Name: In utero en ex vivo Elektroporatie voor Gene Expression Mouse in retinale ganglioncellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 25 min 6 s
Description: Leer in utero en ex vivo elektroporatie voor genexpressie in muizen retinale ganglioncellen. Deze technieken helpen onderzoekers de ontwikkeling en functie van visuele neuronen te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken dr. Richard Vallee en Brikha Shrestha voor hulp bij de in utero en ex vivo netvlies elektroporatie technieken, respectievelijk, en dr. T. Sakurai voor reacties op dit protocol. Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health subsidies F31 NS051008 (TJP), de Fondation pour la Recherche Medicale, en het Human Frontier Science Program (AR) en R01 EY12736 (CM).

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Eye+Retina+and+the+Visual+Systems+of+the+Mouse%22">Eye Retina and the Visual Systems of the Mouse</a>. Chalupa, L. M., Williams, R. W. , MIT Press. Cambridge. (2008).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16-22 (2004).</li>
<li>Ishikawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+GDNF+gene+transfer+into+axotomized+retinal+ganglion+cells+using+in+vivo+electroporation+with+a+contact+lens-type+electrode%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Effect of GDNF gene transfer into axotomized retinal ganglion cells using in vivo electroporation with a contact lens-type electrode.</a> Gene Ther. 12, 289-298 (2005).</li>
<li>Donovan, S. L., Dyer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+square+wave+electroporation+of+retinal+explant+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures.</a> Nat Protoc. 1, 2710-2718 (2006).</li>
<li>Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+delivery+into+mouse+retinal+ganglion+cells+by+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation.</a> BMC Dev Biol. 7, 103-10 (2007).</li>
<li>Petros, T. J., Shrestha, B. R., Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+and+sufficiency+of+EphB1+in+driving+the+ipsilateral+retinal+projection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Specificity and sufficiency of EphB1 in driving the ipsilateral retinal projection.</a> J Neurosci. 29, 3463-3474 (2009).</li>
</ol>

In deze video, hebben we aangetoond elektroporatie technieken, zowel in utero en ex vivo, voor-gen in embryonale muizen RGC. In utero netvlies elektroporatie een mechanisme voor het manipuleren van genexpressie in RGC biedt en visualiseren van hun axon projecties in vivo. Het toestaan ​​van de embryo&#39;s om te overleven postnataal onderzoek van deze GFP + RGC projecties vergunningen in hun doel, de laterale nucleus geniculate (LGN). Ex-vivo-retinal elektroporatie zorgt voor een meer gecontroleerde mogelijkheid om specifieke netvlies regio&#39;s doelstelling voor gebruik met in vitro testen. De combinatie van in vivo en in vitro analyses afgeleid van deze technieken maakt een grondige karakterisering van RGC ontwikkeling en axon projecties in een subset van RGC in een overigens normale achtergrond. Terwijl onze demonstratie richt zich op het RGC axon begeleiding op de optisch chiasma, zowel in utero en ex vivo netvlies electroporations voordelig zou kunnen zijn om te bestuderen hoe verstoringen in genexpressie effect RGC differentiatie, dendritische morfologie, elektrofysiologische eigenschappen, synapsvorming en de juiste targeting in de beëindiging zones zoals als de LGN en superieure colliculus.

<table><tbody><tr><td>BTX Electro Square Porator ECM 830 (met voetpedaal)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>450052</td><td></td></tr><tr><td>Ronde pincetelektroden</td><td>Nepa Gene</td><td>CUY650-5 or CUY650-7</td><td></td></tr><tr><td>Zijden hechtdraad</td><td>Henry Schein</td><td>101-2636</td><td></td></tr><tr><td>Glazen micropipetten met zuigers</td><td>Drummond Scientific</td><td>5-000-1001-X10</td><td></td></tr><tr><td>Antibioticum-antimycoticum</td><td>Invitrogen</td><td>15240096</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12-medium</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>Bovien serumalbumine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8806-5G</td><td></td></tr><tr><td>ITS-supplement</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-1884</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Methylcellulose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0512</td><td></td></tr><tr><td>Glazen microwell-schalen</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-ornithine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Laminine</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr></tbody></table>

in utero en ex vivo elektroporatie voor gene expression mouse in retinale ganglioncellen

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

Het netvlies en zijn enige uitgang neuron, de retinale ganglion cel (RGC), omvatten een uitstekend model, waarin de biologische vragen, zoals celdifferentiatie, axon begeleiding, retinotopische organisatie en synapsvorming [1] te onderzoeken. Een nadeel is het onvermogen om genexpressie efficiënt en betrouwbaar te manipuleren in het RGC in vivo, met name in de anders zo toegankelijk murine visuele zenuwbanen. Transgene muizen kunnen worden gebruikt om genexpressie te manipuleren, maar deze aanpak is vaak duur, tijdrovend, en kan ongewenste bijwerkingen veroorzaken. In chick, is in ovo electroporatie gebruikt om de genexpressie te manipuleren in RGC voor de behandeling van het netvlies en RGC ontwikkeling. Hoewel soortgelijke elektroporatie technieken zijn ontwikkeld in neonatale muis pups [2], volwassen ratten [3], en embryonale muizen retinae in vitro [4], geen van deze strategieën toe volledige karakterisering van RGC ontwikkeling en axonen projecties in vivo. Daartoe hebben we twee toepassingen van elektroporatie, een in utero en de andere ex vivo, specifiek gericht embryonale murine RGC [5, 6]. Met in utero netvlies elektroporatie, kunnen wij misexpress of downregulate specifieke genen in RGC en volg hun axon projecties door de visuele pathways in vivo, waardoor het onderzoek van begeleiding beslissingen op tussendoelen, zoals de optische chiasma, of at target regio&#39;s, zoals de laterale geniculate kern. Storende genexpressie in een subset van RGC in een overigens wild-type achtergrond maakt een begrip van gen-functie in de retina pad. Daarnaast hebben we een metgezel techniek voor het analyseren van RGC axon groei in vitro. We electroporate embryonale hoofden ex vivo, te verzamelen en incubeer het hele netvlies, dan explantaten later voor te bereiden op deze retinae meerdere dagen. Retinale explanten kan gebruikt worden in een verscheidenheid van in vitro tests in om de reactie van geëlektroporeerd RGC axonen te begeleiden signalen of andere factoren te onderzoeken. Kortom, deze set van technieken vergroot ons vermogen om misexpress of genen downregulate in RGC en moet veel hulp studies onderzoeken RGC ontwikkeling en axon projecties.

Hier presenteren wij twee technieken voor het manipuleren van genexpressie in muriene retinale ganglioncellen (RGC) door<em&gt; In utero</em&gt; En<em&gt; Ex vivo</em&gt; Elektroporatie. Deze technieken maken het mogelijk een om te onderzoeken hoe veranderingen in genexpressie RGC ontwikkeling, axon begeleiding en functionele eigenschappen beïnvloeden.

In utero en ex vivo Elektroporatie voor Gene Expression Mouse in retinale ganglioncellen

De retina en het enige outputneuron ervan, de retina-ganglioncel (RGC), vormen een uitstekend model om biologische vraagstukken te onderzoeken, zoals cel...

In utero retinale electroporatie begint met een abdominale incisie bij een geanestheseerde moederdier in stadium E 13.5 tot 14.5 om de embryonale keten bloot te leggen. DNA wordt in één retina per embryo geïnjecteerd en de koppen worden geëlectroporeerd, waardoor het DNA wordt opgenomen door RGC-progenitoren. Bij E 18.5 worden de embryo's geperfuseerd en zijn ze GFP-positief.Retina en visuele projecties worden geanalyseerd voor X vivo retinale electroporatie. Koppen van E 13,5 tot 14,5 worden met de dorsale zijde naar boven vastgepind in een schaaltje en DNA wordt geïnjecteerd in de perifere dorsale regio van beide retina, gevolgd door electroporatie. De gehele retina wordt 40 uur gekweekt, waarna GFP-positieve retinale explantaten worden uitgeplaat voor in vitro kweekassays.Hallo, ik ben Tim Petros van het laboratorium van Dr. Carol Mason van de afdeling Pathologie en celbiologie en neurowetenschappen aan de Columbia University. Vandaag laten we u zien hoe u genen in het embryonale spiegelbeeld van het netvlies kunt introduceren door gebruik te maken van in utero en ex vivo retinale elektroporatie. Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om te bestuderen hoe het manipuleren van de genexpressie in retinale ganglioncellen hun projectiepad verandert, specifiek bij het chiasma opticum.Oké, laten we beginnen. Voordat u overgaat tot in utero retinale electroporatie, is een juiste voorbereiding essentieel. Raadpleeg ons schriftelijke protocol voor gedetailleerde informatie over het voorbereiden van de anesthesie, de sterilisatie van gereedschappen en instrumentarium, het bereiden van de DNA-oplossingen voor injectie en de antibiotische en antimycotische oplossingen voor na de operatie, het voorbereiden van het operatieve veld en het opwarmen van de juiste oplossingen.Fijngepunte micropipetten moeten voorafgaand aan de chirurgische ingreep worden klaargemaakt met een micro-elektrodepuller. Breek de punt om een schuine hoek te creëren voor in utero electroporatie. Injecteer eerst 0,15 milliliters van het anesthesiemengsel intraperitoneaal in een moederdier in stadium E 13.5 tot E 14.5. Het duurt drie tot zeven minuten voordat het moederdier volledig onder anesthesie is; test of de muis is geanestheseerd.Knijp in de achterpoot en controleer op een gebrek aan respons tijdens het interval waarin het dier bezwijkt voor het anestheticum. Snijd een klein stukje af en pipetteer vijf µL van de DNA-oplossing op de param. Buig een metalen draadplunjer in een hoek van 90 graden en voeg deze toe aan een uitgetrokken micropipet; gebruik de plunjer om de DNA-oplossing in de micropipet op te zuigen.Expose nu de muisembryo's chirurgisch. Raadpleeg het JoVE-protocol van Wal Inus et al. voor de juiste techniek. We zijn nu klaar voor de elektroporatie.De eerste stap is om het netvlies correct te oriënteren. Vervolgens injecteren we DNA in het netvlies en daarna zullen we de kop elektroperforeren. Oké, laten we beginnen.Oké, de eerste stap is om het netvlies zo te positioneren dat het naar boven is gericht, zoals hier. Vervolgens doorboren we met de micropipet de vliezige wand en injecteren we het DNA idealiter direct in het netvlies. Zodra u door de baarmoedermuur bent gegaan, drukt u op de zuiger om het DNA in het netvlies te injecteren en trekt u de zuiger daarna weer terug.Zodra u het DNA heeft geïnjecteerd, zou u de groene kleurstof moeten zien die het vruchtwater en ook het netvlies vult. Nu de injectie is voltooid, zijn we klaar voor de electroporatie. Voor de electroporatie plaatsen we de electroporatie-elektroden rond het embryo, waarbij de positieve elektrode zich bevindt naast het netvlies dat wordt geëlectroporeerd.Zodra u klaar bent, drukt u op het voetpedaal, waardoor er een elektrische stroom naar het embryo wordt geleid. U ziet bellen ontstaan op de negatief geladen peddel, wat aangeeft dat de elektroporatie succesvol was. Herhaal deze stap voor alle geïnjecteerde embryo's.Op deze manier elektroporeert u DNA in één embryonale retina. U kunt deze procedure herhalen voor zoveel embryo's als u wilt. Houd er rekening mee dat naarmate u meer embryo's elektroporeert, de kans groter wordt dat de moeder de embryo's zal resorberen.Nadat de embryo's zijn geëlektroporeerd, masseert u met uw vingers de embryonale keten terug in de moederdier zodra de embryo's weer binnen zijn. Giet ongeveer 2 mL van de antibiotica-antimycotica-oplossing in de buikholte. Gebruik de hemostat en pincet om het peritoneum te hechten, beginnend met een dubbele knoop aan het anterieure deel van de incisie, en ga verder met een eenvoudige continue hechtnaad naar het posterieure deel van de incisie.Gebruik de laatste lus om de hechting af te knopen en knip het overtollige hechtmateriaal af. Zet vervolgens de incisie dicht met nietjes. Til hiervoor de huid bij het anterieure gedeelte van de incisie op met stompe pincetten.Zorg ervoor dat de huid zorgvuldig van het peritoneum wordt gescheiden. Plaats vervolgens de tanden van de nietmachine rond de huid en druk de nietmachine in; niet de incisie vervolgens dicht richting het posterieure uiteinde, wat gewoonlijk vijf tot zeven nietjes vereist. Wanneer het nieten is voltooid, reinig dan de wond rond de nietjes met een alcoholdoekje.Laat de moeder herstellen op het warmteplakje en plaats haar vervolgens in een nieuwe kooi. Wanneer ze begint te trekken en om te rollen, duurt het gewoonlijk 15 tot 90 minuten voordat ze volledig wakker is, om pijn en ongemak te minimaliseren. Moeders ontvangen buprenorfine bij het ontwaken en op latere tijdstippen.Indien ongemak uitdroging blijft veroorzaken, injecteer dan één milliliter saline subcutaan bij de moederdier ongeveer twee tot vier uur na de operatie. Na 24 uur na de operatie moet het moederdier het normale gedrag hervatten en regelmatig drinken en eten. We zullen het ge-electroporeerde netvlies oogsten op E 18.5 voor analyse.Als alternatief kunt u de moeder laten bevallen en het netvlies op postnatale leeftijd oogsten voor analyse op latere leeftijd. Na het anesthetiseren van het dier gebruikt u een schaar om de huid en het peritoneum onder de nietjes door te knippen. Om de buikholte en uterine hoorns bloot te leggen, verwijdert u een ge-electroporeerd embryo en pinst u het embryo met de ventrale zijde naar boven via de ledematen vast op een dissectieschaal; knip door de abdominale huid en het peritoneum en knip door de laterale delen van de ribbenkast om het hart bloot te leggen.Doorboor vervolgens de linker ventrikel met de perfusienaald en knip het rechter atrium door met de microschaar. Start nu de perfusie en laat de PFA ongeveer 60 tot 90 seconden doorstromen. Bij een correcte uitvoering moet er bloed uit het rechter atrium stromen en moet het embryo bleek worden.Ontkop na voltooiing van de perfusie het embryo en verzamel de koppen in 4%PF in een conische buis van 15 milliliter. Herhaal deze procedure voor alle ge-electroporeerde embryo's en alle moederdieren. Nadat alle embryo's zijn verzameld, wordt het moederdier geofferd via cervicale dislocatie.Bewaar de koppen een nacht in 4% PFA bij vier graden Celsius en was ze vervolgens gedurende enkele dagen in PBS. Na het wassen met PBS kunt u het netvlies onderzoeken op een succesvolle GFP-expressie. Zet de kop eerst vast in een dissectieschaal met het netvlies naar boven en ondergedompeld in PBS. Verwijder de huid rondom het netvlies met een naald van 26,5 gauge om het retinaal pigmentepitheel of RPE bloot te leggen.Puncteer het ventrale netvlies bij de overgang van de lens naar het RPE. Steek vervolgens één zijde van de microschaar in dit gat en maak een verticale incisie door het ventrale netvlies richting de oogzenuwschijf. Dit stelt u in staat om het netvlies te oriënteren wanneer u het verwijdert.Scheid het RPE van het netvlies door het RPE bij de ventrale incisie met één pincet vast te pakken. Gebruik een tweede pincet om het RPE van het netvlies af te pellen, specifiek bij de overgang tussen het RPE en de lens waar het RPE stevig is gehecht. Pak na het verwijderen van het RPE de lens met een pincet vast en trek deze omhoog en weg.Om de lens te verwijderen, verwijdert u voorzichtig het netvlies door een pincet onder het netvlies te plaatsen en de kop van de oogzenuw door te knijpen om het netvlies los te maken. Breng het netvlies vervolgens over naar een putje gevuld met PBS. Zorg ervoor dat u bijhoudt van welk hoofd welk netvlies afkomstig is. Herhaal deze stappen voor het contralaterale netvlies en voor alle andere geëlectroporeerde embryo's. Gebruik een fluorescent dissectiemicroscoop om alle netvliezen te scannen op GFP-positiviteit; dit geeft aan dat de electroporatie in dit embryo succesvol was, waardoor deze netvliezen en de bijbehorende hersenen kunnen worden verwerkt voor verdere analyse.De ex vivo retinale electroporatieprocedure vereist enkele aanvullende voorbereidende stappen die verschillen van in utero electroporatie. Raadpleeg het schriftelijke protocol voor gedetailleerde informatie over de bereiding en oxygenatie van serumvrij medium en de voorbereiding van kweekschaaltjes en border assays. Na het anesthetiseren van het dier wordt de buikholte geopend zoals eerder gedemonstreerd en wordt de gehele embryonale reeks verwijderd en in D-M-E-M-F 12 op ijs geplaatst.De moederdier moet vervolgens worden geëuthanaseerd middels cervicale dislocatie. Gebruik een schaar om door de baarmoederwand te knippen, verwijder vervolgens de embryo's uit de vruchtzak en verzamel deze in D-M-E-M-F 12 en houd ze op ijs; decapiteer de embryo's en bewaar deze in DMEA-medium op ijs; de lichamen kunnen worden weggegooid. Gebruik daarna een mondpipet of een plunjerpipet om een micropipet te vullen met de gewenste hoeveelheid DNA-oplossing.Breyng daarna één kop naar een dissectieschaal met PBS en spelden de kop met de dorsale zijde naar boven vast. Ga naar de dissectiemicroscoop voor de injecties.Oké, nu zijn we klaar voor de elektroporatie. Ik ga het DNA injecteren in het perifere dorsale deel van beide retinae en vervolgens de kop elektroporeren. Oké, daar gaan we.De eerste stap is het verwijderen van de huid boven de retina. Hiervoor gebruiken we de pincet om de huid weg te pellen. Nu is het dorsale deel van beide retina's zichtbaar.Vervolgens ga ik DNA injecteren vlak onder de laag van het retinaal pigmentepitheel in beide retina's. Hiervoor houd ik de elektrode in een bijna horizontale positie en steek ik door het RPE op het meest perifere dorsale deel van de retina. U zult zien dat de groene kleurstof de retinale ruimte vult en weglekt in de PBS-oplossing.Oké, nu is het tijd voor de elektroporatie. Eerst maakt u de kop los. Nu gaan we de paddels elektroporeren en we willen dat de positieve paddel zich aan de ventrale zijde van de kop bevindt.We plaatsen de kop tussen de elektroden, waarbij de positieve elektrode op het ventrale oppervlak wordt geplaatst, en we oefenen druk uit om de elektrode zo stabiel te houden. Nu voeren we de electroporatie uit. U kunt zien dat er bellen ontstaan op de elektrode en op de bovenkant van de kop.Dat is alles. Nu verplaatsen we de kop naar een schaaltje met medium. Hiermee is de ex vivo retinale elektroporatie voltooid.Herhaal deze procedure voor zoveel embryo's en DNA-condities als gewenst. Nu gaan we ons voorbereiden op het cultiveren van het netvlies. Voeg na het voltooien van alle elektrodevoorbereidingen ongeveer 1,5 milliliters gezuurstofte SFM-oplossing toe aan een vierputjesplaat en bewaar deze op ijs.Gebruik één put voor elke verschillende geïnjecteerde DNA-oplossing. Draag vervolgens één geëlectroporeerde retina over naar een dissectieschaal met D-M-E-M-F 12, met de retina met de ventrale zijde naar boven gericht of de zijde tegenover het doelgebied.Gebruik een fijne pincet om een gaatje in het RPE te knijpen en te scheuren. Gebruik dit gat als startpunt om het RPE rondom de retina los te pellen. Snijd of beschadig het oog niet, aangezien dit ertoe zal leiden dat de retina tijdens de incubatie in zichzelf inklapt.Nadat het RPE is verwijderd, gebruik je een pincet om het netvlies eruit te drukken door de oogzenuw aan de basis van het netvlies samen te knijpen; laat de lens intact. Breng het netvlies over naar het geoxygeneerde SFM in de vier-wellschaal. Draai het hoofd om en herhaal de verwijdering van het netvlies voor het contralaterale oog.Voer deze stap uit voor alle geëlectroporeerde koppen en incubeer het netvlies in het gezuurstofde SFM bij 37 °C gedurende 40 tot 48 uur. Na incubatie van het volledige netvlies wordt het netvlies overgebracht van één putje met gezuurstofde SFM naar een Petri-schaaldeksel met D-M-E-M-F 12. Kies met behulp van een fluorescent dissectiemicroscoop één netvlies en visualiseer het GFP-positieve expressiegedeelte van het netvlies.Dissect vervolgens met een microscalpel en een pincet het niet GFP-positieve deel van het netvlies en gooi dit weg, zodat alleen een GFP-positief stuk netvlies overblijft. Het is nuttig om tijdens de dissectie voortdurend te wisselen tussen fluorescent licht en regulier licht. Om specifiek het GFP-positieve netvlies te selecteren, brengt u het GFP-positieve stuk netvlies over naar een putje met G-M-E-M-F 12.Herhaal deze stap voor alle retina uit één well; gebruik voor elke DNA-conditie een nieuwe petrischaal en D-M-E-M-F 12 medium om deze GFP-positieve stukken retina te dissekeren in kleinere retina-explanten voor uitplating. Gebruik een dissectiescoop om het grote stuk GFP-positieve retina met een microscalpel in kleinere explanten te snijden. De explanten moeten ongeveer 200 tot 300 micrometers lang en breed zijn.Eén GFP-positief stukje retina zou ongeveer vier tot 10 GFP-positieve retina-explantaten moeten produceren. Verzamel alle explantaten in een well met D-M-E-M-F 12. Herhaal deze stap voor alle geoogste GFP-positieve retina-regio's. Voeg, nadat alle GFP-positieve retina-explantaten zijn voorbereid, 250 microliters koude SFM plus 0,4% methylcellulose toe aan met laminine gecoate kweekschalen.Breng vervolgens vier tot acht GFP-positieve explantaten over naar de kweekschaal en gebruik de pincet om de explantaten voorzichtig in een polygoon te rangschikken, waarbij de explantaten zich halverwege het centrum en de rand van de schaal bevinden. Bepaal welke zijde van het explantaat de RGC-laag is. Dit kan door te zoeken naar RPE-kristallen, die soms aan de buitenste retinale laag vast blijven zitten, wat aangeeft dat de tegenovergestelde zijde de RGC-laag is.De RGC-zijde bevat meestal ook wat cellulair debris dat kan helpen bij het correct plaatsen van het explantaat met de RGC-laag naar beneden. Gebruik een pincet om het centrum van het explantaat stevig aan te drukken, zodat het hecht aan het glazen dekglas op de bodem van de kweekschaal. Nadat alle X explantaten op een kweekschaal zijn geplaatst, worden deze overgebracht naar een incubator van 37 °C.Retinale X-explantaten vertonen overvloedige axonale groei na 24 uur en kunnen worden gebruikt voor talrijke in vitro-assays, waarna ze gedurende 30 minuten zijn gefixeerd met 4% PFA. Vervolgens vindt er immuunbehandeling plaats voor de border-assay. Draag 4G FP-positieve explantaten over naar een schaal die is voorbereid voor de border-assay.Plaats de X explantaten in een rechte lijn die de fluorescente rand van uw gewenste substraat benadert. Gebruik onder een fluorescent dissectiemicroscoop een pincet om de EXPLAN te plaatsen, zodat ze zich op ongeveer 50 tot 150 micrometers van de fluorescente rand bevinden. Wissel hierbij tussen de twee fluorescentiekanalen om zowel het groene explantaat als de rode rand te visualiseren.Incubeer de schalen vervolgens 24 uur bij 37 °C, zodat de axonen van de RGCten voldoende tijd hebben om het substraat aan de rand te bereiken. De X explan kan vervolgens gedurende 30 minuten worden gefixeerd in 4% PFA, gevolgd door immunokleuring. Na in utero retinale electroporatie.Retinale hole mounts kunnen worden geprepareerd om GFP-positieve RGC's in de retina te visualiseren terwijl deze semi-intact blijven. Visuele systemen kunnen worden geprepareerd om GFP-positieve axonen in de gehele nervus opticus, het chiasma opticum en het tractus opticus te visualiseren. Als alternatief kunnen frontale cryosecties worden gemaakt door de retina en het RGC-pad om GFP-positieve RGC-cellichamen in de retina en axonen in de nervus opticus, het chiasma en het tractus te visualiseren en te analyseren.Alle axonen van het netvlies worden gevisualiseerd met neurofilamentkleuring. Daarnaast kan in utero elektroporatie worden gebruikt om de targeting van RGC-axonen in de nucleus geniculatus lateralis (LGN) te bestuderen door pups te oogsten tussen P4 en P10. Bij P8 zijn GFP-positieve axonen zichtbaar in de LGN, waarbij CTB LOR 5 94 (rood kanaal) in het ipsilaterale netvlies is geïnjecteerd en CTB 6 47 (blauw kanaal) in het contralaterale netvlies om de volledige RGC-projectie te labelen na ex vivo elektroporatie en het uitplaten van netvliesimplantaten.Een subset van RGC-axonen is RGFP-positief en kan duidelijk worden gevisualiseerd bij zowel lage als hoge vergroting, zoals respectievelijk in de bovenste en onderste afbeeldingen te zien is. De respons van GFP-positieve axonen kan worden geanalyseerd door XS te plaatsen naast de grenzen van verschillende substraten, hier in blauw weergegeven. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe genen in het embryonale spiegelbeeldnetvlies kunnen worden geïntroduceerd door gebruik te maken van in utero en ex vivo retinale electroporatie.Hoewel we onze analyse hebben gericht op de axonale geleiding van het chiasma opticum, kan deze techniek nuttig zijn voor onderzoekers die zich bezighouden met de differentiatie van RGC's, dendritische morfologie en elektrofysiologische eigenschappen van retinale ganglioncellen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om schade aan het netvlies te minimaliseren tijdens het injecteren van het DNA en om de embryo's gedurende het gehele experiment gehydrateerd te houden met PBS. Dat is alles.Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

in-utero-ex-vivo-electroporation-for-gene-expression-mouse-retinal

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Transfectie van Mouse retinale ganglioncellen door In vivo Elektroporatie

Een methode voor de integratie van plasmide DNA in het netvlies van muizen cellen voor het verrichten van een winst-of verlies van functie...

In vivo Elektroporatie van de ontwikkelingslanden Mouse Retina

In utero elektroporatie zorgt voor een snelle genafgifte in een ruimtelijk-temporeel en gecontroleerde wijze in de zich ontwikkelende centrale zenuwstelsel (CZS). Hier beschrijven we een groot aanpassingsvermogen in utero electroporatie protocol dat gebruikt kan worden om expressie constructen te leveren in meerdere embryonale CNS domeinen, waaronder de telencephalon, diencephalon en netvlies.

Efficiënte gen delivery in meerdere CNS Gebieden Het gebruik van In Utero Elektroporatie

Een genoverdracht methode in de zich ontwikkelende hersenen van muizen wordt beschreven door middel van een unieke chirurgische methode en de speciale vorm van de elektroden. Deze unieke techniek maakt het mogelijk transfectie van plasmide DNA tijdelijk en ruimtelijk, die veel neurowetenschappers zullen helpen bij het bestuderen van ontwikkeling van de hersenen.

Muis In Utero Elektroporatie: Gecontroleerde spatiotemporele Gene Transfectie

Het algemene doel van deze video is te laten zien hoe je doelgericht retinale injectie uit te voeren...

In Ovo Elektroporatie in Embryonale Chick Retina

Deze studie beschrijft de ontwikkeling van...

In vitro Elektroporatie van de Tweede Rhombic Lip van Midgestation muizenembryo&#39;s

Ondanks de functionele en medische belang van de...

Genetische Manipulatie van de muis Ontwikkelen Hypothalamus via<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporatie

Deze procedure laat zien hoe interneuronen in de zich ontwikkelende voorhersenen van muizen kunnen worden gericht door middel van in utero elektroporatie. Deze techniek was bijzonder efficiënt om selectieve genexpressie in interneuron-subtypen te bereiken die bestemd zijn voor de oppervlakkige lagen van de cortex.

Subtype-selectieve Electroporatie van corticale Interneurons

Embryonale kuiken netvlies celculturen vormen waardevolle hulpmiddelen voor de studie van fotoreceptor biologie. We hebben een efficiënte genoverdracht techniek gebaseerd op ex ovo plasmide elektroporatie van de netvliezen voorafgaand aan cultuur ontwikkeld. Deze techniek aanzienlijk vergroot transfectie-efficiënties op dit moment beschikbare protocollen, waardoor genetische manipulatie mogelijk voor dit systeem.

Efficiënte Gene Transfer in Chick netvliezen voor primaire cel Cultuurwetenschappen: An Ex-ovo Elektroporatie Aanpak

We hebben een nieuwe benadering van functieverlies ontwikkeld die de introductie en genomische integratie van kunstmatige micro-RNA-sequenties in kuikenembryo's omvat door gebruik te maken van ovo-elektroporatie en het Tol2-transposonsysteem. Deze techniek biedt een robuuste en stabiele gen knockdown methodologie voor studies van de genfunctie tijdens de ontwikkeling.

Verlies-van-functie benadering in het embryonale kuiken netvlies door gebruik te maken van Tol2 transposon-gemedieerde transgene expressie van kunstmatige microRNA's

Leer in utero en ex vivo elektroporatie voor genexpressie in muizen retinale ganglioncellen. Deze technieken helpen onderzoekers de ontwikkeling en functie van visuele neuronen te bestuderen.

In utero en ex vivo Elektroporatie voor Gene Expression Mouse in retinale ganglioncellen

Meer video's verkennen