Name: Live cell imaging van de F-actine Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-05T19:00:00.000+00:00
Duration: 19 min 16 s
Description: Leer fluorescerende speckelmicroscopie om cytoskeletdynamiek in levende cellen te bestuderen via micro-injectie van gelabeld actine. Deze methode minimaliseert fotobleking en kwantificeert eiwitkinetiek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De ontwikkeling van qFSM wordt gefinancierd door de NIH subsidie ​​U01 GM06230.

Deel 1: Het verkrijgen van uw fluorescent gelabelde actine voor FSM Materialen die nodig zijn: gezuiverd actine, fluorofoor (Alexa, X-rhodamine aanbevolen). G-buffer, ultracentrifuge <ol><li> Een belangrijk onderdeel voor het verwerven van een goede FSM films is de juiste etikettering van actine (of andere cytoskeleteiwitten) met de fluorofoor van uw keuze. Wij raden u aan fluoroforen van Alexa (488, 568 golflengten) en X-rhodamine succinimidylester derivaten die lysineresiduen richten blootgesteld op het oppervlak van actine. </li><li> Bij de keuze van uw fluorofoor en de juiste golflengte, zorgen ervoor dat uw microscoop instellen van de juiste filters (excitatie en emissie) en illuminatoren heeft (kwik booglamp en / of lasers) om je fluorescerende tag tegemoet te komen. We raden u aan golflengten in het oranje naar rood golflengten (560-630 nm) om de effecten van auto-fluorescentie en foto-schade te minimaliseren en de verenigbaarheid ervan met GFP-conjugaten te verzekeren. </li><li> Pure actine kan worden gewonnen uit het spierweefsel die behoren tot Rat of kip, maar vereist een langdurige extractie-procedure van de spieren aceton poeder. Muscle aceton poeder kan worden gekocht van Invitrogen. De etikettering procedure is niet besproken in dit protocol, maar kan hier [1] te vinden </li><li> Als alternatief kunt u de aanschaf gelabelde actine eiwitten van verschillende leveranciers waaronder cytoskelet Inc, en Invitrogen. Aangepaste etikettering diensten zijn ook beschikbaar via Invitrogen. Gezuiverd, niet-gelabelde actine (zowel spier-en nonmuscle actine) kunnen worden gekocht bij cytoskelet Inc </li><li> Of u besluit tot aankoop van of bereid uw eigen label actine, wilt u ervoor zorgen dat de etikettering verhouding ergens rond de 0,3 tot 0,7 kleurstoffen per monomeer van actine. Een te hoge ratio kan een etiket invloed op de omzet kinetiek (en de binding aan geassocieerde eiwitten) van het actine filament, terwijl een te lage etikettering verhouding zal leiden tot slechte zoek spikkels (lage signaal-ruis) en kan leiden tot micro-injectie problemen (zie hieronder). Dit is een kritieke factor voor het krijgen van goede spikkel beelden. </li><li> Voorafgaand aan de lange termijn opslag, moeten de gelabelde actine oplossing worden verduidelijkt door het draaien op 75.000 - 80.000 xg gedurende 20 minuten bij 4 graden Celsius. Label actine moeten worden bewaard in G-buffer-oplossing en bleef -80 graden Celsius. Bereiding van 2 uL monsters wordt sterk aangeraden om de schadelijke effecten van herhaalde invriezen-ontdooien (leidt tot onoplosbare aggregaten) te verminderen. Zich te onthouden van het blootstellen van de gelabelde actine oplossing voor direct licht (wordt fotobleken van fluoroforen). Wij raden u aan ondoorzichtige microcentrifugebuizen voor langdurige opslag. </li></ol> Deel 2: Voorbereiding van cellen en micro-injectie van gelabelde actine Materialen die nodig zijn: micro-injectie naalden, injectiespuit, microloaders, voorverwarmde cel media, injectie buffer, emmer ijs, microscoop (fase-ring-, fase-contrast objectief 40X, Transjector, naald puller, micromanipulator) <ol><li> Veel soorten cellen vatbaar zijn voor FSM, maar het krijgen van goede speckle beelden is direct afhankelijk van het succes van de micro-injectie procedure. Bij het selecteren van cellen voor de FSM, cellen moeten groot (&gt; 50 um in diameter), moet verspreid wanneer verzilverd, en worden natuurlijk aanhanger aan substraten (of plastic weefselkweek gerechten). Het helpt ook als de cel cytosol beslaat een oppervlakte groter is dan de kern. De bovengenoemde criteria ervoor zorgen dat cellen vatbaar zijn voor micro-injectie. Geslaagde kandidaat cellijnen omvatten (maar niet beperkt tot) PtK1 [2,3], newt longcellen [4], en Aplysia neuronen [3]. </li><li> De cellen moeten worden uitgeplaat op vierkante glazen dekglaasjes (22 x 22 mm;. Geen 1-1/2) die zijn zuur gewassen. Standaard substraat coating kan worden toegepast op het dekglaasje en heeft geen invloed op micro-injectie. </li><li> De juiste keuze van micro-injectie naalden is afhankelijk van de grootte van de tip opening. Typisch, gat afmetingen kunnen zeer in grootte van 0,5 um tot zo groot als 3 um. Wij adviseren echter dat de injectie van actine vereist een optimale opening grootte tussen 0,5 en 1 uM. Als verstopping problemen consequent aangetroffen, kan groter gat maten geschikt voor de levering van monomere als ongewenst gepolymeriseerde actine filamenten. Micro-injectie naalden kunnen worden aangeschaft via verschillende leveranciers waaronder Eppendorf systemen die femtotip micro-injectie naalden te maken. Als alternatief indien een commerciële naald trekker beschikbaar is, kunnen micro-injectie glazen buisjes gekocht van Sutter, en trok de specificatie. Voor beginners raden wij met 10-20 trok naalden bij de hand voordat u begint met de injectie procedure. </li><li> Ideal &#39;injectie concentratie &quot;(uiteindelijke concentratie van actine geladen in de naald) van actine is tussen 0,5 en 1,0 ug / ul op basis van een 40% verhouding tussen de etikettering van kleurstof tot actine monomeer. Lagere etikettering verhouding van uw actine kan worden gecompenseerd door het injecteren van bij hogere concentraties (1-3 ug / ul). Echter, de verstopping frequentie van uw naaldworden verhoogd. Dit kan gedeeltelijk worden verminderd door gebruik te maken naalden met grotere openingen. Stock concentratie van actine kan worden verdund door de toevoeging van ijskoude injectie buffer. Ijskoude ddH2O kan ook gebruikt worden om te verdunnen voor een snelle injecties. Op dit punt alle werkende oplossingen moeten worden bewaard op ijs. </li><li> Belasting 0,5 tot 1,0 uL van uw actine-oplossing met behulp van een micro-injectiespuit (smalspoor - Hamilton), of anders met behulp van een pipet microloader tip. </li><li> Voorzichtig afzien van het actine-oplossing, door voorzichtig het vrijgeven van de oplossing. Bubbles moeten worden vermeden, maar kunnen eenvoudig verwijderd worden door het nemen van overtollige vloeistof rond de bubble. </li><li> Zorg ervoor dat de actine-oplossing volledig rusten op de naald. Overtollige oplossing ergens langs de capillaire van de naald kan verstoren de injectie flow. </li><li> Nu, voorzichtig bevestig de naald, het vermijden van contact met de naald naar de injector houder. Plaats de houder zo dat de naald maakt een 35-50 graden aan de basis van de microscoop podium. Lagere hoeken hebben de voorkeur. </li><li> Laat de punt van de naald tot het nauwelijks breekt het oppervlak van de media baden van uw cellen. </li><li> Nu de positie van de naald (zonder te verlagen), zodat het rust direct boven het midden van de doelstelling. Als de naald op een lijn met de doelstelling, moet je een heldere halo zien door het oculair. Dit is het einde van de naald komt. Langzaam de naald van links naar rechts (met de manipulator) kan beter te helpen bij het opsporen van de halo. </li><li> Stel de z-focus op de microscoop totdat je cellen zijn in zicht. Nu, langzaam de tip tot aan de halo geleidelijk vernauwt totdat uiteindelijk samenkomen in de punt van de naald - u moet de focus (z-positie) tegelijkertijd te controleren. Een extra functie om te zoeken naar is de as van de naald, die zal werpen lineair schaduwen. Het verlagen van de naald zal geleidelijk bepalen de naald as. Wanneer correct aan het einde van de naald en je cellen gedaan, moeten beiden in zicht. Kleine aanpassing van de fase-ring kan nodig zijn om het contrast te verbeteren. </li><li> Tijdens het navigeren, zorgen voor de top van de naald ver boven je cellen om te voorkomen dat het breken van de naald. </li><li> Bij het selecteren van cellen te injecteren, moeten cellen met vrije randen worden geconfronteerd met de naald. Dit zal zorgen voor dalende helling van de cel (uit dikste punt, waar de kern, woont op het dunste punt van de leading edge) zal de naald, in plaats van parallel te ontmoeten. </li><li> De naald druk moet worden vastgesteld op 0,3 tot 0,8 psi. De toegepaste constante druk zal resulteren in een gestage stroom van het actine-oplossing. </li><li> Na de beslissing op een cel te injecteren, de positie van uw naald dus de tip is naast de kern (perinucleaire regio, dikste deel van de cel waar de kern is niet direct onder). </li><li> Langzaam naar beneden, en stel de positie van de naald tot de top is het indrukken van de membraan, die nu stapsgewijs verlagen tot de naald tip heeft doorboord het membraan. Als de naald volledig doorboord het membraan, zal de cel helderder, zodra je ziet dit verschil te verhogen de naald totdat het niet langer aanraken van de cel. De werkelijke piercing en het injecteren van proces duurt 0,5 tot 2 seconden. </li><li> Wanneer correct gedaan, zal de cel vorm onveranderd lijken, terwijl te veel injectie zal resulteren in een snelle terugtrekking van de cel rand en in sommige gevallen zul je eigenlijk zien de cel exploderen. </li><li> Als u geen veranderingen zien in de cel toen microinjecting (niet helderder), kan de naald worden gesloten. U kunt dit testen door op de &#39;schone&#39; knop indien beschikbaar op uw Transjector. Indien open, zal dit significante toename van de constante druk stroom die kan worden gezien door de oculairs - het zal verschijnen als rimpelingen en in de buurt puin kan worden gezien verstuiven. </li><li> Als de naald is gesloten, kunt u ervoor kiezen om een ​​nieuw micro-injectie naald of poging om de punt van de naald breken door voorzichtig het verlagen van de naald tot aan de punt van de naald drukt tegen de glazen dekglaasje te voegen, waardoor de aan het einde van de tip te breken. De breuk gebied moet niet meer dan een 1 / 5 e van het oppervlak van de naald punt (het deel van de naald die begint te convergeren naar een punt). </li><li> Ga verder met de injectie, besteden niet meer dan 20 - 45 minuten voor elke micro-injectie sessie (afhankelijk van type cel). Als algemene regel geldt, zijn kortere sessies aan te raden om stress te minimaliseren op cellen. </li><li> Na het afronden van de micro-injectie, wijzigt u de cel media in de schotel door het toevoegen van verse voorverwarmd media. Laat vervolgens cellen te herstellen gedurende 30 minuten in een incubator voor de beeldvorming. Dit zal ook zorgen voor de actine te integreren in het bestaande netwerk cytoskelet. </li></ol> Afdeling 3: Montage van de Imaging Kamer Benodigde materialen: dekglaasje, dubbelzijdig tape, q-tips, tang, valap, kim vegen, oxyrase, imaging media, scheermesje, P200 piPette, pure ethanol <ol><li> Begin met het voorverwarmen van de imaging media en ontdooien een 15 uL hoeveelheid van Oxyrase. Zorg ervoor dat de lichtgevoelige oxyrase bescherming tegen licht. De toevoeging van oxyrase zal sterk verminderen van de effecten van fotobleken. </li><li> Voorverwarmen van de valap, door het instellen van de hete plaat temperatuur laag. Niet oververhitten / branden van de valap want het zal zijn werkzaamheid als een kit te verliezen. </li><li> Veeg een dekglaasje met een kimwipe overgoten met zuivere ethanol te reinigen en te verwijderen kleine rommeltjes. </li><li> Stapel twee even grote lengtes (2,5 cm lang) van de dubbelzijdige tape op de top van elkaar, met behulp van een schone vlakke ondergrond als een platform. Druk op eventuele luchtbellen om een ​​volledig plat vlak te creëren. </li><li> Met behulp van een scheermesje, twee rechte stroken afgesneden langs de lange as, zodat elke strook 0,5 cm in de breedte maatregelen. </li><li> Met behulp van een tang, elke strip dus plaats tegen de lange zijde van het dekglaasje dat de twee stroken tape een gat in het midden van je dekglaasje creëert. Druk zachtjes op de band een mooie zegel met het glas te maken. De strips van de band zal optreden als afstandhouders tussen de dekglaasje en het dekglaasje. </li><li> Zorg ervoor dat de valap volledig vloeibaar voordat u begint met de volgende stap. </li><li> Haal uw voorverwarmd imaging media, het toevoegen van 15 ul van oxyrase voor elke 500 ul van de media. </li><li> Vouw kimwipes in driehoeken tot en met 3 harde randen te creëren. Dit zal worden gebruikt om een ​​droog oppervlak voor de band te creëren om te kleven. </li><li> Ophalen cellen van de incubator. Met behulp van pincet, pak een hoek van het dekglaasje. Plaats snel de dekglaasje op een kimwipe (cel zijde is naar boven, niet aanraken van de weefsel), en gebruik de gevouwen kimwipe om twee tegengestelde kanten van het dekglaasje vegen om een ​​semi-droge ondergrond te creëren (op het oppervlak waar uw cellen rust). </li><li> Met behulp van pincet, pak een hoek van het dekglaasje en plaats het op je dekglaasje, zodat de droge oppervlakken worden afgestemd op de twee stroken van de tape. Merk nu heb je twee gesloten en twee open zijden spleten. Langzaam pipet 200 uL van uw imaging-media-oxyrase oplossing dicht bij een opening. Belangrijk is, mag er geen luchtbellen worden ingevoerd. De oplossing dient te worden opgezogen in de nieuw samengestelde kamer door capillaire krachten, dus volledig je cellen onder te dompelen in een oplossing. </li><li> Met behulp van een Q-tip schar de vier hoeken van uw dekglaasje met gesmolten valap om snel te brengen en te stabiliseren het dekglaasje. U zult merken dat de valap droogt direct (binnen enkele seconden bij kamertemperatuur). </li><li> Nu beginnen met de open zijden (niet-tape kant), lag een dunne strook van valap met behulp van een Q-tip en het nabootsen van een borstel beroerte. Herhaal dit voor de gesloten zijkanten. Langzaam opbouwen van de vacht van valap, waardoor de versterking van de afdichting door het herhalen van de coating stappen. De valap moet worden beperkt tot de randen, waardoor het centrum van het dekglaasje duidelijk. </li><li> Reinig het middelste gedeelte van het dekglaasje met behulp van een Q-tip met ddH2O om eventuele resten van de media te verwijderen, die bewust niet naar de cellen te vernietigen. Herhaal stap reinigen met zuivere ethanol. </li><li> Je hebt nu een volledig gesloten imaging kamer geoptimaliseerd voor spikkel beeldvorming. Het hebben van een volledig verzegelde behuizing voorkomt dat uw fluoroforen van snel fotobleken. </li></ol> Deel 4: Imaging cellen Materialen die nodig zijn: omgekeerde groothoek microscoop, mecury lamp, passende filters, gekoelde CCD-camera met 6,7 micron pixels, hoge numerieke apertuur, olie-immersie plan-apochromatische doelstellingen (60X tot 100X, fase of DIC). Triltafel. Imaging software. <ol><li> Voorverwarmen van de microscoop etappe naar 37 graden. Plaats uw nieuw opgeleverde imaging kamer, en wacht 10-15 minuten voor de temperatuur te stabiliseren alvorens beeldvorming. </li><li> Begin door te focussen uw cellen in Bright-veld, en dan je ingespoten cellen te vinden door te drukken op de juiste fluorescentie-instellingen. Probeer het moment van de fluorescentie blootstelling te verminderen fotobleken te minimaliseren. </li><li> Kijk voor geïnjecteerde cellen die gezond gebogen leading edges te hebben. Over-geïnjecteerde cellen (explodeerde cellen) wordt gekenmerkt door ingetrokken en gekartelde randen, die lijkt op een groot aantal filopodia - te vermijden imaging deze cellen. </li><li> Overname instellingen hangt af van het celtype, de kwaliteit van de gelabelde actine, en microscoop componenten. Echter, moet de blootstelling instellingen niet groter zijn dan 2 seconden, en de tijd tussen twee frames moet worden ingesteld tussen de 5 en 10 seconden. Typische lengtes voor een tijdreeks (per afgebeeld cel) kan ergens tussen de 10 tot 30 minuten variëren, en wordt beperkt door fotobleken effecten. Gain-instellingen op de camera kan worden gedraaid om het signaal te verhogen tot ruis. </li><li> Ideaal spikkel kenmerken moeten elk speckle verdeeld door ~ 2 speckle diameters naar de volgende naburige speckle. Dit zal garandeert optimale ruimtelijke en temporele bemonstering van het actine structuur. Voor de epitheelcellen, zal het gespikkelde actine-netwerk verschijnen homogeen, met spikkels gelijkmatig gespreid. Cellijnen die dicht stress-vezels of lamellipodia functiezullen worden onderscheiden, maar zal een gestippelde / gespikkeld uiterlijk hebben. Belichtingsinstellingen worden aangepast om de beste gespikkelde beelden te krijgen. </li><li> Over-gemicroinjecteerd cellen zullen dicht op elkaar gepakt spikkels die niet lijken te zijn discreet. Stress vezels en de lamellipodia verliest zijn gestippeld uiterlijk. </li><li> Onder-gemicroinjecteerd cellen zal zeer zwak weergegeven door het oculair, met spikkels, die ver van elkaar (&gt; 10 spikkels van elkaar) en verschijnen willekeurig verspreid. Stress vezels en de lamellipodia in deze cellen worden onderscheiden. </li><li> Sleutel tot het verkrijgen van &#39;goede&#39; speckle films is focus behouden. Dit is vooral van belang voor post-analyse met speckle flow en de omzet metingen. Daarmee de kwaliteit van de kwantitatieve analyse zal afhangen van vergrendeling in de focus voor de duur van de time-lapse. Dit kan vooral moeilijk als de beeldvorming vliegtuig is heel dun. Andere factoren zal afhangen van de stabiliteit van de microscoop systeem, met name het podium behuizing en de beeldvorming kamer. Contrast-based scherpstellen kan worden gebruikt als afbeelding interval lengtes voldoende zijn om deze functie te passen. Andere opties zijn de aankoop van een nabij-infrarood gebaseerde focus systeem dat een betrouwbare real-time scherpstelling biedt. U vindt deze aanbiedingen van Nikon, Olympus en ASI. </li></ol> Deel 5: qFSM analyse Deze sectie is niet in detail besproken, maar de informatie over de analyse-software kunt u hier [5] te vinden. Software download verzoeken kunnen worden gemaakt op onze website (lccb.scripps.edu). Onderwerpen die: <ul><li> Geluid kalibratie </li><li> Speckle detectie </li><li> Volgen met behulp van een hybride aanpak van beeld correlatie-based tracking van de grove beweging van spikkel gebieden en enkel deeltje het volgen van de gedetailleerde beweging van de individuele spikkels. </li><li> Berekening van het polymeer montage en demontage tarieven van de intensiteit schommelingen tijdens speckle verschijnen en verdwijnen evenementen. </li></ul>

<ol><li>Waterman-Storer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+speckle+microscopy+%28FSM%29+of+microtubules+and+actin+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent speckle microscopy (FSM) of microtubules and actin in living cells.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4, Unit 4.10-Unit 4.10 (2002).</li>
<li>Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+actin+networks+drive+the+protrusion+of+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells.</a> Science. 305, 1782-1786 (2004).</li>
<li>Zhang, X. F., Schaefer, A. W., Burnette, D. T., Schoonderwoert, V. T., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho-dependent+contractile+responses+in+the+neuronal+growth+cone+are+independent+of+classical+peripheral+retrograde+actin+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rho-dependent contractile responses in the neuronal growth cone are independent of classical peripheral retrograde actin flow.</a> Neuron. 40, 931-944 (2003).</li>
<li>Salmon, W. C., Adams, M. C., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-wavelength+fluorescent+speckle+microscopy+reveals+coupling+of+microtubule+and+actin+movements+in+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dual-wavelength fluorescent speckle microscopy reveals coupling of microtubule and actin movements in migrating cells.</a> J Cell Biol. 158, 31-37 (2002).</li>
<li>Danuser, G., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+fluorescent+speckle+microscopy+of+cytoskeleton+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys+Biomol+Struct%22%5BJournal%5D)">Quantitative fluorescent speckle microscopy of cytoskeleton dynamics.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35, 361-387 (2006).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te melden.

Een aantal belangrijke factoren van cruciaal belang zijn voor het succesvol behalen van spikkel beelden, hoe goed spikkels beginnen en eindigen met de kwaliteit van uw fluorescent gelabelde actine. Een hoge verhouding tussen de etikettering van kleurstof tot actine monomeren, die rond 0,4 tot 0,7 zal ervoor zorgen dat spikkels zal verschijnen helder en discreet, terwijl de gelabelde eiwit zelf moet oplosbaar en vrij van aggregaten. Even belangrijk is de micro-injectie procedure. Om ervoor te zorgen normale cel homeostas...

Injectie buffer (IB) 50 mM kalium glutamaat 0,5 M MgCl2 (bijlage 2A) Sla tot 2 jaar bij -20 ° C &nbsp; G-buffer 2 mM Tris ⋅ Cl, pH 8.0 (bijlage 2A) 0,2 mM CaCl2 (bijlage 2A) Voeg vlak voor gebruik: 0,2 mM ATP (zie recept voor 100 mM) 0,5 mM 2-mercaptoethanol Sla tot 1 dag bij 4 ° C

live cell imaging van de f-actine dynamics via fluorescent speckle microscopy (fsm)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

In dit protocol beschrijven we het gebruik van TL-Speckle Microscopy (FSM) om hoge-resolutie afbeeldingen van actine dynamiek vast te leggen in PtK1 cellen. Een uniek voordeel van FSM is de mogelijkheid om de beweging en de omzet kinetiek (montage / demontage) van de F-actine-netwerk vast te leggen in levende cellen. Deze techniek is vooral handig bij de afleiding van kwantitatieve metingen van F-actine dynamiek wanneer gecombineerd met computer vision software (qFSM). We beschrijven de selectie, micro-injectie en visualisatie van fluorescerende probes actine in levende cellen. Belangrijk is dat soortgelijke procedures zijn van toepassing op het visualiseren van andere macomolecular assemblages. FSM is aangetoond voor microtubuli, intermediaire filamenten, en hechting complexen.

Selectie, micro-injectie, en de beeldvorming van fluorescent-gelabeld F-actine via fluorescentie microscopie spikkel (FSM).

Live cell imaging van de F-actine Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

In dit protocol beschrijven we het gebruik van Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) om beelden met een hoge resolutie van actinedynamiek in PtK1-cellen vast te leggen. Een unieke ...

Fluorescent speckle microscopy wordt gebruikt om de dynamiek van diverse cytoskeletale eiwitten in levende cellen te onderzoeken. Bij correct gebruik kunnen kwantitatieve metingen worden verricht van de snelheid en de turnover-kinetiek van cytoskeletale eiwitten. We beginnen deze procedure door een klein volume fluorescent gelabeld actine in levende cellen te micro-injecteren.Vervolgens stellen we de beeldvormingskamer samen om de effecten van fotobleken te verminderen. Eerst worden twee stukjes dubbelzijdige tape geplaatst aan beide zijden van de microscopische objectglas waar ons dekglas voor de cellen zal rusten. Daarna wordt het medium voor beeldvorming met een pipet in de kamer gebracht door het medium nabij een van de open sleuven te toevoegen.Ten slotte worden alle vier de zijden afgesloten met Parafilm. Hallo, mijn naam is James Lim van het laboratorium van Galen Deuce van de afdeling Celbiologie aan het Scripps Research Institute. Vandaag gaan we u een procedure laten zien voor fluorescente speckle-microscopie.We gebruiken deze procedure om de actinedynamiek in migrerende epitheliale cellen te onderzoeken. Laten we beginnen. Een essentieel onderdeel voor het verkrijgen van

live-cell-imaging-f-actin-dynamics-via-fluorescent-speckle-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit document heeft tot doel de lezer in de exploitatie van een geïntegreerde atomic force-microscoop optische beeldvorming instrueren voor de mechanische stimulatie van levende cellen in cultuur. Een stap-voor-stap protocol wordt gepresenteerd. Een representatieve dataset die levende cellen als reactie op mechanische stimulatie shows gepresenteerd.

Live-cel respons op mechanische stimulatie onderzocht door Integrated Optical en Atomic Force Microscopy

Microscopische beeldvorming van levende endotheliale cellen die GFP-actine maakt karakterisering van dynamische veranderingen in het cytoskelet structuren. In tegenstelling tot technieken die vaste exemplaren te gebruiken, deze methode geeft een gedetailleerde evaluatie van de tijdelijke veranderingen in het actine cytoskelet in dezelfde cellen voor, tijdens en na de diverse fysieke, farmacologische of inflammatoire stimuli.

Studie van het actine cytoskelet in Live endotheliale cellen die GFP-actine

Spatiotemporele informatie over dynamische eiwitten in levende cellen is cruciaal voor het begrijpen van de biologie. Een type superresolutiemicroscopie genaamd fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM) onthult unieke informatie over de cytokinetische Z-ring in bacteriën: zowel het kralenachtige uiterlijk als de snelle dynamica van FtsZ binnen de ring.

Super-resolution Imaging van de Cytokinetic Z Ring in levende bacteriën met behulp van Fast-3D Structured Illumination Microscopy (F3D-SIM)

Ruimtelijke verdeling en temporele dynamica van plasmamembraaneiwitten en lipiden is een populair onderwerp in de biologie. Hier wordt dit probleem aangepakt door een ruimte-tijdelijke beeldfluctuatieanalyse die conceptueel dezelfde fysische grootheden levert als enkeldeeltjevolgen, maar gebruik maakt van kleine moleculaire labels en standaard microscoopopstellingen.

Van Fast Fluorescentie Imaging om moleculaire diffusie wet op de Live-celmembranen in een Commercial Microscoop

Om stromingssnelheden en directionaliteit van filamenteus-actine bij de T-cel immunologische synaps te onderzoeken, wordt live-cell superresolutie beeldvorming gecombineerd met totale interne reflectiefluorescentie en gekwantificeerd met behulp van ruimte-tijdelijke beeldcorrelatiespectroscopie.

Corticale actine Flow in T-cellen gekwantificeerd door ruimte en tijd Afbeelding Correlatie Spectroscopie van Structured Verlichting Microscopie Gegevens

Door celtransplantatie, cytoskelettenlabeling en verlies/winst van functiebenaderingen te combineren, beschrijft dit protocol hoe de migrererende zebravis prospectieve prechordale plaat kan worden gebruikt om de functie van een kandidaatgen in in vivo celmigratie te analyseren.

analyseren<em&gt; In Vivo</em&gt; Cell Migratie behulp Cell Transplantaties en Time-lapse Imaging in zebravis embryo&#39;s

We presenteren een protocol voor de toepassing van interferometrische Photoactivated Localization Microscopy (iPALM), een 3-dimensionale single-molecule lokalisatie super resolutie microscopie methode, aan de beeldvorming van het actine cytoskelet in hechtende zoogdiercellen. Deze aanpak maakt het mogelijk op basis van licht visualisatie van nanoschaal structurele kenmerken die anders onopgelost zouden blijven door middel van conventionele diffractie beperkt optische microscopie.

Driedimensionale Super resolutie microscopie van de F-actine filamenten door interferometrische Photoactivated Localization Microscopy (iPALM)

Dit protocol wordt een nieuwe methode voor de kwantitatieve visualisatie van complexe vorming van SNARE-eiwitten, gebaseerd op Förster resonance energie-overdracht en levensduur van de fluorescentie microscopie imaging waardoor beschreven.

Visualiseren van intracellulaire SNARE mensenhandel door fluorescentie levensduur microscopie Imaging

We beschrijven hoe micro- en photomanipulation technieken zoals FRAP en photoactivation inschakelen de bepaling van de parameters van de beweeglijkheid en de spatio dynamiek van eiwitten in het migreren van cellen. Experimentele uitlezingen omvatten subcellular dynamiek en omzet van beweeglijkheid toezichthouders of van de onderliggende actine cytoskelet.

Micromanipulation technieken waardoor analyse van morfogenetische dynamiek en een omzet van Cytoskeletal regelgevers

Om vooruit te komen, moeten groeikegels tractiekrachten uitoefenen tegen de externe omgeving. Het genereren van trekkrachten is afhankelijk van actinedynamiek en koppeling. De huidige studie beschrijft methoden voor het analyseren van actinedynamica, koppelingskoppeling en tractiekrachten voor groeikegelvoortgang.

Analyses van actinedynamica, koppelingskoppeling en tractiekracht voor groeiconusvooruitgang

We presenteren protocollen voor eenvoudige actinefilamentmicrofluïdische assays, in combinatie met fluorescentiemicroscopie, waarmee men individuele actinefilamenten in realtime nauwkeurig kan volgen terwijl ze sequentieel worden blootgesteld aan verschillende eiwitoplossingen.

Microfluïdica en fluorescentiemicroscopie gebruiken om de assemblagedynamiek van single actinefilamenten en -bundels te bestuderen

Leer fluorescerende speckelmicroscopie om cytoskeletdynamiek in levende cellen te bestuderen via micro-injectie van gelabeld actine. Deze methode minimaliseert fotobleking en kwantificeert eiwitkinetiek.

Live cell imaging van de F-actine Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Meer video's verkennen