louis, MO) en 10 ml van de L-cysteïne (0,5 mg / ml in lage Ca 2 + Ringer&#39;s) oplossingen en wegen van de papaïne (gevriesdroogd poeder, 40 eenheden / ml; Sigma, St. Louis, MO) voor 5 ml van de spijsvertering oplossing; </li><li> Euthanaseren de goudvis door een snelle onthoofding met chirurgische schaar en vernietigen van de hersenen en het ruggenmerg met een # 11 scalpel; </li><li> Verwijder de ogen door de vernietiging van de extra-oculaire spieren met behulp van een # 7 gebogen Dumont pincet en snijden van de oogzenuw met iris schaar; </li><li> Plaats een oog lamp op een stuk filtreerpapier en prik de sclerale limbus met de punt van een # 11 scalpel; </li><li> Introduceer het blad van een paar van vannas schaar in de lekke geheel en weggesneden het hele voorste segment; </li><li> Leg een klein stukje filtreerpapier op de top van de resterende optische kop en oefenen een zekere druk om het papier nat met glasvocht; </li><li> Til het filter papier met het netvlies die eraan verbonden zijn en snijd de optische zenuw met een par van vannas scharen; </li><li> Plaats het filter met het netvlies in een 35 mm kunststof cultuur schotel met hyaluronidase oplossing en loslaten van het netvlies van het filter papier met behulp van de # 7 Dumont pincet; </li><li> Snijd het netvlies in 4-6 stukken met de helft van een industrieel koolstofstaal single-edged mes en laat het zitten in de hyaluronidase oplossing gedurende 20 minuten; </li><li> Tijdens het wachten voor hyaluronidase door te voeren, voeg 5 ml van de L-cysteïne oplossing voor de papaïne en laat hem gaan zitten totdat de vloeistof transparant (ongeveer 5-10 minuten); </li><li> Was de stukjes netvlies 3x in lage Ca 2 + Ringer&#39;s en laat ze in de papaïne oplossing zitten voor 30-35 minuten; </li><li> Was de stukjes netvlies 3x in lage Ca 2 + Ringer&#39;s en ze tot gebruik op te slaan 4 ° C in een 35 mm plastic cultuur schotel met een lage Ca 2 + Ringer&#39;s; </li><li> Te dissociëren van de cellen, zet een stuk van het netvlies in een microcentrifugebuis met 500 ml van een lage Ca 2 + Ringer&#39;s en langzaam het netvlies vermaal door pipetteren op en neer met een glas dissociatie pipet voorzichtig om geen luchtbellen te produceren. Dissociatie pipetten zijn vervaardigd door het opwarmen van de tip van een glas Pasteur pipet met een bunsenbrander en licht te buigen met behulp van anatomische pincet; </li><li> Het bord van de geïsoleerde cellen door het toevoegen van een daling van de retinale schorsing voor een home-made opname kamer voorheen gevuld met 2 ml van een lage Ca 2 + beltoon&#39;s. De kamer bestaat uit de onderste helft van een 35-mm kunststof cultuur schotel met een ronde geheel in het midden en een cirkelvormige dekglaasje van 1,78 brekingsindex glas (PlanOptik, Duitsland) vastgelijmd aan de bodem met een siliconen elastomeer (Sylgard 184; Dow Corning , Midland, MI). </li></ol> Deel 2: Bipolaire Cel Laden en Wash Out TIRF beeldvorming van synaptische blaasjes het beste uitgevoerd met behulp van een objectieve-type TIRFM microscoop met een zeer hoge NA doelstelling en een gevoelige camera. Voor onze experimenten, kiezen we ervoor om een ​​1,65 NA doelstelling (Apo x100 O HR, NA 1.65, Olympus, Japan) met een EMCCD (Cascade 512B, Roper Scientific, Tucson, AZ) te gebruiken. Het gebruik van de zeer hoge NA doel is het gebruik van hoge refractieve dekglaasjes en onderdompeling vloeistof (di-joodmethaan met zwavel). Onder onze voorwaarden, is het excitatie licht beperkt tot een exponentieel afvallende veld met een lengte constante van ongeveer 50 nm. <ol><li> Voeg een druppel hoge brekingsindex vloeistof (M-serie, brekingsindex = 1,7800, Cargille Labs, Cedar Grove, NJ) om de microscoop doel; </li><li> Zorgvuldig plaats de opname kamer op de top van de microscoop objectief en zorgvuldig te monteren massa-elektrode en superfusie exit pijp kamer; </li><li> Laat kamer op microscoop te zitten gedurende 10-20 minuten, zodat cellen te zinken en naar de bodem kleven; </li><li> In de tussentijd, voor te bereiden 5 ml van een 1 mM trolox ® ((±)- 6-hydroxy-2 ,5,7,8-tetramethylchromane-2-carbonzuur; Sigma, St. Louis, MO) oplossing in een hoge K + Ringer&#39;s . Ultrasone trillingen totdat het is opgelost; </li><li> Bereid 15 ml ADVASEP-7 wassen oplossing: 1 mM ADVASEP-7 (Sigma, St. Louis, MO) in lage Ca 2 + beltoon&#39;s. Merk op dat ADVASEP-7 gebruik is optioneel en kan worden weggelaten indien gewenst; </li><li> Spoel de superfusie lines en voeg ADVASEP-7 wasoplossing, lage Ca 2 + beltoon-en controlesysteem van beltoon aan de superfusie systeem; </li><li> Trek de laden van pipetten van dunwandige borosilicaatglas (Kwik-Fil ® TW150-3, WPI, Sarasota, FL). Puffer pipet weerstanden zijn in de 1,5-2,5 MΩ bereik; </li><li> Bereid de FM1-43 ® (N-(3-triethylammoniumpropyl) -4 - (4 - (dibutylamino) styrylkleurstoffen) pyridinium dibromide, &quot;speciale verpakking&quot;, Invitrogen, Carlsbad, CA) oplossingen. Maak eerst een een mM voorraad door de toevoeging van 160 pi gedestilleerd water tot een flacon (100 mg) van FM1-43 ®. Deze voorraad kan worden gehouden op 4 ° C gedurende maximaal een week. Dan, voeg 5 ul FM1-43 ® tot en met 1 mL hoge K + beltoon&#39;s + 1 mM trolox ®. Bescherm de oplossing tegen licht af met aluminiumfolie en houd het bij 4 ° C tot gebruik; </li><li> Draai de microscoop helderveld licht op en zoek naar intacte bipolaire cellen. Iets tik op de microscoop om ervoor te zorgen dat de neuronen stevig zijn bevestigd aan de bodem van de kamer; </li><li> Plaats de superfusie pen dicht bij de cel van belang en continu de voorbereiding perfuseren met een lage Ca 2 + beltoon&#39;s; </li><li> Schakel verlichting in de kamer en voeg een rode lange pass filter (dat wil zeggen RG630, Schott, Duitsland) om de optische pad naar excitatie van de FM-kleurstof minimum te beperken; </li><li> Vul een laad-pipet met 10 pi van de FM-kleurstof oplossing, monteert u de pipet in de micromanipulator en laat de pipet op de voorbereiding, zonder overdruk tot het op dezelfde focal plane als de bipolaire cel die u wilt laden. Zorg ervoor dat u ten minste twee elektroden houders: de een wordt gebruikt voor de FM-kleurstof kan niet gebruikt worden voor patch klemmen, of anders kan de intracellulaire oplossing verontreinigen; </li><li> Plaats de puffer opening op een afstand van ongeveer 10 micrometer van het axon terminal, schakelt u de superfusie systeem uit en trek de kleurstof oplossing gedurende 10 seconden door het draaien van de pipet overdruk op; </li><li> Schakel de overdruk uit en, zonder het verplaatsen van de pipet, wacht 30 seconden; </li><li> Schakel de superfusie aan en baden de kamer in ADVASEP-7-oplossing gedurende 5 minuten. In de tussentijd, verwijder de puffer pipet uit het bad; </li><li> Na 5 minuten, overschakeling naar een lage Ca 2 + beltoon en perfuseren de kamer voor 25-30 minuten tot het verwijderen van overtollige kleurstof toe te staan. </li></ol> Deel 3: Patch klem-en TIRFM Imaging <ol><li> Terwijl de voorbereiding is het wassen, trek patch pipetten van dikwandige borosilicaatglas (B150-86-10; Sutter Instrument Company, Novato, CA). Patch pipet weerstanden zijn in de 8-10 MΩ bereik; </li><li> Na het wassen is voltooid, plaatst u het axon terminal in het centrum van het gezichtsveld; </li><li> Vul een patch pipet met 7μL van interne oplossing, tikt u op het pipet om zich te ontdoen van luchtbellen, de vacht van de pipet met gesmolten tandartsen (Sticky Wax, Kerr Corporation, Orange, CA) en het monteren in de micromanipulator; </li><li> Zet de pipet overdruk op en langzaam lager de pipet op de voorbereiding. Controleer pipet weerstand in de versterker en de juiste pipet offsets en capaciteit met de respectieve versterker controles; </li><li> Schakel de superfusie te beltoon controle. Voor het maken van een gigaseal tussen de pipet en de cel, licht raakt de punt van de elektrode tegen het cellichaam en zet de pipet overdruk uit terwijl zachtjes het toepassen van negatieve druk op de elektrode; </li><li> Terwijl gesloten, kies &quot;whole cell&quot;-modus in de versterker en zet de cel met potentie tot -60 mV; </li><li> Kies een regio van belang met de imaging-software die de hele axon terminal omvat, draait u de helderveld licht uit en door kort bloot te stellen (30 ms) de terminal naar de 488 nm laser, vinden van de juiste focal plane voor TIRF beeldvorming; </li><li> Breken in de cel met behulp van de &quot;zap&quot;-commando van de versterker, terwijl het toepassen van licht negatieve druk op de pipet; </li><li> Corrigeren voor cel-capaciteit en de serie weerstand, en pas vervolgens de spanning protocol van belang, terwijl de beeldvorming van de beweging van synaptische blaasjes. Het is in deze fase belangrijk om de spanning protocol gesynchroniseerd met de camera frame rate. In ons geval, elk frame is 30 ms lang, dus de spanning veranderingen optreden in veelvouden van deze waarde (dat wil zeggen, elke 300 ms of 10 frames); </li><li> Wacht ten minste 40 seconden tussen de trials te zorgen voor herstel; </li><li> Het controleren van de positie van synaptische linten, foto&#39;s maken terwijl u de 561 nm laser op. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1305/fig1.jpg" alt="figuur 1" /> Figuur 1: De experimentele opstelling. Een 488 nm laser (blauw) is gericht naar de periferie van de rug brandvlak van de objectieve en lijdt totale interne reflectie wanneer zij tot de glas-waterig medium interface. Het elektromagnetische veld gegenereerd door de gereflecteerde bundel prikkelt de fluorofoor geladen in de synaptische blaasjes het dichtst bij de bottOM van de glazen kamer, die vervolgens lichten (groen). De TL-licht wordt vervolgens geleid naar het oog van de waarnemer (afgebeeld) of een CCD-camera. Het membraan potentieel van de verbeelde cellen wordt tegelijkertijd gecontroleerd door patch-klemmen ze. Deze aanpak laat de studie van de relatie tussen de binnenkomende signalen (het membraan spanning) en de neuronale output (exocytose). <img src="/files/ftp_upload/1305/fig2.jpg" alt="figuur 2" /> Figuur 2: Typische gevolgen. Links: helderveld beeld van een geïsoleerde goudvissen bipolaire cel. Rechts boven: TIRF beeld van de synaptische blaasjes in de bipolaire cel axon terminal geladen met FM 1-43 ® en afgebeeld met de 488 nm laser (FM kleurstof). Rechtsonder: beeld van dezelfde terminal na het patchen van de cel en beeldvorming van de axon terminal met de 561 nm laser. Synaptische linten zijn gelabeld door de rhodamine-gebaseerde ribeye-bindende peptide (Rpep_rhod). Tabel 1: Specifieke Reagentia en apparatuur. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Naam </td><td> Type </td><td> Fabrikant </td><td> Catalogus </td><td> Commentaar </td></tr><tr><td> - </td><td> Lucht Tabel </td><td> Newport Corporation </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> IX70 </td><td> Omkeermicroscoop </td><td> Olympus </td><td> - </td><td> Uitgerust met een wolfraam lamp voor helderveld en een zijdelingse opening poort voor TIRF </td></tr><tr><td> TH4-100 </td><td> Lamp Power Source </td><td> Olympus </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> FF498_581-DI01 </td><td> Dichroic Filter </td><td> Semrock </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> NF01-405_488_568 </td><td> Emissie Filter </td><td> Semrock </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Apo x100 O HR </td><td> Objectief </td><td> Olympus </td><td> - </td><td> NA 1,65 </td></tr><tr><td> RG630 </td><td> Rode glasfilter </td><td> Schott </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> 488 nm Laser </td><td> Samenhangend </td><td> - </td><td> Gebruik op minimaal vermogen </td></tr><tr><td> - </td><td> Sluiter </td><td> Uniblitz </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> VMM-D1 </td><td> Sluiter Driver </td><td> Uniblitz </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> 561 nm Laser </td><td> Melles Griot </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> Sluiter </td><td> Uniblitz </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> VMM-D3 </td><td> Sluiter Driver </td><td> Uniblitz </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Perfusiedruk Kit </td><td> Superfusie System </td><td> Automatiseer Wetenschappelijke </td><td> 09-04 </td><td> - </td></tr><tr><td> Perfusie Pen </td><td> Superfusie System </td><td> Automatiseer Wetenschappelijke </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Valvelink 8 </td><td> Superfusie System Controller </td><td> Automatiseer Wetenschappelijke </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Cascade 512B </td><td> EM CCD Camera </td><td> Roper Scientific </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Metamorph 7.1 </td><td> Imaging Software </td><td> Molecular Devices </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> EPC-9 </td><td> Patch Clamp Versterker </td><td> HEKA Elektronik </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Pols </td><td> Versterker Software </td><td> HEKA Elektronik </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> MP-285 </td><td> Micromanipulator </td><td> Sutter Instrument </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> Electrode Holder </td><td> HEKA Elektronik </td><td> - </td><td> Voor 1,5 mm OD glas, 2 stuks </td></tr><tr><td> Kwik-Fil ® TW150-3 </td><td> Borosilicaat Capillaire Glas </td><td> WPI </td><td> - </td><td> Zonder filament </td></tr><tr><td> B150-86-10 </td><td> Borosilicaat Capillaire Glas </td><td> Sutter Instrument </td><td> - </td><td> Voor gloeilampen en </td></tr><tr><td> P-97 </td><td> Micro-elektrode Puller </td><td> Sutter Instrument </td><td> - </td><td> Uitgerust met 3x3 box filament en milieu-kamer </td></tr><tr><td> - </td><td> Druk Vacuüm Air Pump </td><td> Thomas Wetenschappelijke </td><td> 7893B05 </td><td> Maakt vacuüm om vloeistoffen te verwijderen uit kamer-en overdruk voor pipetten </td></tr><tr><td> MatLab R2008a </td><td> Analyse Software </td><td> MathWorks </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> 353001 </td><td> 35 mm Plastic Cultuur Dishes </td><td> Valk </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> High Refractive Index Glass </td><td> PlanOptik </td><td> - </td><td> Brekingsindex 488 nm = 1,78 </td></tr><tr><td> Serie M </td><td> High Refractive Index Liquid </td><td> Cargille Labs </td><td> - </td><td> Brekingsindex = 1,78 </td></tr><tr><td> Sylgard 184 </td><td> Silicium Elastomeer Kit </td><td> Dow Corning </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Glutathion </td><td> Tripeptide </td><td> Merck Chemicals </td><td></td><td> Gratis Radical scavenger </td></tr><tr><td> Hyaluronidase </td><td> Enzym </td><td> Sigma </td><td> H6254 </td><td> Type V </td></tr><tr><td> L-cysteïne </td><td> Amino Acid </td><td> Fluka </td><td> 30090 </td><td> Activeert papaïne </td></tr><tr><td> Papaïne </td><td> Enzym </td><td> Fluka </td><td> 76220 </td><td> Van Carica papaya </td></tr><tr><td> Trolox ® </td><td> Oplosbare vitamine E </td><td> Sigma </td><td> 56510 </td><td> Vrije radicalen </td></tr><tr><td> ADVASEP-7 </td><td> Gesulfoneerde B-cyclodextrinederivaat </td><td> Sigma </td><td> A3723 </td><td> Vermindert FM 1-43 ® achtergrond fluorescentie </td></tr><tr><td> FM 1-43 ® </td><td> Fluorescerende kleurstof </td><td> Invitrogen </td><td> T35356 </td><td> &quot;Speciale verpakking&quot; </td></tr><tr><td> Sticky Wax </td><td> Pipet Coating Agent </td><td> Kerr Corporation </td><td> - </td><td> Verlaagt pipet capaciteit </td></tr></tbody></table> Tabel 2: fysiologische oplossingen gebruikt in deze studie. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Stof </td><td> Lage Ca 2 + Ringer&#39;s </td><td> Controle Ringer&#39;s </td><td> Hoge K + Ringer&#39;s </td><td> Interne oplossing </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 120 mM </td><td> 120 mM </td><td> 97,5 mM </td><td> - </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 2.5 mM </td><td> 2.5 mM </td><td> 25 mM </td><td> - </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 1 mM </td><td> 1 mM </td><td> 1 mM </td><td> 4 mM </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 0.5 mM </td><td> 2.5 mM </td><td> 2.5 mM </td><td> - </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 0,75 mM </td><td> - </td><td> - </td><td> 0.5 mM </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Glutathion </td><td> 2 mM </td><td> 2 mM </td><td> - </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> CH 3 CSO 3 S * </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 100 mM </td></tr><tr><td> TEACl </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> ATP-Mg </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> GTP-Li </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> Rpep-Rhod ** </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> Volume </td><td> 200 ml </td><td> 100 ml </td><td> 5 microliter </td><td> 100 ul </td></tr></tbody></table> * Cesium methaansulfonaat. ** Ribeye-bindend peptide: rhodamine + EQTVPVDLSVARDR-COOH (mw 1.997,75).

<ol><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology.</a> Traffic. 2, 764-774 (2001).</li>
<li>Zenisek, D., Steyer, J. A., Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport%2C+capture+and+exocytosis+of+single+synaptic+vesicles+at+active+zones%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transport, capture and exocytosis of single synaptic vesicles at active zones.</a> Nature. 406, 849-854 (2000).</li>
<li>Zenisek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+association+and+exocytosis+at+ribbon+and+extraribbon+sites+in+retinal+bipolar+cell+presynaptic+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Vesicle association and exocytosis at ribbon and extraribbon sites in retinal bipolar cell presynaptic terminals.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 4922-4927 (2008).</li>
<li>Zenisek, D., Horst, N. K., Merrifield, C., Sterling, P., Matthews, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+synaptic+ribbons+in+the+living+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Visualizing synaptic ribbons in the living cell.</a> J. Neurosci. 24, 9752-9759 (2004).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+imaging+of+surface+fluorescence+with+very+high+aperture+microscope+objectives%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives.</a> J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).</li>
<li>Rouze, N. C., Schwartz, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continous+and+transient+vesicle+cycling+at+a+ribbon+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Continous and transient vesicle cycling at a ribbon synapse.</a> J. Neurosci. 18, 8614-8624 (1998).</li>
</ol>

De voordelen van objectieve-type TIRF microscopie zijn dat 1) het uitstekende optische sectie biedt door het beperken van excitatie licht naar een smal gebied in het brandvlak van de doelstelling, waardoor het minimaliseren van out-of-focus licht, 2) omdat het licht daalt exponentieel met de afstand kan beweging in een verticale richting worden gevolgd als een verandering in de fluorescentie-intensiteit, 3) efficiënte licht collectie door de hoge numerieke apertuur doel 1,5. Het belangrijkste nadeel van de techniek is dat...

imaging exocytose in het netvlies bipolaire cellen met tirf microscopie

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

Totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie is een techniek die de studie van de gebeurtenissen op het celmembraan kunnen door selectieve beeldvorming van fluorescerende moleculen die het dichtst bij een hoge brekingsindex stof zoals glas<sup&gt; 1</sup&gt;. In dit artikel, passen we deze techniek om de afbeelding exocytose van synaptische blaasjes in retinale bipolaire cellen geïsoleerd uit de goudvis netvlies. Deze neuronen zijn zeer geschikt voor dit soort van onderzoek vanwege hun grote axon terminals. Door het gelijktijdig patch het vastklemmen van de bipolaire cellen, is het mogelijk om de relatie tussen pre-synaptische spanning en synaptische los<sup&gt; 2,3</sup&gt;. Synaptische blaasjes in de bipolaire cel terminals worden geladen met een fluorescerende kleurstof (FM 1-43 ®) door co-puffend de kleurstof en een ringer oplossing met een hoge K<sup&gt; +</sup&gt; De concentratie op de synaptische terminals. Dit depolariseert de cellen en stimuleert endocytose en de daaruit voortvloeiende kleurstof opname in het glutamaat blaasjes. Na het wassen de overtollige kleurstof weg voor ongeveer 30 minuten, cellen zijn er klaar voor zijn patch geklemd en afgebeeld gelijktijdig met een 488 nm laser. De patch pipet oplossing bevat een rhodamine-based peptide dat selectief bindt aan de synaptische lint eiwit ribeye<sup&gt; 4</sup&gt;, Waardoor de etikettering linten in het bijzonder wanneer terminals zijn afgebeeld met een 561 nm laser. Hierdoor kan de precieze lokalisatie van de actieve zones en de scheiding van synaptische van extra-synaptische evenementen.

In deze video laten we zien hoe te labelen en te visualiseren enkele synaptische blaasjes exocytose en handel in goudvissen het netvlies bipolaire cellen met behulp van totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie.

Imaging exocytose in het netvlies bipolaire cellen met TIRF Microscopie

Total internal reflectance fluorescence (TIRF)-microscopie is een techniek waarmee gebeurtenissen aan het celmembraan bestudeerd kunnen worden door selectieve...

Deze procedure begint met de dissectie van de neurale retina van volwassen goudvissen, wat het zenuwweefsel aan de achterzijde van het oog is. Retina's worden gedurende 35 minuten in een enzymatische oplossing geplaatst, gespoeld en met een vuurgepolijste glaspipet behandeld om de cellen te dissociëren. De cellen worden vervolgens geplaatst op glazen dekglasjes met een hoge brekingsindex en gemonteerd in plastic weefselkweekschaaltjes.Geïsoleerde bipolaire cellen worden geïdentificeerd aan hun kenmerkende morfologie van de axonterminals. We puffen gedurende 10 seconden een oplossing met FM 1 43 op de cellen en wachten 30 seconden voordat de kleurstof wordt weggewassen. Na een wasbeurt van 30 minuten worden de cellen via patch-clamp gefixeerd en gebeeld met TIRF-microscopie.Hoi, mijn naam is Christina Jovi van het ZEC Lab van de afdeling Cellulaire en Moleculaire Fysiologie aan de Yale University School of Medicine. Vandaag laten we u een procedure zien om exocytose in levende bipolaire cellen van het netvlies te bestuderen met behulp van turf-microscopie. We gebruiken deze procedure in het laboratorium om mechanismen van synaptische afgifte te bestuderen.Laten we beginnen. Laat een goudvis eerst gedurende ten minste 30 minuten donker adapteren vóór de dissectie. Plaats na onthoofding en verwijdering van het oog één oogbol op een stuk filterpapier en gebruik de punt van een scalpelmes nummer 11 om de scleraal limbus door te prikken. In het doorgeprikte gat.Gebruik een paar bonna-scharen om het gehele anterieure segment weg te knippen. Plaats vervolgens een klein stukje filterpapier op de resterende optische beker en oefen hierop enige druk uit. Om het glasvocht op te nemen, tilt u het filterpapier met de vastgehechte retina op en knipt u de oogzenuw door met een paar VNA-scharen.Plaats het filterpapier met het netvlies in een plastic kweekschaal van 35 millimeter die gevuld is met een high-alur-oplossing en gebruik Dumont-pincetten nummer zeven om het netvlies van het filterpapier af te pellen. Snijd vervolgens het netvlies met een half industrial carbon steel enkelzijdig lemmet in vier tot zes stukken en laat deze 20 minuten in de hyaluronidase-oplossing rusten. Terwijl er gewacht wordt tot de hyaluronidase is ingewerkt, voegt u vijf milliliter L-cysteïne-oplossing toe aan de papaïne en laat dit ongeveer vijf tot 10 minuten staan totdat de vloeistof transparant wordt. Was de stukken netvlies drie keer in een low-calcium Ringer-oplossing en laat ze 30 tot 35 minuten in de papaïne-oplossing rusten.Was de retinafragmenten drie keer na een incubatie van 35 minuten in de papaïnesolutie. Breng de fragmenten over naar een plastic kweekschaaltje van 35 millimeter met calciumarme Ringers-oplossing en bewaar het schaaltje bij 12 tot 14 °C totdat u klaar bent om met de dissociatie van de cellen te beginnen.Stel eerst een dissociatiepipet op door de punt van een glazen Pasteurpipet te verhitten met een bunsenbrander en deze vervolgens met een anatomisch pincet lichtjes te buigen. Plaats een stuk retina in een microcentrifugebuis met calciumarme Ringer-oplossing en disсоcieer de retina langzaam door deze voorzichtig op en neer te pipetteren met de vervaardigde dissociatiepipet. Breng de geïsoleerde cellen over naar een zelfgemaakte registratiekamer gevuld met calciumarme Ringer-oplossing door een druppel van de retinalsuspensie toe te voegen, waarbij u er nauwkeurig op let dat er geen luchtbellen ontstaan.De kamer bestaat uit de onderste helft van een plastic cultuurschaal van 35 millimeter met een cirkelvormig gat in het midden en een circulair dekglas van glas met een brekingsindex van 1,78 dat aan de bodem is gelijmd. Nu de dissectie en isolatie van de bipolaire cellen voltooid zijn, kunnen we beginnen met het laden en uitwassen van de bipolaire cellen. Voor dit experiment is het raadzaam om een total internal reflectance fluorescentiemicroscoop van het objectivetype te gebruiken, voorzien van een objectief met een zeer hoge numerieke apertuur en een gevoelige camera.In deze video maken we gebruik van een objectief met een numerieke apertuur van 1,65 en een electron multiplying charge coupled device. Begin met het toevoegen van een druppel vloeistof met een hoge brekingsindex aan het microscoopobjectief. Plaats de opnamekamer bovenop het microscoopobjectief.Bevestig de randaarde-elektrode en de uitlaatpijp voor superfusie zorgvuldig aan de kamer. Laat de kamer 10 tot 20 minuten op de microscoop staan, zodat de cellen kunnen bezinken en hechten aan de bodem. Spoel vervolgens de superfusielijnen door en voeg wasoplossing toe.Voeg calciumarme ringer-oplossing en controle ringer-oplossing toe aan het superfusiesysteem. Schakel het brightfield-licht van de microscoop in en zoek naar intacte bipolaire cellen. Tik voorzichtig tegen de microscoop om er zeker van te zijn dat de neuronen stevig aan de bodem van de kamer zijn gehecht.Positioneer de superfusiepen dicht bij een intacte cel en perfuseer het preparaat continu met een ringeroplossing met een laag calciumgehalte. Doof vervolgens de lichten in de kamer en voeg een rood long-pass filter toe aan het optische pad om excitatie van de fluorescerende kleurstof te minimaliseren. Vul een laadpipet met 10 µL fluorescerende kleurstofoplossing.Plaats het in de micromanipulator en laat het vervolgens op de preparaat zakken zonder de overdrukoptie te gebruiken, totdat het zich in hetzelfde brandvlak bevindt als de geselecteerde bilariscel. Positioneer de puff-opening op een afstand van ongeveer 10 micrometers van het axonale uiteinde. Schakel het superfusiesysteem uit en puff de kleurstofoplossing gedurende 10 seconden door de overdruk van de pipet in te schakelen.Zet nu de overdruk uit en wacht 30 seconden zonder de pipet te bewegen. Zet vervolgens het superfusiesysteem aan en spoel de kamer vijf minuten lang met wasoplossing. Verwijder ondertussen de pufferpipet uit het bad.Schakel het SUPERFUSION-systeem na vijf minuten over op een ringeroplossing met een laag calciumgehalte en perfuseer gedurende 25 tot 30 minuten om het overtollige kleurmiddel te verwijderen. Zodra het laden en uitwassen van de bipolaire cellen is voltooid, kunnen we beginnen met de patchklemtechniek en T-I-R-F-M imaging. Vervang na voltooiing van het uitwassen de elektrodehouders om contaminatie van de patchpipet met kleurmiddel te voorkomen.Plaats de axonterminal in het midden van het gezichtsveld. Vul een patchpipet met zeven microliter interne oplossing. Tik de pipet aan om luchtbellen te verwijderen.Bedek het met gesmolten tandheelkundige was en bevestig het vervolgens in de micromanipulator. Zet de overdruk van de pipet aan en laat de pipet langzaam op de preparatie zakken. Controleer de weerstand van de pipet en voer indien nodig correcties uit.Stel vervolgens het superfusiesysteem in op controle-ringeroplossing en creëer een gigaseal tussen de pipet en de cel door de punt van de elektrode lichtjes tegen het cellichaam te drukken. Wanneer de overdruk van de pipet is uitgeschakeld, wordt er voorzichtig negatieve druk op de elektrode uitgeoefend terwijl deze is afgesloten. Selecteer de whole-cell modus in de versterker en stel het rustpotentiaal van de cel in op -60 millivolt.Gebruik nu imaging-software om een region of interest te selecteren die het gehele axonterminal omvat. Schakel het veldlicht uit en stel het terminal kort bloot aan de 488 nanometer laser. Bepaal het juiste brandvlak voor TIRF-imaging.Breek vervolgens door het celmembraan door de zap-commando van de versterker te gebruiken, terwijl er een licht negatieve druk op de pipet wordt uitgeoefend om te corrigeren voor de celcapaciteit en de serieweerstand. Pas daarna het voltageprotocol toe terwijl de beweging van synaptische blaasjes wordt gefilmd. Wacht minimaal 40 seconden tussen de trials om herstel mogelijk te maken.Eerst selecteren we een bipolaire cel via lichtmicroscopie. Vervolgens zoomen we in en vullen we de axonterminal van deze cel met een fluorescente kleurstof. Na een wasbeurt van 30 minuten kan de gevulde terminal onder de microscoop worden afgebeeld, samen met de beweging van fluorescente glutamaterge vesikels.Hier introduceren we een rib-eye-bindend peptide via de patchpipet, waardoor we de positie van synaptische linten kunnen zien wanneer deze worden afgebeeld met een 561 nanometer laser. Vervolgens depolariseren we de cellen en beelden we de beweging van blaasjes af met de 488 nanometer laser. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u retinale bipolaire cellen kunt dissociëren, uitplaten en laden met een fluorescerende kleurstof, alsmede hoe u deze neuronen kunt patchen, klemmen en gelijktijdig kunt beelden met TIRF-microscopie.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de cellen niet te lang aan de laser bloot te stellen. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

imaging-exocytosis-in-retinal-bipolar-cells-with-tirf-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschrijven we een protocol voor de bereiding van agar-embedded netvlies plakken die geschikt zijn voor elektrofysiologie en Ca2 + beeldvorming. Deze methode laat toe om te studeren lint-type synapsen in het netvlies microcircuits met behulp van directe patch-clamp opnames van enkele presynaptische zenuwuiteinden.

Patch-clamp capaciteitsmetingen en Ca 2 + Imaging bij Single zenuwuiteinden in het netvlies Slices

De compartimentering van eiwitten, hetzij binnen het plasma membraan of in de intracellulaire locaties is een regulerend mechanisme die sterk kunnen beïnvloeden signalering resultaten, vandaar dat te begrijpen signalering is het van belang het bestuderen van de ruimtelijke en temporele gedrag van de betrokken eiwitten. We beschrijven hier een TIRF microscopie gebaseerde systeem om signaaltransductie in T-cellen te bestuderen, maar is breed toepasbaar.

Een TIRF Microscopie Techniek voor Real-time, gelijktijdige beeldvorming van de TCR en de bijbehorende signaaleiwitten

Source: Daniele, F., et. al TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the imaging of human neuroblastoma cells using a total internal reflection fluorescence (TIRF) microscope to visualize fluorophore-tagged synaptic vesicles. The cells are first focused in epifluorescence mode. Adjustments are then made to achieve total internal reflection,...

Cell Imaging Using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Source: Winkle, C. C., et al. Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for visualizing exocytic events in cortical neurons. A pH-sensitive green fluorescent protein (GFP) marker fluoresces upon vesicle fusion, with selective TIRF excitation capturing membrane-proximal exocytosis in time-lapse imaging.

Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy for Visualization of Exocytic Events 

-Polarisatie gebaseerde Total Internal Reflection Fluorescentie microscopie (pTIRFM) maakt real-time detectie van celmembraan dynamiek. Dit artikel beschrijft de uitvoering van pTIRFM voor de studie van membraan remodeling tijdens gereguleerde exocytose. De techniek is generaliseerbaar naar andere celbiologische processen die veranderingen in de membraan vorm direct of indirect te betrekken.

Imaging Plasma Membraan Vervormingen Met pTIRFM

Clathrine-gemedieerde endocytose, een snel en zeer dynamisch proces, internaliseert veel eiwitten, inclusief signaalreceptoren. Het hier beschreven protocol visualiseert direct de kinetiek van individuele endocytische gebeurtenissen. Dit is essentieel om te begrijpen hoe kernleden van de endocytische machinerie met elkaar coördineren en hoe eiwitlading dit proces beïnvloedt.

Visualiseren Clathrine-gemedieerde endocytose van G-proteïne gekoppelde receptoren bij Single-event resolutie via TIRF Microscopie

Dit artikel beschrijft een methode voor het onderzoeken van de dynamica van neurotransmittervesicles in neuroblastoomcellen, met behulp van een synaptobrevin2-pHluorine construct en Total Internal Reflection Fluorescence Microscopie. De strategie die ontwikkeld is voor beeldverwerking en gegevensanalyse wordt ook gerapporteerd.

TIRFM en pH-gevoelige GFP-sondes naar Neurotransmitter Vesicle Dynamics Evalueer in SH-SY5Y Neuroblastoom Cellen: cell imaging en data-analyse

Hier detail we een methode om levende cellen beeldvorming van gereglementeerde exocytose. Deze methode maakt gebruik van FITC-dextran, die hoopt zich op in lysosoom-gerelateerde organellen, als verslaggever. Deze eenvoudige methode kan ook onderscheid te maken tussen de verschillende modi van gereglementeerde exocytose in cellen die moeilijk zijn te genetisch manipuleren.

Imaging FITC-dextran als verslaggever voor gereglementeerde exocytose

In vivo beeldvorming is een krachtig hulpmiddel voor de studie van biologie in gezondheid en ziekte. Dit protocol beschrijft transpupillaire beeldvorming van het netvlies van de muis met een standaard microscoop met twee fotonen. Het demonstreert ook verschillende in vivoimaging-methoden om fluorescerend meerdere cellulaire cohorten van het netvlies te labelen.

Transpupillaire twee-fotonen in vivo beeldvorming van het netvlies van de muis

Dit werk presenteert een alternatief flatmount retina-preparaat waarbij de verwijdering van fotoreceptorcellichamen een snellere verspreiding van antilichamen en verbeterde patchpipettoegang tot binnenste retinale neuronen mogelijk maakt voor immunohistochemie, in situ hybridisatie en elektrofysiologische experimenten.

Split Retina als een verbeterde flatmount-voorbereiding voor het bestuderen van neuronen in de binnenste nucleaire laag in het netvlies van gewervelde dieren

Dit artikel demonstreert een methode om microglia-motiliteit en contact met postsynaptische puncta in het netvlies te visualiseren en te kwantificeren met behulp van spinning disk confocale microscopie.

Live beeldvorming en karakterisering van microglia-dynamica en interacties met synapsen in een zieke muisnetvlies

Leer exocytose van synaptische blaasjes visualiseren in netvliesbipolaire cellen van goudvissen met TIRF-microscopie. Deze methode onthult dynamiek van neurotransmittervrijgave in neuronen.

Imaging exocytose in het netvlies bipolaire cellen met TIRF Microscopie

Meer video's verkennen