Growth Factor-Coated Bead Plaatsing op Dorsale voorhersenen Explantaten

Dit zijn de eerste soort kralen die ik zal gebruiken. Het zijn de blauwe gelkralen. Ze zijn zacht.

Daarom moet ik aan het uiteinde van een mondpipet een glazen pipet gebruiken om deze kralen op Xs te plaatsen. Het tweede type kralen dat ik zal demonstreren zijn heparine-acrylaatkralen. Dit is een stug type kraal, en ik zal deze kralen met een wolfraamnaald op X-explantaten plaatsen. Dit zijn de glazen capillaire buisjes die ik eerst met de bunsenbrander zal smelten.

Vervolgens trek ik ze uit elkaar om een fijnere tip te creëren. Ik houd de capillaire buis in het midden van de vlam en rol deze terwijl de buis smelt. Ik kan voelen dat deze zacht wordt.

Ik haal het uit de vlam en trek het vervolgens uit. Ik ga met deze pen met diamanten punt een lijn in de capillaire buis etsen, zodat ik een mooie rechte snede kan maken. Daarna zal ik de uiteinden vlampolijsten om ze schoon te maken.

Ik ga de capillair door de vlam halen om het uiteinde te polijsten en de opening te verkleinen, zodat er een kraal gevangen kan worden in plaats van dat de kraal door de capillair heen gaat. Een belangrijk aandachtspunt is dat u de capillair niet te lang in de vlam mag houden. Het is een zeer snelle beweging, anders zal de buis dichtsmelten.

Ik maak er meestal meerdere, omdat bij veel van deze pijpetjes de punt door de vlam wordt dichtgesmolten. Dit is lastig te controleren, dus maak je er gewoon meerdere. Dit is een voorbeeld van een pijpetje waarbij de punt is dichtgesmolten.

Dit is een voorbeeld van een goede pipette. Ik heb 250 µL van de agel-beads in deze einor-buis gepipetteerd en ik ga ze vijf keer wassen met 1 mL PBS om de azi-oplossing waarin ze waren geweekt te verwijderen. Ik wacht ongeveer drie minuten zodat de beads kunnen bezinken en daarna zuig ik het overtollige PBS af en herhaal ik dit nog vier keer.

De kraaltjes zijn nog niet helemaal bezonken, maar zodra de kraaltjes zijn bezonken, zal ik het overtollige PBS wegzuigen en dit vier keer herhalen. Aan het einde voeg ik 300 µL PBS toe en begin ik met de kraaltjes te werken. Dit is een standaard mondpipette en ik zal de capillaire die ik heb getrokken er ongeveer tot een derde van de hoogte in steken.

Vul eerst de pipetten met PBS. Meestal gebeurt dit door capillaire werking. Dit is een dop van een kweekschaal van 30 millimeter waarop ik een druppel blauwe kralen heb geplaatst.

En daarnaast bevindt zich een kleine druppel PBS. In deze schaal bevindt zich een druppel van 5 µL eiwitoplossing. In dit geval is dat B and P four, maar u kunt een eiwit naar keuze toevoegen met behulp van de micropipet.

Ik ga een kraal overbrengen vanuit deze blauwe cirkel hier en deze één keer spoelen in de druppel PBS. Daarna neem ik de kraal met de mondpipet, plaats deze in de druppel eiwitoplossing en incubeer deze ofwel bij kamertemperatuur gedurende ongeveer een uur, of bij vier graden gedurende enkele uren. Hier ziet u een verzameling kralen in PBS en ik moet kralen selecteren die de juiste maat hebben.

Als ze te klein zijn, glijden ze simpelweg door de mondpipet. Ze moeten precies aan het uiteinde blijven zitten. Zoals u nu ziet, heb ik daar een paar kraaltjes gekozen: drie grotere kraaltjes en drie kleinere kraaltjes.

Ik zal de grotere kraaltjes in het experiment gebruiken. Ik ga nu een groot kraaltje van de PBS-druppel naar de druppel met eiwitoplossing overbrengen. Om dat te doen, trek ik mijn tong voorzichtig terug uit de mondpipet.

Het is geen zuigende beweging, maar bedoeld om enige negatieve druk uit te oefenen. Vervolgens breng ik het over en plaats ik mijn tong weer over de mondopening. De pijpkop, niet blazen, maar gewoon enige positieve druk toevoegen om de korrel van het uiteinde af te duwen.

Ik heb nu vijf kraaltjes in de eiwitoplossingsdruppel en ik zal deze enkele uren incuberen bij vier graden, of alternatief een half uur tot een uur bij kamertemperatuur. Dit is de kweekschaal die het membraan bevat dat in het medium drijft, samen met de eierstokken die ik al heb gedissecteerd. Ik ga nu met de tip van mijn pipet wat van het medium opzuigen.

Ik ga de kralen slechts één keer afspoelen in een druppel medium vlak voordat ik de kraal op het X-vlak plaats. Dit zijn de wolfraamnaalden die ik zal gebruiken om de acrylkralen op te pakken en te plaatsen. Dit is de wolfraamnaald en deze bevindt zich nu in de houder.

En dit zijn enkele fijne pincetten. Onder een hoek van 45 graden. Ik zal mijn wolfraamnaald-pincet gebruiken om een kraal uit dit bad met PBS te tillen en de kraal over te brengen naar een druppel eiwitoplossing.

Zoals ik deed met de alginaatkraaljes. Net als bij de alginaatkraaljes heb ik deze acrylaatkraaljes vijf keer gespoeld in PBS en een druppel overgebracht naar deze plaat. Vervolgens gebruik ik mijn wolfraamnaald in een pincet om een kraalje over te brengen naar een druppel proteïne en incubeer ik deze op dezelfde wijze als ik bij de gelkraaljes deed.

Het gaat hier om het optillen van de kraal. Ik houd mijn rechterhand stevig tegen de tafel en gebruik mijn linkerwijsvinger om de naald te stabiliseren terwijl ik in de vloeistof ga; ik raak een kraal lichtjes aan met de naald en til deze langzaam uit de vloeistof. Soms valt de kraal van de naald af, in dat geval probeert u het simpelweg opnieuw met een andere kraal.

Ik gebruik nu met mijn linkerhand de pincet onder een hoek van 45 graden. Met de punten naar beneden raak ik de kraal en de naald aan de vloeistof. Gebruik de punt van de pincet om deze voorzichtig weg te drukken.

Ik heb nu vijf beads in eiwit. Oké, met mijn rechterhand houd ik de wolfraamnaald in de bead, en met mijn linkerhand gebruik ik opnieuw mijn pincet met de punt naar beneden op dezelfde manier als waarmee ik ze van de vier afduwde. Ik doe dit hier opnieuw op de x explan. Incubeer bij 37 °C en de tijd is afhankelijk van de specifieke assay.