Name: Elektrofysiologische opname in de Drosophila Embryo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-21T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Leer elektrofysiologische opname in Drosophila-embryo's voor neurowetenschap en ontwikkelingsbiologie. Deze methode karakteriseert synaptogenese aan neuromusculaire en centrale synapsen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

KB wordt ondersteund door NIH subsidie ​​GM54544.

De auteurs hebben niets te melden.

Elektrofysiologische opname van Drosophila embryo&#39;s moet handmatig manipulatie en dissectie. De gezondheid van de voorbereiding, en de daaruit voortvloeiende de kwaliteit van de opnames, hangt af van een in staat om snel en netjes voor te bereiden de kwetsbare embryonale weefsels voor het opnemen, en voer vervolgens het experiment. Onderzoekers moet bedreven zijn in zowel de embryonale ontledingen en patch clamp electrofysiologie voordat je probeert om zowel aan te pakken tegelijk. <p class="jove_conten...

elektrofysiologische opname in de drosophila embryo

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Drosophila is een vooraanstaande genetisch model voor de studie van zowel de embryonale ontwikkeling en functionele neurowetenschappen. Traditioneel worden deze velden geïsoleerd nogal van elkaar, met grotendeels onafhankelijke geschiedenis en wetenschappelijke gemeenschappen. Echter, de interface tussen deze vaak uiteenlopende terreinen is de ontwikkelingsprogramma&#39;s ten grondslag liggen aan de verwerving van functionele elektrische signaal-eigenschappen en de differentiatie van de functionele chemische synapsen tijdens de laatste fasen van neurale circuit formatie. Deze interface is een uitermate belangrijk gebied voor onderzoek. In Drosophila, deze fasen van de functionele ontwikkeling optreden tijdens een periode van &lt;8 uur (bij 25 ° C) tijdens het laatste derde deel van de embryogenese. Deze late ontwikkelingsfase werd lang beschouwd als hardnekkige het onderzoek als gevolg van de afzetting van een zware, ondoordringbare epidermale cuticula. Een doorbraak van tevoren was de toepassing van de water-polymeriseren chirurgische lijm die lokaal kan worden toegepast op de cuticula om gecontroleerde dissectie van de laat-stadium embryo&#39;s mogelijk te maken. Met een dorsale longitudinale incisie, kan het embryo te plat, waardoor de ventrale zenuw snoer en de lichaamswand spieren aan experimenteel onderzoek. Whole-cell patch-clamp technieken kunnen dan worden gebruikt om op te nemen van individueel herkenbare neuronen en somatische spieren. Deze opname configuraties zijn gebruikt om het uiterlijk en de rijping van de ionische stromen en actiepotentiaal voortplanting in zowel neuronen en spieren te volgen. Genetische mutanten die deze elektrische eigenschappen werden gekenmerkt om de moleculaire samenstelling van ionenkanalen en de bijbehorende signalering complexen onthullen, en om de verkenning van de moleculaire mechanismen van functionele differentiatie te beginnen. Een bijzondere focus is de montage van synaptische verbindingen, zowel in het centrale zenuwstelsel en periferie. De glutamaat neuromusculaire junctie (NMJ) is het meest toegankelijk is voor een combinatie van optische beeldvorming en elektrofysiologische opname. Een glas zuig elektrode wordt gebruikt om de perifere zenuw te stimuleren, met prikkelende knooppunt huidige (EJC) opnames gemaakt in de voltage-opgespannen spieren. Deze opname configuratie is gebruikt om de functionele differentiatie van de synaps grafiek en het uiterlijk en de rijping van presynaptische glutamaat afgifte eigenschappen track. Daarnaast kunnen postsynaptische eigenschappen onafhankelijk van elkaar worden getest via iontoforetische of druk de toepassing van glutamaat rechtstreeks naar de spier oppervlak, het uiterlijk en de rijping van de glutamaat receptor velden te meten. Zo kunnen zowel pre-en postsynaptische elementen afzonderlijk of in combinatie worden gevolgd tijdens de embryonale synaptogenese. Dit systeem is zwaar gebruikt voor het isoleren en karakteriseren van genetische mutanten dat embryonale synapsvorming aantasten, en dus onthullen de moleculaire mechanismen voor de specificatie en differentiatie van synaps verbindingen en functionele synaptische signalering eigenschappen.

Elektrofysiologische opnamen van<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo&#39;s laten analyses van de ontwikkeling van spier-en neuron elektrische eigenschappen, evenals karakteriseren van functionele synaptogenese op de glutamaat neuromusculaire verbinding en centrale cholinerge en GABA-erge synapsen.

Elektrofysiologische opname in de Drosophila Embryo

*Drosophila* is een vooraanstaand genetisch model voor de studie van zowel de embryonale ontwikkeling als de functionele neurowetenschappen. Traditioneel zijn deze vakgebieden vrij ...

Elektrofysiologische registraties van spieren en motorneuronen kunnen worden verkregen uit een correct geprepareerde lichaamswand van een oph-embryo. Spieren 6, 7, 12 of 13 kunnen eenvoudig worden geregistreerd met de whole-cell registratieconfiguratie, en robuuste miniatuuramplitude-stromen kunnen worden gemeten nadat een giga-ohm seal is bereikt om registraties van de neuromusculaire overgang uit te voeren. Een zuigelektrode kan worden gebruikt om een motorische zenuw nabij het uitgangspunt van het CZS op te zuigen en presynaptische stimulatie toe te dienen, terwijl whole-cell stromen worden gemeten in de postsynaptische spier.Als alternatief kan een pipet worden gebruikt om exciterende neurotransmitters nabij de registratie-elektrode toe te dienen via iontoforese of drukinjectie. Hoi, ik ben Ton van het laboratorium van Dave in de afdeling Biological Sciences aan de University of Illinois at Chicago. Vandaag laat ik u zien hoe u elektrofysiologische registraties uitvoert bij de neuromusculaire junctie in het salate-stadium van het embryo en bij de centrale neuronen.Deze procedures gebruiken we om de functie en ontwikkeling van het neuromusculaire systeem van de joof te bestuderen. Deze technieken werden oorspronkelijk ontwikkeld door Kendall Brody. Ze zijn doorgegeven aan David Fit Stone en vervolgens aan mij; vandaag geef ik ze aan u door.Voor deze procedure moeten embryo's vooraf correct worden geoogst en gedisseceerd. Om te zien hoe dit wordt gedaan, bekijk de bijbehorende Jo-publicatie van Brody Featherstone en Chen Electrophysiological. Opnames van embryonale spieren en neuronen van Jossa maken gebruik van standaard whole-cell patch-clamptechnieken. Eerst wordt het gedisseceerde embryo in een kleine opnamekamer van plexiglas geplaatst.Het gebied voor fysiologische registraties is elektrisch afgeschermd door een kooi van Faraday en is geplaatst op een trillingsgedempte tafel. De kamer wordt bekeken onder doorlatend licht met een rechtopstaande samengestelde microscoop met KY-optiek en een 40 x waterimmersie-objectief met een lange werkafstand. Registraties worden doorgaans uitgevoerd onder kamertemperatuur, omdat het patchclampen van oph-spieren steeds moeilijker wordt naarmate de temperatuur stijgt.De registratie-elektrode moet een uiteindelijke weerstand hebben van vijf tot 10 mega ohm en hittegepolijst zijn tot een binnendiameter van ongeveer één micrometer. Bij de punt worden de registratie-elektroden opgevuld met een fysiologische oplossing die kaliumchloride en sucrose bevat. Een zilverchloride-aardingsdraad wordt geplaatst in het bad met standaard zoutoplossing, die ook wordt gebruikt bij de dissectie van embryo's.Signalen worden versterkt met een patchclamp-versterker, gefilterd en digitaal opgeslagen voor latere analyse. Elk systeem dat geschikt is voor patchclamp-experimenten kan worden gebruikt, zoals deze apparatuur en software van Axon. Cellen uit drie verschillende weefsels in het embryonale zenuwstelsel kunnen nu worden gestimuleerd en geregistreerd vanuit de spieren, neuronen bij de NMJ en centrale motorneuronen.Met deze embryo-preparatie kan voor de meeste experimenten elke embryonale spier worden geregistreerd. Focus op de groep van vier longitudinale ventrale spieren 6, 7, 12 en 13, in het bijzonder spier zes in het voorste abdomen, A2 tot A3, om registraties uit de dorsale spieren te verkrijgen. Het embryo moet met de dorsale zijde naar beneden worden vastgelijmd en bij jonge embryo's langs de ventrale middellijn worden gedisseceerd.Voor de registratie van spieren is geen enzymatische behandeling nodig. Bij latere embryo's met ontwikkelde cuticula's ontwikkelt zich echter ook een spieromhulsel voorafgaand aan de patch-registratie. Dit omhulsel moet worden verwijderd door kortstondige onderdompeling in een collagenase.De meeste opnames worden uitgevoerd in de whole-cell configuratie, die eenvoudig vanuit de cell-attached toestand wordt bereikt door middel van lichte zuigkracht of een elektrische puls. Dat is een 'zap'. Het is een elektrische stimulatie om, zoals bekend, de celmembraan te ruptureren.Bij een whole-cell configuratie zijn de seal-weerstanden op de spier doorgaans groter dan één giga ohm; whole-cell stromen worden gewoonlijk minder dan drie minuten na de vorming van de seal verkregen. De serieweerstand is in de meeste gevallen aanzienlijk verhoogd en cellen kunnen een toename van de lekstroom ontwikkelen. Voor patchclamping moeten embryo's ten minste 14 uur oud zijn; in eerdere ontwikkelingsstadiaUitgebreide elektrische koppeling tussen myotubes maakt voltage clamping onnauwkeurig voor het maken van patchclamp-registraties van spiervezels. Typische rustpotentialen liggen tussen -60 en -80 millivolts, waarbij voltage clamp- en current clamp-methoden kunnen worden toegepast. Succesvolle whole-cell registraties bij -60 millivolts gaan gepaard met robuuste spontane synaptische stromen die variëren van enkele tot enkele honderden picoamps, zoals hier getoond.Grote NMJ-stromen kunnen worden opgewekt door de motorische zenuw te stimuleren met zuigelektroden. Deze kunnen worden getrokken uit verschillende met vezels gevulde glazen elektroden en moeten vlamgepolijst worden om de gewenste configuratie te bereiken; gebruik voorzichtig zuigen met de pipet om een klein segment van de betreffende segmentale motorische zenuw in te trekken nabij het uittreedpunt van het CZS. Om een nauwe afsluiting te vormen, werkt korte stimulatie het beste met een experimenteel bepaalde intensiteit, gewoonlijk tussen één en vijf volt. Betrouwbare stimulatie wordt bereikt door de stimulussterkte één tot twee volt boven de experimenteel bepaalde drempelwaarde in te stellen.Postsynaptische glutamaatreceptoren van de NMJ kunnen worden geactiveerd door de neurotransmitter glutamaat toe te dienen; geladen moleculen zoals glutamaat kunnen via iontoforese naar de NMJ worden getransporteerd. Pipetten met een hoge weerstand worden gebruikt om receptoren in kaart te brengen, terwijl pipetten met een lagere weerstand worden gebruikt om de totale respons van de glutamaatreceptoren te schatten. Ionofoor-pipetten worden gevuld met een 100 millimolaire L-glutamaatoplossing.Om L-glutamaat vrij te geven, gebruikt u een korte puls negatieve stroom met een kleine positieve tegenstroom om lekkage te voorkomen; glutamaat of elk ongeladen molecuul kan ook via drukinjectie aan de NMJ worden toegediend. Gebruik voor drukinjectie één tot twee millimolaire glutamaat en oefen een uitwaartse kracht van 5 tot 10 PSI uit op de pipet met behulp van een pico spritzer.NMJ-stroomen opgewekt door zenuwstimulatie of glutamaat-applicatie bij -60 mV bedragen doorgaans 1500 tot 2000 pA. Veel embryonale neuronen kunnen individueel worden geïdentificeerd op basis van de positie van het soma en de projectiemorfologie. De meeste experimentele registraties hebben zich geconcentreerd op een groep van vijf oppervlakkige dorsale neuronen binnen het embryonale ventrale zenuwstreng.Om registraties van deze neuronen te maken, moet de neuromaschede van het ventrale zenuwstrengje worden verwijderd met een korte, lokale behandeling met protease; de cellichamen worden ontscheed door 0,5 tot 1% protease toe te dienen. Zuig tijdens de registratie met een patchpipet met een grote diameter het schedemateriaal in de pipet die de protease bevat. Voorzichtige mondactie kan worden gebruikt om de schede herhaaldelijk in en uit de pipet te bewegen. Na één tot twee minuten zal de schede scheuren.De cellen zijn nu blootgelegd voor whole-cell patch clamping. Bij dit registratieparadigma is het niet nodig dat de zoutoplossing wordt gecirculeerd of verwarmd. De externe registratie-zoutoplossing in deze preparatie verschilt van die welke wordt gebruikt bij registraties van spieren.De patchpipet kan worden gevuld met Lucifer yellow om later de positie en morfologie van de patchcel te visualiseren. Hier is een centraal motorneuron dat Lucifer yellow heeft opgenomen en is gevisualiseerd met fluorescentiemicroscopie. Whole-cell voltage clamp-metingen worden uitgevoerd bij rustpotentialen van -60 mV bij 18 °C.Current clamp-metingen zijn ook mogelijk. Neuronen kunnen worden gestimuleerd met de neurotransmitters acetylcholine of gaba. Deze worden bij het cellichaam toegediend via iontoforese of drukejectie, zoals bij metingen aan njs.Zodra een whole-cell verbinding is tot stand gebracht, worden eerst spontane stromen waargenomen. Dit is één minuut aan ruwe data verkregen van embryonale ventrale longitudinale spier zes, patch-geclamp op -60 millivolt in afwezigheid van stimulatie. Een gezonde preparatie vertoont doorgaans robuuste spontane synaptische activiteit, hier weergegeven door de vele neerwaartse stroomafbuigingen.Hier zijn gegevens van dezelfde spier waarbij stimulatie is toegepast met een zuigpipet op de motorische zenuw die naar die spier leidt. Dit resulteerde in meerdere neerwaartse afbuigingen van de stroom, die de opgewekte junctie-stroomen of e jcs vertegenwoordigen. Dit zijn gegevens van dezelfde spier, gestimuleerd door 1 millimolar glutamaat toegepast via drukejectie.Het glutamaat opent receptoren, wat leidt tot grote neerwaartse deflecties. In de stroom worden twee sporen getoond die twee opeenvolgende toedieningen van glutamaat vertegenwoordigen. Ik heb u zojuist laten zien hoe u elektrofysiologische registraties uitvoert bij Xenopus-embryo's in een laat stadium; voor elektrofysiologische registraties worden over het algemeen standaard patch-clamptechnieken gebruikt, die we hier niet in detail kunnen beschrijven.Ideaal gezien heeft iedereen die opnames wil maken van uw zachte embryo's al ervaring opgedaan met patchclamp-technieken met behulp van een eenvoudigere preparatie. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

electrophysiological-recording-in-the-drosophila-embryo

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze video toont de procedure voor het isoleren van hele hersenen van volwassen Drosophila als voorbereiding voor het opnemen van enkele neuronen met behulp van standaard hele cel-technologie. Het bevat beelden van GFP gelabelde cellen en neuronen bekeken tijdens het opnemen.

Hele Cell Opnamen van Brain van Adult Drosophila

Hier beschrijven we elektrofysiologische methoden voor het meten van synaptische transmissie bij de neuromusculaire junctie van Drosophila larve. Evoked release wordt kunstmatig geïnitieerd door het stimuleren van de motorische neuron axonen, en de transmissie door middel van de NMJ kan worden gemeten door de postsynaptische respons opgeroepen in de spier.

Elektrofysiologische methoden voor opname Synaptic Potentials van de NMJ van Drosophila Larven

Deze techniek onthult de Drosophila embryonale neuromusculature voor immunohistochemie of elektrofysiologische opname. Het is handig voor het bestuderen van vroege gebeurtenissen in neuromusculaire ontwikkeling of het uitvoeren van elektrofysiologie in mutanten die niet kan uitkomen.

Oogsten en voorbereiden Drosophila Embryo&#39;s voor elektrofysiologische opname en andere procedures

De Giant Fiber System is een eenvoudige neuronale circuit van de...

Elektrofysiologische opnames van de Giant Fiber Pathway van D. melanogaster</em

This video outlines the protocol for electrophysiological recording of photoreceptor activity in the eye of an immobilized Drosophila, enabling precise measurement of voltage changes in response to light stimuli.

Electrophysiological Recording of Voltage Responses of Drosophila Retinal Photoreceptors to Light Stimuli

The video demonstrates the extracellular recording of neuronal activity from the central nervous system (CNS) of Drosophila larvae. The transected CNS is positioned in a recording chamber, and the electrical activity from a descending nerve is recorded to establish the baseline firing frequency. A test agent is then introduced, and the change in firing frequency is recorded to determine the agent's excitatory or inhibitory effect.

Extracellular Recording of Electrical Activity in the Drosophila Central Nervous System

Dit protocol beschrijft extracellulaire van de actiepotentiaal reacties afgevuurd door labellar smaak neuronen in Drosophila.

Elektrofysiologische Opnemen vanaf<em&gt; Drosophila</em&gt; Labellar Proef sensilla

Scherpe micro-elektroden maken nauwkeurige elektrofysiologische karakterisering van fotoreceptor en visuele interneuron-output in levende Drosophila mogelijk. Hier laten we zien hoe je deze methode kunt gebruiken om hoogwaardige spanningsresponsen van individuele cellen op gecontroleerde lichtstimulatie op te nemen. Deze methode is ideaal voor het bestuderen van neurale informatieverwerking in samengestelde ogen van insecten.

Elektrofysiologische Methode voor opname intracellulaire Voltage Reacties van<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotoreceptoren en Interneurons naar Light Stimuli<em&gt; In Vivo</em

Whole-cell opnames van Drosophila melanogaster fotoreceptoren maken het mogelijk om spontaan donkere stoten, kwantumstoten, macroscopische reacties op licht en spanningsrelaties onder verschillende omstandigheden te meten. In combinatie met D. melanogaster genetische manipulatie instrumenten, deze methode maakt het mogelijk om de alomtegenwoordige inositol-lipide signalering weg en zijn doel, het TRP kanaal te onderzoeken.

Elektrofysiologische methode voor opname van volledige spanningsklemmen van<em&gt; Drosophila</em&gt; Photoreceptors

Dit protocol beschrijft een methode om vast te leggen van de aflopende elektrische activiteit van het centrale zenuwstelsel van Drosophila melanogaster zodat de kosten-efficiënte en handige testen van farmacologische agenten, genetische mutaties van neurale eiwitten, en/of de rol van onontgonnen fysiologische trajecten.

Elektrofysiologische opname van de activiteit van het centrale zenuwstelsel van derde-Instar Drosophila Melanogaster

Het doel van dit protocol is om het ontwerp en de prestaties van in vivo experimenten in Drosophila melanogaster te schetsen om de functionele gevolgen van zeldzame genvarianten in verband met menselijke ziekten te beoordelen.

In vivo functionele studie van ziekten-geassocieerde zeldzame menselijke varianten met behulp van Drosophila

Leer elektrofysiologische opname in Drosophila-embryo's voor neurowetenschap en ontwikkelingsbiologie. Deze methode karakteriseert synaptogenese aan neuromusculaire en centrale synapsen.

Elektrofysiologische opname in de Drosophila Embryo

Meer video's verkennen