Name: Kleuring van eiwitten in Gels met Coomassie G-250 zonder organisch oplosmiddel en azijnzuur (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-14T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Leer een veilige methode voor eiwitkleuring in polyacrylamidegels met Coomassie G-250 zonder organische oplosmiddelen. Dit protocol biedt snelle visualisatie van eiwitbanden na elektroforese.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen graag de technische bijstand van Ines Racke erkennen.

Deel 1: Voorbereiding van de CBB kleuroplossing <ol><li> 60-80 mg van het CBB G-250 worden opgelost in 1 liter dubbelgedestilleerd water door roeren gedurende 2-4 uur. Tot slot, is 3 ml geconcentreerd HCl toegevoegd aan de donkerblauwe oplossing onder roeren nog een minuut en in het donker bewaard voor later gebruik. De oplossing kan worden opgeslagen voor weken tot enkele maanden zonder verlies van de vlekken efficiëntie. </li><li> Geconcentreerde HCl moeten worden behandeld met de gebruikelijke zorg und gebruikt onder een zuurkast. De uiteindelijke oplossing wordt bij ongeveer pH 2, dus handschoenen moeten worden gebruikt en elk contact met de huid moet worden vermeden. </li></ol> Deel 2: SDS-PAGE <ol><li> Juiste hoeveelheden van eiwit monsters worden gemengd met het laden van buffer tot een uiteindelijke concentratie van 1 x laadbuffer. We maken gebruik van 2x laadbuffer met 125mm Tris/H3PO4 (pH 7,5 bij 25 ° C), 2 mM EDTA, 4% SDS, 200mm DTT, 0,02% broomfenolblauw en 50% glycerol. Overige laad-buffers voor SDS-PAGE kan worden gebruikt. </li><li> Eiwit monsters worden verhit gedurende ongeveer 5 minuten voor het laden. Ondertussen wordt de gel electroforese kamer klaar voor de run. We maken gebruik van prefab 4-12% NuPAGE © Bis-Tris gels (Invitrogen) in een XCell SureLock ® Mini-Cell (Invitrogen) met MES-buffer als de lopende buffer, maar een andere gel en electroforese systeem kan worden gebruikt. </li><li> Eiwit monsters worden geladen op de gel en electroforese lopen gedurende 50 min bij 220V. </li></ol> Deel 3: kleuring van het gel <ol><li> De gel cassette is gedemonteerd en de gel geplaatst in een doos voor de volgende wasstappen. </li><li> Ongeveer 100 ml dubbelgedestilleerd water wordt toegevoegd aan de gel en verwarmd in de magnetron gedurende 30 seconden. De verwarming moet worden gestopt voordat koken optreedt. De doos met de gel wordt vervolgens geplaatst op een shaker voor 3-5 minuten. en dit wasstap wordt tweemaal herhaald met vers water. </li><li> Genoeg CBB kleuroplossing wordt toegevoegd aan de gel in de doos en de doos opgewarmd in de magnetron voor 10 sec te dekken. zonder te koken. De doos met de gel wordt vervolgens geplaatst op een shaker voor het afwerken van de kleuring. Reeds na 1 minuut, kan eiwitbanden worden waargenomen, na 15-30 minuten. de kleuring sterk genoeg is in de meeste gevallen. </li><li> De kleuroplossing wordt afgegoten en 50-100 ml dubbelgedestilleerd water wordt toegevoegd om verder destain de lichtblauwe achtergrond van de gel op een shaker. Het water kan worden vervangen door vers water voor de verdere ontkleuren wordt indien nodig. </li><li> De gel kan worden gescand, gefotografeerd of gedroogd voor langdurige opslag </li></ol> Deel 4: representatieve resultaten: Zie Fig. 1 voor een goed gekleurde gel volgens de beschreven procedure. Zie Fig. 2 voor een gel die niet is lang genoeg gewassen voor de kleuring en resterende SDS remt efficiënt vlekken. Merk op dat de marker rijstroken (*) dezelfde hoeveelheid van merker eiwitten bevatten. <img src="/files/ftp_upload/1350/Fig1.png" alt="" /> Fig. 1: Representatieve gel gekleurd na het laden monsters van een eiwit zuivering (*: moleculair gewicht marker). <img src="/files/ftp_upload/1350/Fig2.png" alt="" /> Fig. 2: CBB gekleurde gel die niet lang genoeg gewassen voor CBB vlekken. Het eiwit bands verschijnen zwakker (merk op dat de marker rijstrook * evenveel eiwit als in Fig. 1 bevat).

<ol><li>Process for fast visualization of protein. US patent. , 6319720 (B1) (2001).</li>
<li>Solution for fast visualization of protein. US patent. , 2001046709 (A1) (2001).</li>
</ol>

Geen conflicterende belangen. De hierboven beschreven procedure werd oorspronkelijk gepubliceerd in een octrooiaanvraag door EM Wondrak (zie Ref.).

<ul><li> Het wassen stappen zijn cruciaal voor de efficiënte kleuren van de eiwitten. Een verminderde wastijd minder dan 2 min of verminderd volume van het water (&lt;50 ml) kan resulteren in een lichtblauw eiwitbanden, waarschijnlijk als gevolg van hogere hoeveelheden van de resterende SDS in de gel. </li><li> Als de eiwitten zullen worden geanalyseerd door massaspectrometrie, de verwarming stappen in de magnetron moet worden overgeslagen, is de tijd voor het wassen van de gel uitgebreid tot ongeveer 10 min in elke stap en de kleuring tijd ver...

<table><tbody><tr><td>Coomassie Brilliant Blue G-250</td><td>AppliChem</td><td>A3480</td><td>elke andere CBB G-250 kan ook worden gebruikt</td></tr><tr><td>Geconcentreerd HCl</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kleuring van eiwitten in gels met coomassie g-250 zonder organisch oplosmiddel en azijnzuur

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In de klassieke eiwitkleuring protocollen met behulp van Coomassie Brilliant Blue (CBB), oplossingen met een hoog gehalte aan giftige en brandbare organische oplosmiddelen (methanol, ethanol of 2-propanol) en azijnzuur worden gebruikt voor fixatie, kleuren en ontkleuren van eiwitten in een gel na SDS -PAGE. Het versnellen van de procedure, het verwarmen van de kleuroplossing in de magnetron voor een korte tijd wordt vaak gebruikt. Dit resulteert meestal in verdamping van giftige of gevaarlijke methanol, ethanol of 2-propanol en een sterke geur van azijnzuur in het lab die moeten worden vermeden vanwege de veiligheid overwegingen. In een protocol oorspronkelijk gepubliceerd in twee octrooiaanvragen door EM Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), is een alternatieve samenstelling van de kleuroplossing beschreven waarin geen organische oplosmiddelen of zuur wordt gebruikt. Het CBB is opgelost in dubbelgedestilleerd water (60-80 mg van het CBB G-250 per liter) en 35 mM HCl wordt toegevoegd als de enige andere verbinding in de kleuroplossing. Het CBB staning van de gel gebeurt na SDS-PAGE en grondig wassen van de gel in dubbelgedestilleerd water. Door het verwarmen van de gel tijdens het wassen en vlekken stappen, kan het proces sneller worden afgewerkt en er geen giftige of gevaarlijke compunds worden verdampen. De kleuring van eiwitten gebeurt al binnen 1 minuut na het verwarmen van de gel in kleuroplossing en is volledig ontwikkeld na 15-30 minuten met een licht blauwe achtergrond die volledig ontkleurd bij langdurige wassen van de gekleurde gel in dubbelgedestilleerd water, zonder dat de lood-eiwit bands.

Een kort protocol voor eiwitkleuring met Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels wordt beschreven zonder gebruik te maken van organische oplosmiddelen of azijnzuur als in de klassieke kleuren procedures met CBB.

Kleuring van eiwitten in Gels met Coomassie G-250 zonder organisch oplosmiddel en azijnzuur

In klassieke eiwitkleuringsprotocollen met Coomassie Brilliant Blue (CBB) worden oplossingen gebruikt met een hoog gehalte aan toxische en brandbare organische oplosmiddelen ...

Om deze procedure te starten, wordt Kumasi Brilliant Blue of CBG two 50 opgelost in één liter tweemaal gedestilleerd water door twee tot vier uur te roeren. Vervolgens wordt zoutzuur aan de donkerblauwe oplossing toegevoegd onder stirring gedurende nog één minuut, waarna de oplossing donker wordt bewaard voor later gebruik. Na de eiwitmonsterpreparatie en STS-page wordt de gelcassette gedemonteerd en de gel in een doos geplaatst voor drie opeenvolgende wasstappen met tweemaal gedestilleerd water.Na de derde wasstap wordt het water vervangen door voldoende CBB-kleuringsoplossing om de gel in de box te bedekken. De box wordt 10 seconden in de magnetron verhit, waarna de box met de gel op een schudmachine wordt geplaatst. Zodra de kleuring is voltooid, kunnen de eiwitbanden na één minuut worden waargenomen.Hallo, ik ben Amri Lawrence van de faciliteit voor eiwitexpressie en -zuivering van EMBL Heidelberg. Vandaag tonen we u een protocol voor het kleuren van eiwitten met Coomassie Brilliant Blue G-250 in acrylamidegels. In tegenstelling tot klassieke kleuringsmethoden, maakt ons protocol geen gebruik van organische oplosmiddelen of azijnzuur.We gebruiken dit protocol om onze eiwitten n

staining-proteins-gels-with-coomassie-g-250-without-organic-solvent

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Na de scheiding door elektroforetische methoden, kunnen eiwitten in een gel worden gedetecteerd door verschillende kleuren methoden. Kleuring van eiwitten met Coomassie Blauw, Zilver kleuring, SYPRO Orange, SYPRO Ruby worden gedemonstreerd in deze video.

Kleuring Eiwitten in Gels

Deze video zal populariseren een colloïdale Coomassie G-250 kleuringsprotocol volgens...

Snelle en gevoelige colloïdaal Coomassie G-250 Kleuring voor Eiwitten in polyacrylamidegels

Het gebruik van specifieke glycosidases om suikers te verwijderen uit glycoproteïnen, gevolgd door SDS-PAGE is een waardevolle methode om glycan wijzigingen op eiwit-samples te detecteren en is een goede keuze voor de eerste glycobiologie studies. Veranderingen na deglycosylatie kunnen worden gedetecteerd als verschuivingen in gel mobiliteit of door kleuring met glycan gevoelige reagentia.

Identificatie en karakterisering van proteïne glycosylering met behulp van specifieke endo-en exoglycosidases

In this video, we demonstrate a procedure for combined Alcian blue and silver staining of sulfated glycosaminoglycan oligosaccharide fragments. This combined staining technique significantly amplifies the bands of glycosaminoglycan polymers of different lengths in polyacrylamide gels.

Silver Staining of Sulfated Glycosaminoglycans: A Staining Method for Visualization of Sulfated Glycosaminoglycans in Polyacrylamide Gels

Om de diversiteit van O-gekoppelde glycanen grondig te onderzoeken, wordt een nieuwe procedure voor in-gel reducerende β-eliminatie, gecombineerd met permethylering en een snelle fase-verdelingsmethode, toegepast op de analyse van O-gekoppelde glycanen die direct vrijkomen uit glycoproteïnen opgelost door SDS-PAGE en bruikbaar voor verdere glycomics-analyse door massaspectrometrie.

Verbeterde In-gel Reductive β-eliminatie voor Comprehensive O-gebonden en Sulfo-glycomics door massaspectrometrie

Hier presenteren we een twee-dimensionale gelelektroforese (2DE) dat is gekoppeld aan massaspectrometrie (MS) te scheiden en te identificeren menselijke hypofyse adenoom weefsel Proteoom, waarin een goede en reproduceerbare 2DE patroon. Veel eiwitten worden bij elke 2DE plek waargenomen bij het analyseren van complexe kanker Proteoom met het gebruik van hoog-gevoeligheids MS.

Twee-dimensionale gelelektroforese gekoppeld aan massaspectrometrie methoden voor een analyse van menselijke hypofyse adenoom weefsel Proteoom

De architectuur van eiwitcomplexen is essentieel voor hun functie. Diverse massaspectrometrische technieken combineren bewezen krachtige te bestuderen van hun vergadering. Wij bieden protocollen voor chemische dwarsbinding en inheemse massaspectrometrie en laten zien hoe deze complementaire technieken helpen ophelderen van de architectuur van multi subeenheid eiwit assemblages.

Chemische dwarsbinding en massaspectrometrie van Intact eiwitcomplexen te bestuderen de architectuur van multi subeenheid eiwit assembly's combineren

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol waarin een nieuwe TL kleuring techniek voor de detectie van de totale proteïne in polyacrylamide gels. Het protocol maakt gebruik van een zilveren ion-specifieke fluorescentie turn-on sonde, die Ag+detecteert-eiwitcomplexen, en elimineert bepaalde beperkingen van traditionele chromogenic zilveren vlekken.

Fluorescerende zilveren kleuring van eiwitten in Polyacrylamide Gels

Dit protocol richt zich op de identificatie van eiwitten die binden aan inositol fosfaten of fosfoinositides. Het maakt gebruik van affiniteits chromatografie met biotinyleerd inositol fosfaten of fosfoinositides die zijn geïmmobiliseerd via streptavidine aan agarose of magnetische kralen. Inositol fosfaat of fosfoinositide bindende eiwitten worden geïdentificeerd door Western blotting of massaspectrometrie.

Identificatie van inositol fosfaat of Fosfoinositide interactie eiwitten door Affiniteits chromatografie gekoppeld aan Western Blot of massaspectrometrie

Dit protocol beschrijft de extractie en visualisatie van geaggregeerde en oplosbare eiwitten uit Escherichia coli na behandeling met een proteotoxisch antimicrobieel middel. Het volgen van deze procedure maakt een kwalitatieve vergelijking mogelijk van de vorming van eiwitaggregaten in vivo in verschillende bacteriestammen en/of tussen behandelingen.

Extractie en visualisatie van eiwitaggregaten na behandeling van Escherichia coli met een proteotoxische stressor

Dit protocol beschrijft een techniek voor de analyse van respiratoire supercomplexen wanneer slechts kleine hoeveelheden monsters beschikbaar zijn.

Isolatie van mitochondriën voor mitochondriale supercomplexanalyse uit kleine weefsel- en celcultuurmonsters 

Leer een veilige methode voor eiwitkleuring in polyacrylamidegels met Coomassie G-250 zonder organische oplosmiddelen. Dit protocol biedt snelle visualisatie van eiwitbanden na elektroforese.

Kleuring van eiwitten in Gels met Coomassie G-250 zonder organisch oplosmiddel en azijnzuur

Meer video's verkennen