Name: Live cell imaging van de F-actine Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-05T19:00:00.000+00:00
Duration: 19 min 16 s
Description: Leer fluorescerende speckelmicroscopie om cytoskeletdynamiek in levende cellen te bestuderen via micro-injectie van gelabeld actine. Deze methode minimaliseert fotobleking en kwantificeert eiwitkinetiek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De ontwikkeling van qFSM wordt gefinancierd door de NIH subsidie ​​U01 GM06230.

Deel 1: Het verkrijgen van uw fluorescent gelabelde actine voor FSM Materialen die nodig zijn: gezuiverd actine, fluorofoor (Alexa, X-rhodamine aanbevolen). G-buffer, ultracentrifuge <ol><li> Een belangrijk onderdeel voor het verwerven van een goede FSM films is de juiste etikettering van actine (of andere cytoskeleteiwitten) met de fluorofoor van uw keuze. Wij raden u aan fluoroforen van Alexa (488, 568 golflengten) en X-rhodamine succinimidylester derivaten die lysineresiduen richten blootgesteld op het oppervlak van actine. </li><li> Bij de keuze van uw fluorofoor en de juiste golflengte, zorgen ervoor dat uw microscoop instellen van de juiste filters (excitatie en emissie) en illuminatoren heeft (kwik booglamp en / of lasers) om je fluorescerende tag tegemoet te komen. We raden u aan golflengten in het oranje naar rood golflengten (560-630 nm) om de effecten van auto-fluorescentie en foto-schade te minimaliseren en de verenigbaarheid ervan met GFP-conjugaten te verzekeren. </li><li> Pure actine kan worden gewonnen uit het spierweefsel die behoren tot Rat of kip, maar vereist een langdurige extractie-procedure van de spieren aceton poeder. Muscle aceton poeder kan worden gekocht van Invitrogen. De etikettering procedure is niet besproken in dit protocol, maar kan hier [1] te vinden </li><li> Als alternatief kunt u de aanschaf gelabelde actine eiwitten van verschillende leveranciers waaronder cytoskelet Inc, en Invitrogen. Aangepaste etikettering diensten zijn ook beschikbaar via Invitrogen. Gezuiverd, niet-gelabelde actine (zowel spier-en nonmuscle actine) kunnen worden gekocht bij cytoskelet Inc </li><li> Of u besluit tot aankoop van of bereid uw eigen label actine, wilt u ervoor zorgen dat de etikettering verhouding ergens rond de 0,3 tot 0,7 kleurstoffen per monomeer van actine. Een te hoge ratio kan een etiket invloed op de omzet kinetiek (en de binding aan geassocieerde eiwitten) van het actine filament, terwijl een te lage etikettering verhouding zal leiden tot slechte zoek spikkels (lage signaal-ruis) en kan leiden tot micro-injectie problemen (zie hieronder). Dit is een kritieke factor voor het krijgen van goede spikkel beelden. </li><li> Voorafgaand aan de lange termijn opslag, moeten de gelabelde actine oplossing worden verduidelijkt door het draaien op 75.000 - 80.000 xg gedurende 20 minuten bij 4 graden Celsius. Label actine moeten worden bewaard in G-buffer-oplossing en bleef -80 graden Celsius. Bereiding van 2 uL monsters wordt sterk aangeraden om de schadelijke effecten van herhaalde invriezen-ontdooien (leidt tot onoplosbare aggregaten) te verminderen. Zich te onthouden van het blootstellen van de gelabelde actine oplossing voor direct licht (wordt fotobleken van fluoroforen). Wij raden u aan ondoorzichtige microcentrifugebuizen voor langdurige opslag. </li></ol> Deel 2: Voorbereiding van cellen en micro-injectie van gelabelde actine Materialen die nodig zijn: micro-injectie naalden, injectiespuit, microloaders, voorverwarmde cel media, injectie buffer, emmer ijs, microscoop (fase-ring-, fase-contrast objectief 40X, Transjector, naald puller, micromanipulator) <ol><li> Veel soorten cellen vatbaar zijn voor FSM, maar het krijgen van goede speckle beelden is direct afhankelijk van het succes van de micro-injectie procedure. Bij het selecteren van cellen voor de FSM, cellen moeten groot (&gt; 50 um in diameter), moet verspreid wanneer verzilverd, en worden natuurlijk aanhanger aan substraten (of plastic weefselkweek gerechten). Het helpt ook als de cel cytosol beslaat een oppervlakte groter is dan de kern. De bovengenoemde criteria ervoor zorgen dat cellen vatbaar zijn voor micro-injectie. Geslaagde kandidaat cellijnen omvatten (maar niet beperkt tot) PtK1 [2,3], newt longcellen [4], en Aplysia neuronen [3]. </li><li> De cellen moeten worden uitgeplaat op vierkante glazen dekglaasjes (22 x 22 mm;. Geen 1-1/2) die zijn zuur gewassen. Standaard substraat coating kan worden toegepast op het dekglaasje en heeft geen invloed op micro-injectie. </li><li> De juiste keuze van micro-injectie naalden is afhankelijk van de grootte van de tip opening. Typisch, gat afmetingen kunnen zeer in grootte van 0,5 um tot zo groot als 3 um. Wij adviseren echter dat de injectie van actine vereist een optimale opening grootte tussen 0,5 en 1 uM. Als verstopping problemen consequent aangetroffen, kan groter gat maten geschikt voor de levering van monomere als ongewenst gepolymeriseerde actine filamenten. Micro-injectie naalden kunnen worden aangeschaft via verschillende leveranciers waaronder Eppendorf systemen die femtotip micro-injectie naalden te maken. Als alternatief indien een commerciële naald trekker beschikbaar is, kunnen micro-injectie glazen buisjes gekocht van Sutter, en trok de specificatie. Voor beginners raden wij met 10-20 trok naalden bij de hand voordat u begint met de injectie procedure. </li><li> Ideal &#39;injectie concentratie &quot;(uiteindelijke concentratie van actine geladen in de naald) van actine is tussen 0,5 en 1,0 ug / ul op basis van een 40% verhouding tussen de etikettering van kleurstof tot actine monomeer. Lagere etikettering verhouding van uw actine kan worden gecompenseerd door het injecteren van bij hogere concentraties (1-3 ug / ul). Echter, de verstopping frequentie van uw naaldworden verhoogd. Dit kan gedeeltelijk worden verminderd door gebruik te maken naalden met grotere openingen. Stock concentratie van actine kan worden verdund door de toevoeging van ijskoude injectie buffer. Ijskoude ddH2O kan ook gebruikt worden om te verdunnen voor een snelle injecties. Op dit punt alle werkende oplossingen moeten worden bewaard op ijs. </li><li> Belasting 0,5 tot 1,0 uL van uw actine-oplossing met behulp van een micro-injectiespuit (smalspoor - Hamilton), of anders met behulp van een pipet microloader tip. </li><li> Voorzichtig afzien van het actine-oplossing, door voorzichtig het vrijgeven van de oplossing. Bubbles moeten worden vermeden, maar kunnen eenvoudig verwijderd worden door het nemen van overtollige vloeistof rond de bubble. </li><li> Zorg ervoor dat de actine-oplossing volledig rusten op de naald. Overtollige oplossing ergens langs de capillaire van de naald kan verstoren de injectie flow. </li><li> Nu, voorzichtig bevestig de naald, het vermijden van contact met de naald naar de injector houder. Plaats de houder zo dat de naald maakt een 35-50 graden aan de basis van de microscoop podium. Lagere hoeken hebben de voorkeur. </li><li> Laat de punt van de naald tot het nauwelijks breekt het oppervlak van de media baden van uw cellen. </li><li> Nu de positie van de naald (zonder te verlagen), zodat het rust direct boven het midden van de doelstelling. Als de naald op een lijn met de doelstelling, moet je een heldere halo zien door het oculair. Dit is het einde van de naald komt. Langzaam de naald van links naar rechts (met de manipulator) kan beter te helpen bij het opsporen van de halo. </li><li> Stel de z-focus op de microscoop totdat je cellen zijn in zicht. Nu, langzaam de tip tot aan de halo geleidelijk vernauwt totdat uiteindelijk samenkomen in de punt van de naald - u moet de focus (z-positie) tegelijkertijd te controleren. Een extra functie om te zoeken naar is de as van de naald, die zal werpen lineair schaduwen. Het verlagen van de naald zal geleidelijk bepalen de naald as. Wanneer correct aan het einde van de naald en je cellen gedaan, moeten beiden in zicht. Kleine aanpassing van de fase-ring kan nodig zijn om het contrast te verbeteren. </li><li> Tijdens het navigeren, zorgen voor de top van de naald ver boven je cellen om te voorkomen dat het breken van de naald. </li><li> Bij het selecteren van cellen te injecteren, moeten cellen met vrije randen worden geconfronteerd met de naald. Dit zal zorgen voor dalende helling van de cel (uit dikste punt, waar de kern, woont op het dunste punt van de leading edge) zal de naald, in plaats van parallel te ontmoeten. </li><li> De naald druk moet worden vastgesteld op 0,3 tot 0,8 psi. De toegepaste constante druk zal resulteren in een gestage stroom van het actine-oplossing. </li><li> Na de beslissing op een cel te injecteren, de positie van uw naald dus de tip is naast de kern (perinucleaire regio, dikste deel van de cel waar de kern is niet direct onder). </li><li> Langzaam naar beneden, en stel de positie van de naald tot de top is het indrukken van de membraan, die nu stapsgewijs verlagen tot de naald tip heeft doorboord het membraan. Als de naald volledig doorboord het membraan, zal de cel helderder, zodra je ziet dit verschil te verhogen de naald totdat het niet langer aanraken van de cel. De werkelijke piercing en het injecteren van proces duurt 0,5 tot 2 seconden. </li><li> Wanneer correct gedaan, zal de cel vorm onveranderd lijken, terwijl te veel injectie zal resulteren in een snelle terugtrekking van de cel rand en in sommige gevallen zul je eigenlijk zien de cel exploderen. </li><li> Als u geen veranderingen zien in de cel toen microinjecting (niet helderder), kan de naald worden gesloten. U kunt dit testen door op de &#39;schone&#39; knop indien beschikbaar op uw Transjector. Indien open, zal dit significante toename van de constante druk stroom die kan worden gezien door de oculairs - het zal verschijnen als rimpelingen en in de buurt puin kan worden gezien verstuiven. </li><li> Als de naald is gesloten, kunt u ervoor kiezen om een ​​nieuw micro-injectie naald of poging om de punt van de naald breken door voorzichtig het verlagen van de naald tot aan de punt van de naald drukt tegen de glazen dekglaasje te voegen, waardoor de aan het einde van de tip te breken. De breuk gebied moet niet meer dan een 1 / 5 e van het oppervlak van de naald punt (het deel van de naald die begint te convergeren naar een punt). </li><li> Ga verder met de injectie, besteden niet meer dan 20 - 45 minuten voor elke micro-injectie sessie (afhankelijk van type cel). Als algemene regel geldt, zijn kortere sessies aan te raden om stress te minimaliseren op cellen. </li><li> Na het afronden van de micro-injectie, wijzigt u de cel media in de schotel door het toevoegen van verse voorverwarmd media. Laat vervolgens cellen te herstellen gedurende 30 minuten in een incubator voor de beeldvorming. Dit zal ook zorgen voor de actine te integreren in het bestaande netwerk cytoskelet. </li></ol> Afdeling 3: Montage van de Imaging Kamer Benodigde materialen: dekglaasje, dubbelzijdig tape, q-tips, tang, valap, kim vegen, oxyrase, imaging media, scheermesje, P200 piPette, pure ethanol <ol><li> Begin met het voorverwarmen van de imaging media en ontdooien een 15 uL hoeveelheid van Oxyrase. Zorg ervoor dat de lichtgevoelige oxyrase bescherming tegen licht. De toevoeging van oxyrase zal sterk verminderen van de effecten van fotobleken. </li><li> Voorverwarmen van de valap, door het instellen van de hete plaat temperatuur laag. Niet oververhitten / branden van de valap want het zal zijn werkzaamheid als een kit te verliezen. </li><li> Veeg een dekglaasje met een kimwipe overgoten met zuivere ethanol te reinigen en te verwijderen kleine rommeltjes. </li><li> Stapel twee even grote lengtes (2,5 cm lang) van de dubbelzijdige tape op de top van elkaar, met behulp van een schone vlakke ondergrond als een platform. Druk op eventuele luchtbellen om een ​​volledig plat vlak te creëren. </li><li> Met behulp van een scheermesje, twee rechte stroken afgesneden langs de lange as, zodat elke strook 0,5 cm in de breedte maatregelen. </li><li> Met behulp van een tang, elke strip dus plaats tegen de lange zijde van het dekglaasje dat de twee stroken tape een gat in het midden van je dekglaasje creëert. Druk zachtjes op de band een mooie zegel met het glas te maken. De strips van de band zal optreden als afstandhouders tussen de dekglaasje en het dekglaasje. </li><li> Zorg ervoor dat de valap volledig vloeibaar voordat u begint met de volgende stap. </li><li> Haal uw voorverwarmd imaging media, het toevoegen van 15 ul van oxyrase voor elke 500 ul van de media. </li><li> Vouw kimwipes in driehoeken tot en met 3 harde randen te creëren. Dit zal worden gebruikt om een ​​droog oppervlak voor de band te creëren om te kleven. </li><li> Ophalen cellen van de incubator. Met behulp van pincet, pak een hoek van het dekglaasje. Plaats snel de dekglaasje op een kimwipe (cel zijde is naar boven, niet aanraken van de weefsel), en gebruik de gevouwen kimwipe om twee tegengestelde kanten van het dekglaasje vegen om een ​​semi-droge ondergrond te creëren (op het oppervlak waar uw cellen rust). </li><li> Met behulp van pincet, pak een hoek van het dekglaasje en plaats het op je dekglaasje, zodat de droge oppervlakken worden afgestemd op de twee stroken van de tape. Merk nu heb je twee gesloten en twee open zijden spleten. Langzaam pipet 200 uL van uw imaging-media-oxyrase oplossing dicht bij een opening. Belangrijk is, mag er geen luchtbellen worden ingevoerd. De oplossing dient te worden opgezogen in de nieuw samengestelde kamer door capillaire krachten, dus volledig je cellen onder te dompelen in een oplossing. </li><li> Met behulp van een Q-tip schar de vier hoeken van uw dekglaasje met gesmolten valap om snel te brengen en te stabiliseren het dekglaasje. U zult merken dat de valap droogt direct (binnen enkele seconden bij kamertemperatuur). </li><li> Nu beginnen met de open zijden (niet-tape kant), lag een dunne strook van valap met behulp van een Q-tip en het nabootsen van een borstel beroerte. Herhaal dit voor de gesloten zijkanten. Langzaam opbouwen van de vacht van valap, waardoor de versterking van de afdichting door het herhalen van de coating stappen. De valap moet worden beperkt tot de randen, waardoor het centrum van het dekglaasje duidelijk. </li><li> Reinig het middelste gedeelte van het dekglaasje met behulp van een Q-tip met ddH2O om eventuele resten van de media te verwijderen, die bewust niet naar de cellen te vernietigen. Herhaal stap reinigen met zuivere ethanol. </li><li> Je hebt nu een volledig gesloten imaging kamer geoptimaliseerd voor spikkel beeldvorming. Het hebben van een volledig verzegelde behuizing voorkomt dat uw fluoroforen van snel fotobleken. </li></ol> Deel 4: Imaging cellen Materialen die nodig zijn: omgekeerde groothoek microscoop, mecury lamp, passende filters, gekoelde CCD-camera met 6,7 micron pixels, hoge numerieke apertuur, olie-immersie plan-apochromatische doelstellingen (60X tot 100X, fase of DIC). Triltafel. Imaging software. <ol><li> Voorverwarmen van de microscoop etappe naar 37 graden. Plaats uw nieuw opgeleverde imaging kamer, en wacht 10-15 minuten voor de temperatuur te stabiliseren alvorens beeldvorming. </li><li> Begin door te focussen uw cellen in Bright-veld, en dan je ingespoten cellen te vinden door te drukken op de juiste fluorescentie-instellingen. Probeer het moment van de fluorescentie blootstelling te verminderen fotobleken te minimaliseren. </li><li> Kijk voor geïnjecteerde cellen die gezond gebogen leading edges te hebben. Over-geïnjecteerde cellen (explodeerde cellen) wordt gekenmerkt door ingetrokken en gekartelde randen, die lijkt op een groot aantal filopodia - te vermijden imaging deze cellen. </li><li> Overname instellingen hangt af van het celtype, de kwaliteit van de gelabelde actine, en microscoop componenten. Echter, moet de blootstelling instellingen niet groter zijn dan 2 seconden, en de tijd tussen twee frames moet worden ingesteld tussen de 5 en 10 seconden. Typische lengtes voor een tijdreeks (per afgebeeld cel) kan ergens tussen de 10 tot 30 minuten variëren, en wordt beperkt door fotobleken effecten. Gain-instellingen op de camera kan worden gedraaid om het signaal te verhogen tot ruis. </li><li> Ideaal spikkel kenmerken moeten elk speckle verdeeld door ~ 2 speckle diameters naar de volgende naburige speckle. Dit zal garandeert optimale ruimtelijke en temporele bemonstering van het actine structuur. Voor de epitheelcellen, zal het gespikkelde actine-netwerk verschijnen homogeen, met spikkels gelijkmatig gespreid. Cellijnen die dicht stress-vezels of lamellipodia functiezullen worden onderscheiden, maar zal een gestippelde / gespikkeld uiterlijk hebben. Belichtingsinstellingen worden aangepast om de beste gespikkelde beelden te krijgen. </li><li> Over-gemicroinjecteerd cellen zullen dicht op elkaar gepakt spikkels die niet lijken te zijn discreet. Stress vezels en de lamellipodia verliest zijn gestippeld uiterlijk. </li><li> Onder-gemicroinjecteerd cellen zal zeer zwak weergegeven door het oculair, met spikkels, die ver van elkaar (&gt; 10 spikkels van elkaar) en verschijnen willekeurig verspreid. Stress vezels en de lamellipodia in deze cellen worden onderscheiden. </li><li> Sleutel tot het verkrijgen van &#39;goede&#39; speckle films is focus behouden. Dit is vooral van belang voor post-analyse met speckle flow en de omzet metingen. Daarmee de kwaliteit van de kwantitatieve analyse zal afhangen van vergrendeling in de focus voor de duur van de time-lapse. Dit kan vooral moeilijk als de beeldvorming vliegtuig is heel dun. Andere factoren zal afhangen van de stabiliteit van de microscoop systeem, met name het podium behuizing en de beeldvorming kamer. Contrast-based scherpstellen kan worden gebruikt als afbeelding interval lengtes voldoende zijn om deze functie te passen. Andere opties zijn de aankoop van een nabij-infrarood gebaseerde focus systeem dat een betrouwbare real-time scherpstelling biedt. U vindt deze aanbiedingen van Nikon, Olympus en ASI. </li></ol> Deel 5: qFSM analyse Deze sectie is niet in detail besproken, maar de informatie over de analyse-software kunt u hier [5] te vinden. Software download verzoeken kunnen worden gemaakt op onze website (lccb.scripps.edu). Onderwerpen die: <ul><li> Geluid kalibratie </li><li> Speckle detectie </li><li> Volgen met behulp van een hybride aanpak van beeld correlatie-based tracking van de grove beweging van spikkel gebieden en enkel deeltje het volgen van de gedetailleerde beweging van de individuele spikkels. </li><li> Berekening van het polymeer montage en demontage tarieven van de intensiteit schommelingen tijdens speckle verschijnen en verdwijnen evenementen. </li></ul>

<ol><li>Waterman-Storer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+speckle+microscopy+%28FSM%29+of+microtubules+and+actin+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent speckle microscopy (FSM) of microtubules and actin in living cells.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4, Unit 4.10-Unit 4.10 (2002).</li>
<li>Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+actin+networks+drive+the+protrusion+of+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells.</a> Science. 305, 1782-1786 (2004).</li>
<li>Zhang, X. F., Schaefer, A. W., Burnette, D. T., Schoonderwoert, V. T., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho-dependent+contractile+responses+in+the+neuronal+growth+cone+are+independent+of+classical+peripheral+retrograde+actin+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rho-dependent contractile responses in the neuronal growth cone are independent of classical peripheral retrograde actin flow.</a> Neuron. 40, 931-944 (2003).</li>
<li>Salmon, W. C., Adams, M. C., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-wavelength+fluorescent+speckle+microscopy+reveals+coupling+of+microtubule+and+actin+movements+in+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dual-wavelength fluorescent speckle microscopy reveals coupling of microtubule and actin movements in migrating cells.</a> J Cell Biol. 158, 31-37 (2002).</li>
<li>Danuser, G., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+fluorescent+speckle+microscopy+of+cytoskeleton+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys+Biomol+Struct%22%5BJournal%5D)">Quantitative fluorescent speckle microscopy of cytoskeleton dynamics.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35, 361-387 (2006).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te melden.

Een aantal belangrijke factoren van cruciaal belang zijn voor het succesvol behalen van spikkel beelden, hoe goed spikkels beginnen en eindigen met de kwaliteit van uw fluorescent gelabelde actine. Een hoge verhouding tussen de etikettering van kleurstof tot actine monomeren, die rond 0,4 tot 0,7 zal ervoor zorgen dat spikkels zal verschijnen helder en discreet, terwijl de gelabelde eiwit zelf moet oplosbaar en vrij van aggregaten. Even belangrijk is de micro-injectie procedure. Om ervoor te zorgen normale cel homeostas...

Injectie buffer (IB) 50 mM kalium glutamaat 0,5 M MgCl2 (bijlage 2A) Sla tot 2 jaar bij -20 ° C &nbsp; G-buffer 2 mM Tris ⋅ Cl, pH 8.0 (bijlage 2A) 0,2 mM CaCl2 (bijlage 2A) Voeg vlak voor gebruik: 0,2 mM ATP (zie recept voor 100 mM) 0,5 mM 2-mercaptoethanol Sla tot 1 dag bij 4 ° C

live cell imaging van de f-actine dynamics via fluorescent speckle microscopy (fsm)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

In dit protocol beschrijven we het gebruik van TL-Speckle Microscopy (FSM) om hoge-resolutie afbeeldingen van actine dynamiek vast te leggen in PtK1 cellen. Een uniek voordeel van FSM is de mogelijkheid om de beweging en de omzet kinetiek (montage / demontage) van de F-actine-netwerk vast te leggen in levende cellen. Deze techniek is vooral handig bij de afleiding van kwantitatieve metingen van F-actine dynamiek wanneer gecombineerd met computer vision software (qFSM). We beschrijven de selectie, micro-injectie en visualisatie van fluorescerende probes actine in levende cellen. Belangrijk is dat soortgelijke procedures zijn van toepassing op het visualiseren van andere macomolecular assemblages. FSM is aangetoond voor microtubuli, intermediaire filamenten, en hechting complexen.

Selectie, micro-injectie, en de beeldvorming van fluorescent-gelabeld F-actine via fluorescentie microscopie spikkel (FSM).

Live cell imaging van de F-actine Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

In dit protocol beschrijven we het gebruik van Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) om beelden met een hoge resolutie van actinedynamiek in PtK1-cellen vast te leggen. Een unieke ...

Fluorescent speckle microscopy wordt gebruikt om de dynamiek van diverse cytoskeletale eiwitten in levende cellen te onderzoeken. Bij correct gebruik kunnen kwantitatieve metingen worden verricht van de snelheid en de turnover-kinetiek van cytoskeletale eiwitten. We beginnen deze procedure door een klein volume fluorescent gelabeld actine in levende cellen te micro-injecteren.Vervolgens stellen we de beeldvormingskamer samen om de effecten van fotobleken te verminderen. Eerst worden twee stukjes dubbelzijdige tape geplaatst aan beide zijden van de microscopische objectglas waar ons dekglas voor de cellen zal rusten. Daarna wordt het medium voor beeldvorming met een pipet in de kamer gebracht door het medium nabij een van de open sleuven te toevoegen.Ten slotte worden alle vier de zijden afgesloten met Parafilm. Hallo, mijn naam is James Lim van het laboratorium van Galen Deuce van de afdeling Celbiologie aan het Scripps Research Institute. Vandaag gaan we u een procedure laten zien voor fluorescente speckle-microscopie.We gebruiken deze procedure om de actinedynamiek in migrerende epitheliale cellen te onderzoeken. Laten we beginnen. Een essentieel onderdeel voor het verkrijgen van goede fluorescentie-speckle-microscopiefilms is de juiste labeling van actine met de fluorofoor naar keuze; wij raden het gebruik van Alexa-fluoroforen en rhodamine-varianten aan, NHS-ester-derivaten die zich richten op blootgestelde lysinerestanten op het oppervlak van actine.Het is belangrijk dat de labelingsratio hoog is, rond de 0,3 tot 0,7 kleurstoffen per monomeer van actine, om ervoor te zorgen dat de speckles helder en discreet verschijnen voorafgaand aan langdurige opslag. Zuiver de gelabelde actine-oplossing door te centrifugeren bij 75.000 tot 80.000 ×g gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius. Gelabelde actine dient te worden bewaard in G-bufferoplossing bij negatief 80 graden Celsius.Bereid aliquots van twee µL voor om herhaalde vries-dooi-cycli te voorkomen, wat kan leiden tot onoplosbare aggregaten. Om fotobleken van fluorescerende markers te voorkomen, mag de gelabelde actine-oplossing gedurende langere tijd niet aan direct licht worden blootgesteld; gebruik ondoorzichtige microcentrifugeebuizen voor langdurige bewaring. Plaats de cellen voor micro-injectie op met zuur gewassen vierkante glazen dekglasjes.Een standaard substraatcoating kan op het dekglas worden aangebracht en zal de microinjectie niet beïnvloeden. Bewaar de cellen bij 37 °C terwijl het actine wordt voorbereid om cellen te selecteren die geschikt zijn voor microinjectie. Houd voor FSM rekening met deze criteria.De cellen moeten groot zijn, met een diameter van meer dan 50 micrometer, plat uitgespreid zijn na het uitplaten en van nature hechten aan substraten. Het is daarnaast gunstig als het cytoplasma van de cel een groter oppervlak beslaat dan dat van de kern. Enkele geschikte cellijnen zijn onder meer PTK1, salamanderlongcellen en AIA-neuronen.In deze demonstratie injecteren we PTK in epitheelcellen. De juiste selectie van micro-injectienaalden hangt af van de grootte van de tipopening. Doorgaans kunnen de gatgroottes variëren van 0,5 micrometer tot wel drie micrometer.Wij raden een optimale openinggrootte aan tussen 0,5 en één micrometer. Voor de injectie kunnen Acton Micro-injectienaalden worden gekocht of zelf worden gemaakt. Als er een commerciële naaldtrekker beschikbaar is, raden wij beginners aan om 10 tot 20 getrokken naalden bij de hand te hebben voordat zij met de injectieprocedure beginnen.De volgende stap is het verdunnen van het gelabelde acton met ijskoude injectiebuffer. Houd alle werkoplossingen op ijs. De ideale injectieconcentratie, wat de uiteindelijke concentratie van het in de naald geladen acton is, ligt tussen 0,5 en 1 µg/µL.Breng, op basis van een labelingsverhouding van 40% D ten opzichte van de actine-monomeerbelasting, 0,5 tot één microliter van de verdunde actine-oplossing toe. Dispenseer de actine-oplossing voorzichtig met behulp van een naald van een microspuit. Probeer luchtbellen te vermijden.Indien er bellen aanwezig zijn, kunnen deze eenvoudig worden verwijderd door overtollige vloeistoffen rondom de bel op te zuigen. Zorg ervoor dat de Acton-oplossing volledig op de naaldpunt rust. Er mag geen overtollige oplossing aanwezig zijn langs de capillaire van de naald, omdat dit de injectiestroom kan verstoren.De gevulde naald is nu klaar om aan de injectiehouder voor micro-injectie te worden bevestigd. Haal de cellen uit de incubator en plaats het dekglas op de objecttafel van de microscoop. Om te beginnen met de micro-injectieprocedure, brengt u de gevulde naald naar de microscoop.Bevestig de naald zorgvuldig aan de houder van de injector, waarbij contact met de naaldpunt moet worden vermeden. Positioneer de houder zodanig dat de naald een hoek van 35 tot 50 graden maakt met de basis van de microscooptafel. Laat de punt van de naald zakken tot deze net het oppervlak van het medium doorbreekt.Positioneer nu de naaldpunt zodanig dat deze zich direct boven het midden van het objectief bevindt. Als de naaldpunt is uitgelijnd met het objectief, zou u een heldere halo door het oculair moeten zien. Dit is het uiteinde van de naaldpunt.Door de naald langzaam heen en weer te bewegen, kan de halo beter worden gelokaliseerd. Zorg er tijdens het navigeren voor dat de naaldpunt zich ruim boven de cellen bevindt. Pas de Z.Focus van de microscoop aan tot de cellen duidelijk zichtbaar zijn, om te voorkomen dat de naaldpunt afbreekt.Laat vervolgens de naaldpunt langzaam zakken terwijl u de focus regelt, totdat de halo geleidelijk versmalt en uiteindelijk samenvalt met de naaldpunt. U kunt ook zoeken naar de schacht van de naald, die lineaire schaduwen zal werpen. Door de naald verder te laten zakken, wordt de naaldschacht geleidelijk zichtbaarder.Kleine aanpassingen van de fasering zijn mogelijk nodig om het contrast te verbeteren; zowel het uiteinde van de naald als de cellen moeten nu duidelijk zichtbaar zijn. Bij het selecteren van cellen om te injecteren, moeten cellen met vrije randen naar de naaldpunt gericht zijn. Dit zorgt ervoor dat de aflopende helling van de cel, van het dikste punt waar de nucleus zich bevindt naar het dunste punt van de voorrand, de naaldpunt raakt in plaats van er parallel aan te lopen.Stel de naaldspanning in op 0,3 tot 0,8 PSI. De constante uitgeoefende druk zal resulteren in een gestage stroom van de acton-oplossing. Wanneer u een cel heeft gekozen om te injecteren, positioneer de naald dan langzaam zodat de punt zich naast de celkern bevindt; verlaag en pas de positie van de naald aan totdat de punt naar beneden drukt.Verlaag de naald geleidelijk tot de punt door het membraan is gedrongen. Als de naal volledig door het membraan is gegaan, zal de cel helderder lijken. Zodra u deze verandering ziet, tilt u de naald op tot deze de cel niet meer raakt.Het eigenlijke doorprikken en injecteren duurt 0,5 tot twee seconden. Wanneer dit correct wordt uitgevoerd, zal de vorm van de cel ongewijzigd blijven. Om stress voor de cellen te minimaliseren, mag elke micro-injectiesessie niet langer duren dan 20 tot 45 minuten.Soms zijn er mogelijk geen veranderingen in de cel zichtbaar bij het injecteren en wordt de cel niet helderder. Dit wijst erop dat de naaldpunt mogelijk verstopt is. U kunt dit testen door op de schoonmaakknop te drukken, indien deze beschikbaar is op uw trans-injector.Als de naaldpunt open is, zal dit de constante drukstroom aanzienlijk verhogen, wat zichtbaar is als rimpelingen en de verspreiding van nabijgelegen debris. Als de naaldpunt gesloten is, kunt u ofwel een nieuwe micro-injectienaald inbrengen of proberen de punt van de naald af te breken door de naald voorzichtig te laten zakken totdat de punt van de naald tegen het glazen dekglas drukt, waardoor het uiterste uiteinde van de punt afbreekt.Het breukoppervlak mag niet groter zijn dan een vijfde van het oppervlak van de naaldpunt, het deel van de naald dat begint samen te komen tot een punt wanneer de micro-injectie is voltooid. Vervang het celmedium in de schaal door vers voorverwarm medium om eventuele fluorescente residuen te verwijderen. Laat de cellen na het vervangen van het medium 30 minuten herstellen in een incubator van 37 °C voordat u begint met het imagen.Dit maakt het ook mogelijk dat actine integreert in het bestaande cytoskeletnetwerk terwijl de cellen herstellen in de incubator; begin met het samenstellen van de beeldgevingskamer. Verwarm eerst het beeldgevingsmedium voor in een waterbad van 37 °C. Ontdooi vervolgens een aliquot van 15 µL oxa erase bij kamertemperatuur.De latere toevoeging van RA aan het medium zal de effecten van fotobleken sterk verminderen. Door de oxa erase in aluminiumfolie gewikkeld te houden, wordt gewaarborgd dat de lichtgevoelige verbinding beschermd is tegen licht. Verwarm de VAP-afdichting voor op een warmteplaat die op een lage temperatuur is ingesteld; oververhit of verbrand de VAP niet, anders verliest deze zijn effectiviteit als afdichtingsmiddel.Veeg een objectglas schoon met een Kim wipe gedrenkt in zuiver ethanol om kleine vuildeeltjes te verwijderen. Stapel twee stukken dubbelzijdige tape van gelijke lengte (2,5 centimeter) op elkaar op een schoon, plat oppervlak, zoals een ander objectglas. Druk eventuele ingesloten luchtbellen uit om een volledig vlak platform te creëren.Gebruik vervolgens een scheermesje om twee rechte stroken langs de lange as van de tape te snijden, zodat elke strook een breedte van 0,5 centimeter heeft. Plaats met een pincet elke strook langs de lange randen van de microscopische glaasje, zodat de twee plakbandstroken een opening in het midden van het glaasje vormen. Druk voorzichtig op de tape om een goede afdichting met het glas te verkrijgen.Deze plakbandstrips dienen als afstandhouders tussen het micro-preparaatglas en het dekglas. Controleer het klepje om er zeker van te zijn dat het volledig is gesmolten. Haal uw voorverwarmde imagingmedium op voordat u met de volgende stap begint.Voeg 15 µL oxy rays toe aan elke 500 µL medium. Vouw een chem wipe in een driehoek om drie harde randen te creëren. Dit wordt later gebruikt om het dekglas af te nemen.Haal de cellen met een pincet uit de incubator. Pak snel een hoek van het dekglas vast. Plaats het dekglas met de cellzijde naar boven op een Kimwipe, zodanig dat deze het weefsel niet raakt, en gebruik de gevouwen Kimwipe om twee tegenoverliggende zijden van het dekglas af te vegen om een semi-droog oppervlak te creëren.Pak vervolgens met een pincet een hoek van het dekglas vast en plaats het dekglas op het microscoopobjectglas, zodat de droge oppervlakken zijn uitgelijnd met de twee stroken plakband. Let op dat er nu twee gesloten zijden en twee open spleten zijn. Pipetteer langzaam 200 µL van uw beeldvormingsmedium RA-oplossing dicht bij een van de openingen.Het is belangrijk om geen luchtbellen te introduceren. De oplossing moet door capillaire krachten in de nieuw geassembleerde kamer worden getrokken, waardoor de cellen volledig in de oplossing worden ondergedompeld. Gebruik een wattenstaafje om de vier hoeken van het dekglas aan te stippen met gesmolten vap om het dekglas snel te bevestigen en te stabiliseren.U zult merken dat de VAP binnen enkele seconden droogt bij kamertemperatuur. Begin vervolgens bij de gesloten zijden en breng met het wattenstaafje een dunne strip VAP aan door een strijkende beweging te maken. Herhaal dit voor de open zijden.Bouw de laag vap langzaam op en versterk de afdichting door de coatingstappen te herhalen. De VAP moet beperkt blijven tot de randen, zodat het centrum van het dekglas vrij blijft. Nadat de randen van het dekglas zijn afgedicht, reinigt u voorzichtig het centrale gedeelte van het dekglas met een wattenstaafje en DD H2O om eventuele resterende media te verwijderen.Zorg ervoor dat de cellen niet worden geplet. Herhaal deze reinigingsstap met pure ethanol. U heeft nu een volledig afgesloten beeldkamer die is geoptimaliseerd voor fluorescentie speckle imaging.Een volledig afgesloten behuizing voorkomt dat uw floral fours snel fotobleken. De cellen in de volledig afgesloten kamer zijn nu klaar voor beeldvorming. We gebruiken een omgekeerde weidveldsmicroscoop met een kwiklamp, epi-illuminator, geschikte filters en een olie-immersieplan.Apochromatische objectiefbeelden worden vastgelegd met een gekoelde CCD-camera met pixels van 6,7 micron en software voor beeldacquisitie. Verwarm de microscooptafel vooraf tot 37 °C. Plaats de beeldkamer en wacht 10 tot 15 minuten tot de temperatuur is gestabiliseerd voordat u begint met het maken van beelden.Zodra de temperatuur is gestabiliseerd, stelt u de cellen scherp in brightfield en zoekt u vervolgens de geïnjecteerde cellen door de juiste fluorescentie-instellingen te selecteren. Probeer de blootstelling aan fluorescentie te minimaliseren om fotobleken te beperken. Zoek naar geïnjecteerde cellen met gezonde, gebogen leidende randen.Over-geïnjiceerde cellen zullen worden gekenmerkt door ingetrokken en grillige randen die lijken op talrijke phylopodia. Maak geen beelden van deze cellen. De acquisitie-instellingen zijn afhankelijk van het celtype, de kwaliteit van het gelabelde actine en de componenten van de microscoop.Echter mogen de belichtingsinstellingen niet langer zijn dan twee seconden en het tijdsinterval tussen frames moet worden ingesteld tussen vijf en 10 seconden. De gain-instellingen op de camera kunnen worden verhoogd om de signaal-ruisverhouding te verbeteren. Ideale spikkelkarakteristieken vereisen dat elke spikkel ongeveer twee spikkeldiameters verwijderd is van de direct aangrenzende spikkel.Voor epitheelcellen zal het gespikkelde actinenetwerk homogeen verschijnen, waarbij de spikkels gelijkmatig over elkaar verdeeld zijn. De belichtingsinstellingen moeten worden aangepast om de beste gespikkelde beelden te verkrijgen.De sleutel tot het verkrijgen van goede speckle-films is het behouden van de focus. Dit is bijzonder belangrijk voor post-analyses waarbij metingen van de speckle-stroom en -omzetting worden uitgevoerd. De kwaliteit van de kwantitatieve analyse zal dus afhangen van het fixeren van de focus gedurende de gehele tijdreeks.Verschillende strategieën voor het behouden van de focus worden in de tekst beschreven; voor deze demonstratie wordt het Nikon Perfect Focus-systeem gebruikt. Hier zijn diverse voorbeelden van micro-injectiecellen. Het linkerpaneel toont een onder-geïnjiceerde cel met een speckle-afbeelding van een lage concentratie.Het middelste paneel toont een afbeelding van een micro-geïnjecteerde cel met een te hoge concentratie speckles, en het rechterpaneel toont een optimaal geïnjecteerde cel voor FSM met een goede speckle-afbeelding. We hebben u zojuist laten zien hoe u fluorescent gelabeld actine in epitheelcellen micro-injecteert voor fluorescent speckle-microscopie.Bij het uitvoeren van deze procedure is het essentieel om te onthouden dat zowel de kwaliteit van uw gelabelde actine als de microinjectietechniek de uiteindelijke kwaliteit van uw speckle-beelden bepalen. Dat was alles en veel succes met uw experimenten.

live-cell-imaging-f-actin-dynamics-via-fluorescent-speckle-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit document heeft tot doel de lezer in de exploitatie van een geïntegreerde atomic force-microscoop optische beeldvorming instrueren voor de mechanische stimulatie van levende cellen in cultuur. Een stap-voor-stap protocol wordt gepresenteerd. Een representatieve dataset die levende cellen als reactie op mechanische stimulatie shows gepresenteerd.

Live-cel respons op mechanische stimulatie onderzocht door Integrated Optical en Atomic Force Microscopy

Microscopische beeldvorming van levende endotheliale cellen die GFP-actine maakt karakterisering van dynamische veranderingen in het cytoskelet structuren. In tegenstelling tot technieken die vaste exemplaren te gebruiken, deze methode geeft een gedetailleerde evaluatie van de tijdelijke veranderingen in het actine cytoskelet in dezelfde cellen voor, tijdens en na de diverse fysieke, farmacologische of inflammatoire stimuli.

Studie van het actine cytoskelet in Live endotheliale cellen die GFP-actine

Spatiotemporele informatie over dynamische eiwitten in levende cellen is cruciaal voor het begrijpen van de biologie. Een type superresolutiemicroscopie genaamd fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM) onthult unieke informatie over de cytokinetische Z-ring in bacteriën: zowel het kralenachtige uiterlijk als de snelle dynamica van FtsZ binnen de ring.

Super-resolution Imaging van de Cytokinetic Z Ring in levende bacteriën met behulp van Fast-3D Structured Illumination Microscopy (F3D-SIM)

Ruimtelijke verdeling en temporele dynamica van plasmamembraaneiwitten en lipiden is een populair onderwerp in de biologie. Hier wordt dit probleem aangepakt door een ruimte-tijdelijke beeldfluctuatieanalyse die conceptueel dezelfde fysische grootheden levert als enkeldeeltjevolgen, maar gebruik maakt van kleine moleculaire labels en standaard microscoopopstellingen.

Van Fast Fluorescentie Imaging om moleculaire diffusie wet op de Live-celmembranen in een Commercial Microscoop

Om stromingssnelheden en directionaliteit van filamenteus-actine bij de T-cel immunologische synaps te onderzoeken, wordt live-cell superresolutie beeldvorming gecombineerd met totale interne reflectiefluorescentie en gekwantificeerd met behulp van ruimte-tijdelijke beeldcorrelatiespectroscopie.

Corticale actine Flow in T-cellen gekwantificeerd door ruimte en tijd Afbeelding Correlatie Spectroscopie van Structured Verlichting Microscopie Gegevens

We presenteren een protocol voor de toepassing van interferometrische Photoactivated Localization Microscopy (iPALM), een 3-dimensionale single-molecule lokalisatie super resolutie microscopie methode, aan de beeldvorming van het actine cytoskelet in hechtende zoogdiercellen. Deze aanpak maakt het mogelijk op basis van licht visualisatie van nanoschaal structurele kenmerken die anders onopgelost zouden blijven door middel van conventionele diffractie beperkt optische microscopie.

Driedimensionale Super resolutie microscopie van de F-actine filamenten door interferometrische Photoactivated Localization Microscopy (iPALM)

Dit protocol wordt een nieuwe methode voor de kwantitatieve visualisatie van complexe vorming van SNARE-eiwitten, gebaseerd op Förster resonance energie-overdracht en levensduur van de fluorescentie microscopie imaging waardoor beschreven.

Visualiseren van intracellulaire SNARE mensenhandel door fluorescentie levensduur microscopie Imaging

We beschrijven hoe micro- en photomanipulation technieken zoals FRAP en photoactivation inschakelen de bepaling van de parameters van de beweeglijkheid en de spatio dynamiek van eiwitten in het migreren van cellen. Experimentele uitlezingen omvatten subcellular dynamiek en omzet van beweeglijkheid toezichthouders of van de onderliggende actine cytoskelet.

Micromanipulation technieken waardoor analyse van morfogenetische dynamiek en een omzet van Cytoskeletal regelgevers

Om vooruit te komen, moeten groeikegels tractiekrachten uitoefenen tegen de externe omgeving. Het genereren van trekkrachten is afhankelijk van actinedynamiek en koppeling. De huidige studie beschrijft methoden voor het analyseren van actinedynamica, koppelingskoppeling en tractiekrachten voor groeikegelvoortgang.

Analyses van actinedynamica, koppelingskoppeling en tractiekracht voor groeiconusvooruitgang

We presenteren protocollen voor eenvoudige actinefilamentmicrofluïdische assays, in combinatie met fluorescentiemicroscopie, waarmee men individuele actinefilamenten in realtime nauwkeurig kan volgen terwijl ze sequentieel worden blootgesteld aan verschillende eiwitoplossingen.

Microfluïdica en fluorescentiemicroscopie gebruiken om de assemblagedynamiek van single actinefilamenten en -bundels te bestuderen

Hier presenteren we methoden voor het bereiden van quasi-tweedimensionale (2D) verstrengelde, verknoopte en vloeibare kristalactine-assemblages van gezuiverde eiwitten.

Het afstemmen van de contractiliteit en vervormingsmodi van actieve op actine gebaseerde assemblages in vitro: van tweedimensionale actieve netwerken tot druppels van vloeibare kristallen

Leer fluorescerende speckelmicroscopie om cytoskeletdynamiek in levende cellen te bestuderen via micro-injectie van gelabeld actine. Deze methode minimaliseert fotobleking en kwantificeert eiwitkinetiek.

Live cell imaging van de F-actine Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Meer video's verkennen