Name: DNA-extractie van 0,22 uM Sterivex Filters en Cesium Chloride dichtheidsgradiënt centrifugatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-18T05:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 14 s
Description: Leer DNA-extractie uit planktonische biomassa op Sterivex-filters met cesiumchloride-dichtheidsgradiëntcentrifugatie voor milieu-DNA-onderzoek in mariene microbiële ecologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen graag de Canadese Stichting voor Innovatie, de British Columbia Kennis Ontwikkelingsfonds en de National Sciences and Engineering Research Council (NSERC) van Canada te bedanken voor de ondersteuning van lopende studies op een laag zuurstofgehalte regio&#39;s van kust-en open water van de oceaan. JJW werd ondersteund door beurzen uit NSERC en DAW werd ondersteund door beurzen uit NSERC, Killam en de TULA basis gefinancierd Centrum voor Microbiële diversiteit en evolutie. SL werd gesteund door de stichting gefinancierd TULA Centrum voor Microbiële diversiteit en evolutie.

Opmerking: Alle gebruikte reagentia in dit protocol zijn gealiquoteerd van het laboratorium voorraden in kleinere werkvoorraden-dit is erg belangrijk om te voorkomen dat kruisbesmetting van je DNA-monsters en besmetting van lab voorraden. Ook, toen pipetteren, zorg ervoor dat pipetpunten te veranderen voor elke aanvulling op kruisbesmetting te voorkomen. Deel een: Cell Lysis en Spijsvertering <ol><li> Begin dit protocol door het ontdooien van de Sterivex filters die eerder geconcentreerd planktonische biomassa bevatten op het ijs. Voor de eenvoud, hier beschrijven we de procedure voor de verwerking van een apart filter. In de praktijk adviseren wij de verwerking van 16 of minder filters tegelijk. </li><li> Zodra het filter is ontdooid, beginnen de eerste van twee incubaties: een om de cellen te lyseren en te verwijderen RNA, en een af ​​te breken eiwitten. Voor de eerste incubatie, voeg 100 ul lysozym (125 mg in 1000 ui TE) en 20 ml RNase A (10 ug / ml) om de filter. Sluit het filter met Parafilm en laat het in de oven te draaien hybridisatie bij 37 ° C gedurende 1 uur. </li><li> Voor de volgende incubatie, voeg 100 ul proteïnase K en 100 ul 20% SDS aan het filter. Sluit met behulp van Parafilm en laat het aan een tot twee uur meer draaien in de hybridisatie oven, dit keer bij 55 ° C. </li><li> Met behulp van een injectiespuit 5cc, overdracht van de lysaat van de Sterivex filter in een 15 ml Falcon buis. Spoel het filter met 1 ml lysis buffer en voeg de spoel vloeistof om het lysaat in uw Falcon buis met behulp van de 5cc spuit. Nu heb je gelyseerd en verteerd je cellen, bent u klaar om hun DNA te halen. </li></ol> Deel twee: DNA-extractie <ol><li> De volgende stap is om de fenol-chloroform methode te gebruiken om het DNA uit je lysaat. Voeg een gelijke hoeveelheid (ongeveer 3 ml) van fenol: chloroform: isoamylalcohol (IAA) de lysaat buis, en zorg ervoor dat pipetpunten voor elke toevoeging te veranderen om kruisbesmetting te voorkomen. Vortex gedurende 10 seconden goed mengen. </li><li> Spin de buis bij 2500 g gedurende 5 minuten, zorg ervoor dat de centrifuge evenwichtig is. Tijdens het centrifugeren moet de fenol-chloroform-lysaat mengsel scheiden in twee lagen: een organische laag die het fenol, chloroform, en eiwitten uit je monster, op de bodem, en een waterige laag, die bestaat uit je DNA, water en andere meer hydrofiele moleculen, op de top. </li><li> Breng de waterige laag (met daarin uw DNA) in een nieuwe 15 ml Falcon buis. Wees voorzichtig dat u de interface contact met de pipetpunt (laat altijd een kleine hoeveelheid van de waterige laag achter). </li><li> Om deze nieuwe buis, voeg een gelijke hoeveelheid (ca. 3 ml) van Chloroform: IAA, en zorg ervoor dat pipetpunten voor elke toevoeging te veranderen om kruisbesmetting te voorkomen. Vortex gedurende 10 seconden. Deze stap helpt om alle resterende fenol te verwijderen uit uw DNA-monster. </li><li> Spin bij 2500 g gedurende 5 minuten of tot waterige laag is duidelijk. Overdracht waterlaag in een nieuwe, label Falcon buis en voeg 1 ml van TE bij pH 8,0, zorg dat u de interface contact met de pipetpunt (laat altijd een kleine hoeveelheid van de waterige laag achter). Deze waterige laag bevat uw DNA-extract. </li></ol> Deel drie: DNA Concentratie en Wassen <ol><li> De volgende stap is te wassen en het DNA-monster te concentreren in een 15 ml Amicon Ultra centrifugebuis. De Amicon buizen bestaan ​​uit een filter dat moleculen blijft op of boven een bepaald moleculair gewicht (het retentaat) en een buis om de stroom-door middel van vangstbeperkingen (het filtraat). In dit geval, het filter houdt je DNA (het retentaat). Breng uw DNA-extract van stap 2.5 om de filter compartiment van een Amicon Ultra buis. </li><li> Draaien op 3500 g gedurende 10 minuten. Controleer of er minder dan 1 ml vloeistof bewaard in de Amicon filter. Als er meer retentaat blijft, vul het filter met TE en weer draaien. Zorg ervoor dat u een frisse pipettip gebruiken voor iedere TE aanvulling op kruisbesmetting te voorkomen. </li><li> Verwijder de doorstroming, of het filtraat, naar een andere Falcon buis en sla het op in de koelkast totdat u bevestiging van uw uiteindelijke DNA product op een gel (vierde deel). </li><li> Voeg 2 ml TE-buffer om de Amicon filter en draaien op 3500 g gedurende 6 minuten, zorg ervoor dat u een frisse pipettip gebruiken voor elke TE aanvulling op kruisbesmetting te voorkomen. Zwembad filtraat met die uit stap 3.3 en sla in de koelkast. </li><li> Was het DNA twee keer meer met TE voor een totaal van drie wasbeurten (zorg ervoor dat u altijd een verse pipetpunt), en het opslaan van het filtraat elke keer (volgens de stappen 3.3 en 3.4). Voor de laatste was, spin tot 200 tot 500 ml van het retentaat blijft in de Amicon filter. Noteer het uiteindelijke volume en de overdracht van het retentaat (met uw DNA) om een ​​gelabeld 1,5 ml Eppendorf buis. </li></ol> Deel vier: Bepaling van de DNA-Quality <ol><li> Controleer de DNA-kwaliteit en een schatting van de concentratie van het DNA door het uitvoeren van uw monsters op een gel 0,8% agarosegel staINED met 1 ml ethidiumbromide (EtBr) &#39;s nachts. (Wees uiterst voorzichtig bij het gebruik van EtBr-it is een bekend mutageen en verdacht carcinogeen. Zorg ervoor dat je vaak veranderen handschoenen en EtBr over te dragen aan de rest van het lab en om uw huid te voorkomen.) Laad de monsters naast DNA ladders, die dienen als omvang en intensiteit normen (zie volgende stap). </li><li> In de eerste paar rijstroken, belasting ladders met bands van verschillende molecuulgewichten en concentraties. Wij bevelen de volgende lading patroon: in de eerste en laatste rijstroken (buitenste rijstroken), load 10 ul van 50ng/μl van 1kb + of 2log ladder. In de lanen 2,3 en 4, belasting 2 pl, 5 ul, en 10 ul, respectievelijk van 50ng/μl λHindIII ladder. Ten slotte, last 5 ul per rijstrook van de DNA-extract met kleurstof voor elk monster. </li><li> Laat de gel op 15 volt voor ongeveer 16 uur (wij raden &#39;s nachts lopen). </li><li> De volgende dag, de foto van de gel met een UV-gel documentatiesysteem. Voor het bepalen van het moleculair gewicht bereik van je DNA en de concentratie, vergelijk het monster bands bands van de ladders. Goede kwaliteit DNA zal een hoog molecuulgewicht (&gt; 36kb), en tonen weinig tekenen van scheren / degradatie. Zie figuur 1. </li></ol> Vijfde deel: Cesium Chloride Gradient Centrifugeren <ol><li> Als de DNA-kwaliteit is goed en de hoeveelheid voldoende is, kunt u overgaan tot het DNA te zuiveren door het uitvoeren van een cesium chloride (CSCL) gradiënt centrifugatie. Merk op dat deze zuivering stap is optioneel en is niet noodzakelijk voor alle downstream toepassingen (bijvoorbeeld als je wilt fosmid bibliotheken u DIENT te zuiveren genereren, terwijl als je gewoon wilt PCR-reacties uit te voeren, de zuivering is meestal niet nodig). Ten eerste label een centrifugebuis voor elk monster. </li><li> Aan elke centrifugebuis, voeg 160 mg CsCl, 178 pl van genomisch DNA. Na het toevoegen van CsCl en DNA aan de buis, leg een klein stukje van parafilm op de top van de buis en voorzichtig omkeren van de buis tien tot twintig keer in om de componenten te mengen. Gaan niet samen door pipetteren, wat kan leiden tot afschuiving van het DNA. Voeg vervolgens 10 ui van 10 ug / ul EtBr om deze buis en meng dit op dezelfde manier. (Wees uiterst voorzichtig bij het gebruik van EtBr-it is een bekend mutageen en verdacht carcinogeen. Zorg ervoor dat je vaak veranderen handschoenen en EtBr over te dragen aan de rest van het lab en om uw huid te voorkomen.) </li><li> Zorg ervoor dat het gewicht van de buizen zijn afgesloten vóór centrifugeren zodanig dat het gewicht verschillen tussen de buizen zijn minder dan 1 mg. </li><li> Plaats de buizen in de rotor met behulp van hemostaat, sluit het deksel en plaats de rotor in de ultracentrifuge. </li><li> Sluit de ultracentrifuge deur. Vacuüm wordt zodra je de deur dicht worden toegepast. Lopen &#39;s nachts op 100.000 toeren per minuut gedurende 18 uur en 20 ° C. </li><li> Wanneer wordt gecentrifugeerd is voltooid, nemen de buizen van de rotor met behulp van hemostaat en leg ze op een buis rek. </li><li> Visualiseer het DNA met blauw licht transilluminator, of indien niet beschikbaar, gebruik lange golflengte UV-licht, in een donkere kamer. Draag een paar oranje filter bril om de DNA-band te zien. Zie figuur 2. </li><li> Met behulp van een steriele 1cc spuit en naald (26G 5 / 8), verwijder DNA-band en plaats deze in een 1,5 ml Eppendorf buis. </li><li> Om u te helpen herstellen de meeste van de DNA opgesloten in de dode ruimte in de spuit, spoel spuit met 100 pi TE en voeg de gespoeld oplossing voor de buis. Bereid een buisje met 100 pi TE-buffer per monster, om kruisbesmetting te voorkomen. </li><li> Voor het verwijderen van EtBr uit het DNA, voeg een gelijk volume van water verzadigde butanol aan de buis, keren de buizen voorzichtig tien tot twintig keer, centrifugeer bij 10000 rpm gedurende 1 minuut en gooi de bovenste laag. </li><li> Herhaal het wassen totdat de kleur van butanol is transparant, 3 - 4 keer. </li><li> Plaats 4 ml TE in een Amicon Ultra centrifugebuis en voeg de DNA-oplossing van bovenaf. </li><li> Centrifugeer bij 3500 g bij kamertemperatuur, totdat het DNA volume is gereduceerd tot ongeveer 100-500 ui (ongeveer 6-7 minuten) en gooi de doorstroming. </li><li> Voeg 2 ml TE aan Amicon filter en centrifugeer bij 3500 g gedurende 6 minuten, zorg ervoor dat u een frisse pipettip te gebruiken voor elke toevoeging om kruisbesmetting te voorkomen. Tweemaal herhalen. </li><li> Concentreren tot een eindvolume van 50-100 ul door extra centrifugeren als nodig en breng de DNA-oplossing op het filter om een ​​nieuwe 1,5 ml Eppendorf buis. </li><li> Voeg 40 ul TE aan de Amicon filter en pipet op en neer langs beide filter membranen uit te spoelen eventuele resterende DNA. Voeg deze oplossing toe aan de buis in 5.15. </li><li> Plaats een Microcon YM-30 filter-eenheid in een Microcon buis en voorwas de Microcon door de toevoeging van 200 ul geautoclaveerd water en centrifugeren bij 10000 rpm gedurende 7 minuten. </li><li> Voeg de DNA-oplossing van 5,16 voor de voorwas Microcon om verder te concentreren het DNA. Centrifugeer bij 5.000 tot 10.000 g gedurende 1 - 3 minuten. Controleer de hoeveelheid vloeistofop het filter en herhaal centrifugeren totdat het bedrag van de vloeistof op het filter wordt teruggebracht tot ongeveer 50 pi. </li><li> Plaats het filter op zijn kop in een nieuw Microcon buis en centrifugeer bij 1000 g gedurende 3 minuten. De ideale hoeveelheid geconcentreerde oplossing van 50-60 ul. </li><li> Meet en noteer de concentratie van het DNA op een Nanodrop en controleer piek kwaliteit (moet worden 260nm). </li><li> Overdracht van een kleine hoeveelheid van het DNA een schoon eppendorfbuisje voor de werkvoorraad en bevriezen bij min 20. Breng de rest van het DNA om een ​​tweede schone Eppendorf en bevriezen bij min 80. </li></ol> Representatieve resultaten: Wanneer dit protocol goed wordt gedaan, moet u een gel afbeelding te zien na stap 4.4 bij de bepaling van de DNA-kwaliteit vergelijkbaar is met een figuur. Werkelijke DNA-concentratie van extracten zal variëren afhankelijk van de bron van het monster. Na stap 5.7 in CsCl gradiënt centrifugatie, moet genomisch DNA verlicht door blauw licht lijken op figuur 2. <img src="/files/ftp_upload/1352/1352Fig1newer.png" alt="Figuur 1" /> Figuur 1. 0,8% agarosegel elektroforese beeld van een hoog moleculair gewicht DNA verzameld uit vier diepten in de subarctische Stille Oceaan (in tweevoud), gekleurd met de intercalerende stof ethidiumbromide (10 mg / ml). Gel werd uitgevoerd bij 15V voor ~ 16 uur in 1x TBE gel lopen buffer. Monster banden zijn van goede kwaliteit met weinig bewijs van mechanische afschuiving (toont enkele bands of vlekken in tegenstelling tot meerdere bands), hoewel de 10m extracten behouden sommige RNA-overdracht (zie uitstrijkje in de 0,5 tot 2,0 Kb bereik). <img src="/files/ftp_upload/1352/1352Fig2.jpg" alt="Figuur 2" /> Figuur 2. Genomic DNA-band verlicht door blauw licht na CsCl gradiënt centrifugatie.

<ol><li>Beja, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+BAC+or+not+to+BAC%3A+marine+ecogenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">To BAC or not to BAC: marine ecogenomics.</a> Curr Opin Biotechnol. 15 (3), 187-190 (2004).</li>
<li>Beja, O., Suzuki, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+analysis+of+bacterial+artificial+chromosome+libraries+from+a+marine+microbial+assemblage%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage.</a> Environ Microbiol. 2 (5), 516-529 (2000).</li>
<li>DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community+genomics+among+stratified+microbial+assemblages+in+the+oceans+interior%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Community genomics among stratified microbial assemblages in the oceans interior.</a> Science. 311, 496-503 (2006).</li>
<li>Stein, J. L., Marsh, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+uncultivated+prokaryotes%3A+isolation+and+analysis+of+a+40-kilobase-pair+genome+fragment+from+a+planktonic+marine+archaeon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon.</a> J Bacteriol. 178 (3), 591-599 (1996).</li>
<li>Somerville, C. C., Knight, I. T., Straube, W. L., Colwell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+rapid+method+for+the+direct+isolation+of+nucleic+acids+from+aquatic+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A simple, rapid method for the direct isolation of nucleic acids from aquatic environments.</a> Appl. Environ. Microbiol. 55 (3), 548-554 (1989).</li>
</ol>

Afhankelijk van het aantal monsters dienen te worden verwerkt, kan dit een tijdrovende procedure als gevolg van de twee een uur incubatie stappen, en de herhaalde wast en centrifugeren stappen. Het beste is om twee hele dagen voor deze procedure van plan om veel tijd te verlaten. Als er problemen zijn het krijgen van het uiteindelijke extract volume in de Amicon buis naar beneden te reduceren tot 200-500μl tijdens de DNA-concentratie en het wassen, probeer dan extra TE wast en centrifugations (herhaling deel drie) tot d...

A correction was made to "<a href="/video/1352">DNA Extraction from 0.22 &#181;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation</a>". A typo in a volume's measurement was corrected in step 1.2.
The step was corrected from:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 &#956;l lysozyme (125 mg in 1000 &#956;l TE) and 20 ml RNase A (10 &#956;g/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37&#176;C for 1 hour.
to:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 &#956;l lysozyme (125 mg in 1000 &#956;l TE) and 20 &#956;l RNase A (10 &#956;g/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37&#176;C for 1 hour.

A correction was made to <a href="/video/1352">DNA Extraction from 0.22 &#181;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation</a>. A typo in a volume's measurement was corrected in step 1.2.

Erratum: DNA Extraction from 0.22 &#181;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

<table><tbody><tr><td>1 cc spuit (26G5/8 naald)</td><td>BD Biosciences</td><td>309597</td><td></td></tr><tr><td>1 ml spuit (26G5/8 naald)</td><td>BD Biosciences</td><td>309597</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Eppendorf-buisjes</td><td>Eppendorf</td><td>0030 125.150</td><td></td></tr><tr><td>15 ml buisjes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430791</td><td></td></tr><tr><td>5 cc spuit</td><td>BD Biosciences</td><td>309603</td><td></td></tr><tr><td>Amicon&amp;#174; Ultra-4 centrifugale filterapparaten</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC801096</td><td>10.000 nominale moleculaire gewichtsgrens</td></tr><tr><td>Butanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A383-1</td><td>Maak het waterverzadigd (butanol:water = 1:1)</td></tr><tr><td>Centrifugerotor, JA5.3 </td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>368690</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge, Avanti&amp;#174; J-E</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>369003</td><td></td></tr><tr><td>Cesiumchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4036</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform:IAA (24:1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25666-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Ethidiumbromide (EtBr)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510-10ml</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiaminetetraazijnzuur dinatriumzout dihydraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Hybridisatieoven</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-247-10</td><td>37&amp;#x00B0;C &amp;amp; 55&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Lysisbuffer</td><td></td><td></td><td>0,75 M sucrose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8,3)</td></tr><tr><td>Lysozym</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876-5G</td><td>125 mg in 1000 &amp;#x03BC;l TE</td></tr><tr><td>Microcon&amp;#174; Ultracel YM-30 centrifugale filtereenheid</td><td>EMD Millipore</td><td>42410</td><td>50 bp afsnijpunt</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr><td>Fenol:Chloroform:IAA (25:24:1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77617-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Qiagen</td><td>19133</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2539-100</td><td>10 &amp;#x03BC;g/ml</td></tr><tr><td>Safe Imager&amp;#8482; blauw licht transilluminator</td><td>Invitrogen</td><td>S37102</td><td></td></tr><tr><td>Natriumlaurylsulfaat (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4509</td><td>20% SDS</td></tr><tr><td>Sterivex-filters</td><td>Fisher Scientific</td><td>SVG010RS</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Tafelcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>TE-buffer, pH 8,0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trizma&amp;#174; base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifugerotor, TLA 100</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>343847</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifugebuis (7X20mm, PC)</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>343775</td><td></td></tr><tr><td>Rek voor ultracentrifugebuisjes</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>348302</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge, Optima&amp;#174; Max</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dna-extractie van 0,22 um sterivex filters en cesium chloride dichtheidsgradiënt centrifugatie

DNA Extraction from 0.22 &mu;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

Deze methode wordt gebruikt om een ​​hoog moleculair gewicht genomische DNA-extract van plankton biomassa geconcentreerd op 0,22 uM Sterivex filters die zijn behandeld met opslag / lysisbuffer en gearchiveerd bij -80 ° C, en dit met behulp van DNA een cesium chloride dichtheidsgradiënt te zuiveren. Het protocol begint met twee een-uur incubatie stappen om DNA te bevrijden van cellen en te verwijderen RNA. Vervolgens wordt een reeks van Fenol: zijn Chloroform Chloroform en extracties uitgevoerd, gevolgd door centrifugeren aan eiwitten en celmembraan componenten, collectie van het waterige DNA-extract, en een aantal buffer uitwisseling stappen te wassen en te concentreren het extract te verwijderen. Deel vijf beschrijft de optionele zuivering via cesium chloride dichtheidsgradiënt. Het wordt aanbevolen om met minder dan 15 monsters te werken in een keer om verwarring te voorkomen en te bezuinigen protocol tijd. De totale tijd die nodig is voor dit protocol is afhankelijk van het aantal monsters dat moet worden geëxtraheerd. Voor 10-15 monsters en ervan uitgaande dat de juiste centrifugeren apparatuur beschikbaar is, moet deze hele protocol duurt 3 dagen. Zorg ervoor dat u de hybridisatie ovens ingesteld op de temperatuur aan het begin van het proces.

We beschrijven een methode voor de extractie van een hoog moleculair gewicht genomische DNA van plankton biomassa geconcentreerd op 0,22 micrometer Sterivex filters, gevolgd door een cesium chloride dichtheidsgradiënt centrifugatie voor zuivering.

DNA-extractie van 0,22 uM Sterivex Filters en Cesium Chloride dichtheidsgradiënt centrifugatie

Deze methode wordt gebruikt om genomisch DNA met een hoog moleculair gewicht te extraheren uit planktonische biomassa, geconcentreerd op 0,22 μM Sterivex-filters die zijn ...

Hallo, ik ben Jody uit het laboratorium van Steven Hallam bij de afdeling microbiologie en immunologie van de University of British Columbia. Vandaag laten we u een procedure zien voor het extraheren van genomisch DNA, geconcentreerd uit zeewatermonsters op 0,2 micron STX-filters, en een zuivering van dit DNA via cesiumchloride-densiteitsgradiëntcentrifugatie. Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om omgevings-DNA te verkrijgen, zodat we de structuur, diversiteit en het metabolisme van microbiële gemeenschappen in mariene omgevingen kunnen bestuderen.Laten we beginnen. Start dit protocol door de reeks filters, die u eerder heeft geconcentreerd met planktonische biomassa, behandeld heeft met lysisbuffer en voor het gemak hebt ingevroren, op ijs te ontdooien. Hier beschrijven we de procedure voor het verwerken van een individueel filter.In de praktijk raden wij aan om maximaal 15 filters tegelijkertijd te verwerken. Zodra het filter is ontdooid, start u met de eerste van twee incubaties: één om de cellen te lyseren en RNA te verwijderen, en één om eiwitten af te breken.Voeg voor de eerste incubatie 100 µL lysozym en 20 µL RN a's a toe aan het filter. Sluit het filter opnieuw af met parfum en laat het één uur roteren bij 37 °C. Voeg voor de volgende incubatie 100 µL proteïne ace KN en 100 µL 20% SDS toe aan het filter.Sluit het filter opnieuw af met Parafilm en laat het nog één tot twee uur roteren. Ditmaal bij 55 °C. Gebruik een spuit van 5 cc om het lysaat van het Stax-filter over te brengen naar een Falcon-buis van 15 milliliter.Spoel het filter met één milliliter lysisbuffer en voeg het spoelvocht toe aan het lysaat in uw falcon-buis. Nu u de cellen heeft gelyseerd en gedigesteerd, kunt u het DNA extraheren. De volgende stap is het gebruik van de fenol-chloroformmethode om het DNA uit uw lysaat te extraheren.Voeg een gelijk volume van ongeveer drie milliliter fenol-chloroform-isoamylalcohol toe aan de lysisbuis en vortex deze 10 seconden om goed te mengen. Centrifugeer de buis vijf minuten bij 2.500 ×g. Tijdens het centrifugeren moet het mengsel van fenol-chloroform en lysaat scheiden in twee lagen.Een organische laag onderin die fenol, chloroform en eiwitten uit uw monster bevat. En een waterige laag, meestal bovenop, die bestaat uit uw DNA, water en andere meer hydrofiele moleculen. Overbreng de waterige laag met uw DNA naar een nieuwe Falcon-buis van 15 milliliter. Voeg aan deze buis een gelijk volume van een chloroform-isoamylalcoholmengsel toe en vortex gedurende 10 seconden.Deze stap verwijdert alle resterende fenol uit uw DNA-monster. Centrifugeer dit 2.500 ×g gedurende vijf minuten of totdat de waterige fase helder is. Draag de waterige fase over naar een nieuwe gelabelde falcon tube en voeg 1 mL TE toe bij pH 8.Nu heeft u uw DNA-extract. De volgende stap is het wassen en concentreren van het DNA-monster in een Amazon-ultracentrifugebuis van 15 milliliter. Breng uw DNA-monster over naar het filtercompartiment van een.Ultra tube theon-buizen bestaan uit een filter dat moleculen met een moleculair gewicht ter hoogte van of boven een gespecificeerde waarde vasthoudt, de tate en een buis om het filtraat op te vangen. In dit geval houdt het filter uw DNA vast door te centrifugeren op 3.500 ×g gedurende 10 minuten. Controleer of er minder dan één milliliter vloeistof is achtergebleven in het Amon-filter.Indien er nog retentaat overblijft, vul het filter dan opnieuw met TE en centrifugeer opnieuw. Verplaats de doorstroom of het filtraat naar een andere Falcon-buis en bewaar deze in de koelkast totdat u uw uiteindelijke product op een gel heeft bevestigd; voeg vervolgens twee milliliters TE-buffer toe aan het Amන්on-filter en centrifugeer bij 3.500 ×g gedurende zes minuten. Verwijder het filtraat op dezelfde wijze als voorheen.Was het DNA nog twee keer met TE voor een totaal van drie wasbeurten, waarbij telkens het filtraat wordt bewaard voor de laatste centrifugeerstap, totdat er 200 tot 500 microliter TE in het Amon-filter overblijft. Noteer het uiteindelijke volume en breng dit over naar een gelabelde 1,5 milliliter eppendorf-buis. Maak een aliquot van 70 microliter van het gewassen geconcentreerde DNA om als werkvoorraad te gebruiken.Bewaar de werkvoorraad bij -20 °C. Vries de rest van het DNA in bij -80 °C. Controleer de DNA-concentratie en de kwaliteit van uw eindproduct door uw monsters op een gel naast DNA te draaien.Ladders die dienen als grootte- en intensiteitsstandaarden worden gebruikt om een 0,8%AROS-gel met ethidiumbromide op te stellen voor een run gedurende de nacht. Laad in de eerste paar banen ladders met banden van verschillende moleculaire gewichten en concentraties; wij bevelen het volgende laadpatroon aan. Laad in de eerste twee banen 10 µL van een 1 kb plus ladder; laad in de volgende drie banen respectievelijk 2 µL, 5 µL en 10 µL van een 50 ng/µL Lambda H3 ladder.Laad tot slot vijf µL DNA-extractmonster per lane. Laat de gel ongeveer 16 uur lopen bij 15 volt. Fotografeer de gel met behulp van het UV-geldocumentatiesysteem om het molecuulgewichtsbereik en de concentratie van uw DNA te bepalen.Vergelijk de banden van de monsters met de banden van de ladder. DNA van goede kwaliteit heeft een hoog moleculair gewicht en vertoont weinig tekenen van shearing of degradatie. Als de DNA-kwaliteit goed is en de hoeveelheid voldoende, ga dan verder met het zuiveren van het DNA door een cesiumchloridegradiënt uit te voeren.Label eerst de centrifugebuizen; gebruik één centrifugebuis per monster. Voeg aan elke centrifugebuis 160 milligram cesiumchloride en 178 microliters genomisch DNA toe. Sluit de buis af met een klein stukje Parafilm en keer de buis voorzichtig 10 tot 20 keer om om de componenten te mengen. Meng niet door te pipetteren, omdat dit kan leiden tot shearing van het DNA.Voeg vervolgens 10 µL AUM-bromide toe aan de buis en meng opnieuw. Zorg ervoor dat de buizen goed in balans zijn voor centrifugatie en dat de gewichtsverschillen tussen de buizen minder dan 1 mg bedragen. Plaats de buizen met een pincet in de rotor van de ultracentrifuge.Sluit vervolgens het rotordeksel en plaats de rotor in de ultracentrifuge. Zodra de deur wordt gesloten, wordt het vacuüm in de ultracentrifuge doorgevoerd. Laat de centrifuge gedurende de nacht draaien voor een totale duur van 18 uur bij 100, 000 RPM en 20 °C.Wanneer de centrifugatie voltooid is, haal je de buisjes met pincetschaar uit de rotor en plaats je ze in het rek. Neem de buisjes mee naar de blauwlicht-transilluminator en zet de amberkleurige filterbril op. Zet vervolgens het blauwe licht aan en bekijk je DNA-band met behulp van een steriele spuit van 1 cc en naald.Verwijder de DNA-band en plaats deze vervolgens in een buisje van 1,5 milliliter om zoveel mogelijk DNA te herstellen dat vastzit in de dode ruimte van de spuit. Spoel de spuit met 100 microliters te en voeg de spoeloplossing toe aan het buisje. Bereid voor elk monster één buisje voor met 100 microliters te-buffer om kruiscontaminatie te voorkomen.Om AUM-bromide uit het DNA te verwijderen, voegt u een gelijk volume waterverzadigde butanol aan de buis toe. Keer de buizen voorzichtig 10 tot 20 keer om, centrifugeer één minuut bij 10.000 RPM en verwijder de bovenste laag. Herhaal het wassen nog ongeveer drie tot vier keer totdat de butanol transparant van kleur is.Breng vier milliliter TE over in een ancon ultracentrifugebuis en voeg de DNA-oplossing toe uit de bovenstaande centrifuge bij 3 500 ×g bij kamertemperatuur totdat het DNA-volume is gereduceerd tot ongeveer 100 tot 500 µL en gooi het filtraat weg. Voeg twee milliliter TE toe aan het Amazon-filter en centrifugeer bij 3 500 ×g gedurende zes minuten. Herhaal dit tweemaal voor een totaal van drie wasbeurten met TE en concentreer tot een eindvolume van 50 tot 100 µL door indien nodig aanvullende centrifugatie.Breng de DNA-oplossing op het filter over naar een nieuwe eppendorfbuis van 1,5 milliliter. Voeg 40 microliters TE toe aan het filter en pipetteer herhaaldelijk op en neer langs beide filtermembranen om het resterende DNA uit te spoelen. Voeg deze oplossing toe aan de buis met geconcentreerd DNA.Plaats een MicroCon YM 30 filtereenheid in een MicroCon-buis en pre-wash de MicroCon door 200 µL autoclaafwater toe te voegen en zeven minuten te centrifugeren bij 10.000 RPM. Voeg de DNA-oplossing toe aan de gepre-washte MicroCon; om het DNA verder te concentreren, wordt gecentrifugeerd bij 5.000 tot 10.000 ×g gedurende één tot drie minuten. Controleer de hoeveelheid vloeistof op het filter en herhaal de centrifugatie totdat de hoeveelheid vloeistof op het filter is verminderd tot ongeveer 50 µL.Plaats de filtereenheid ondersteboven in een nieuwe MicroCon-buis en centrifugeer 3 minuten bij 1000 ×g. De ideale hoeveelheid geconcentreerde oplossing is 50 tot 60 µL. Overbreng uw DNA-monster naar een nieuwe einor-buis van 1,5 mL.Meet de DNA-concentratie op een NanoDrop en controleer de kwaliteit van de piek. Een grafiek van de absorbenties voor zuiver DNA moet een duidelijke piek vertonen bij 260 nanometers. Vries het resterende DNA in bij -80 °C.Wanneer dit protocol correct is uitgevoerd, zou u een gelbeeld moeten zien dat vergelijkbaar is met figuur één; de werkelijke DNA-concentratie van de extracten zal variëren afhankelijk van de bron van het monster. Wanneer dit protocol correct is uitgevoerd, zou u duidelijk een DNA-band in het midden van de buis moeten zien. Zoals in figuur twee, hebben we zojuist gedemonstreerd hoe genomisch DNA uit Sterex-filters kan worden geëxtraheerd en gezuiverd met behulp van een cesiumchloride-dichtheidsgradiënt.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om vooraf te controleren of u alle benodigde reagentia en verbruiksartikelen heeft. Ten tweede dient u rekening te houden met ten minste drie volledige dagen, zodat er voldoende tijd is om de procedure zorgvuldig te voltooien. Dat is alles.Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

dna-extraction-from-022-m-sterivex-filters-cesium-chloride-density

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een methodiek om hoog moleculair gewicht en de hoge kwaliteit van genomisch DNA te isoleren uit de bodem microbiële gemeenschap wordt beschreven.

Extractie met een hoog molecuulgewicht Genomic DNA uit bodems en sedimenten

DNA-stabiele isotoop sonderen is een teelt-onafhankelijke methode voor het identificeren en karakteriseren van actieve gemeenschappen van micro-organismen die in staat zijn gebruik te maken van specifieke substraten. Assimilatie van de ondergrond verrijkt met zware isotoop leidt tot opname van gelabelde atomen in de microbiële biomassa. Dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie haalt gelabeld DNA voor de downstream-moleculaire analyses.

DNA-Stabiele Isotopen sondering (DNA-SIP)

Wij bieden een verbeterde protocol voor de extractie van een hoog moleculair gewicht DNA van hypersaline microbiële matten. Microbiële cellen worden gescheiden van de mat matrix voorafgaand aan de DNA-extractie en zuivering. Dit verhoogt de concentratie, de kwaliteit en de grootte van het DNA. Het protocol kan worden gebruikt voor andere vuurvaste monsters.

Extractie met een hoog molecuulgewicht DNA van microbiële matten

This video describes the technique of extracting extracellular vesicles from fresh or frozen tissues. The isolated extracellular vesicles can be used for further analysis to uncover their significant roles in disease pathogenesis.

Extracellular Vesicle Extraction: A Technique to Isolate Extracellular Vesicles from Whole Tissue Specimens Using Differential Centrifugation

This video demonstrates the density gradient ultracentrifugation-based purification method to isolate subpopulations of extracellular vesicles suitable for characterization studies.

Purification of Subpopulations of Extracellular Vesicles: A Technique to Purify Subpopulations of Extracellular Vesicles Using Density Gradient Ultracentrifugation

Hier bieden we een gedetailleerd protocol om te isoleren van kleine extracellulaire blaasjes (EVs) hele weefsel, met inbegrip van hersenen en tumor exemplaren. Deze methode biedt een reproduceerbare techniek om EVs extract van solide weefsel voor verder stroomafwaarts analyses.

Winning van extracellulaire blaasjes uit hele weefsel

Bacteriën scheiden nanometergrote extracellulaire blaasjes (EV's) af die bioactieve biologische moleculen dragen. EV-onderzoek richt zich op het begrijpen van hun biogenese, rol in microbe-microbe en gastheer-microbe interacties en ziekte, evenals hun potentiële therapeutische toepassingen. Een workflow voor schaalbare isolatie van EV's van verschillende bacteriën wordt gepresenteerd om standaardisatie van EV-onderzoek te vergemakkelijken.

Schaalbare isolatie en zuivering van extracellulaire blaasjes van Escherichia coli en andere bacteriën

Het huidige protocol biedt gedetailleerde beschrijvingen voor isolatie, concentratie en karakterisering van extracellulaire blaasjes uit cyanobacteriële culturen. Benaderingen voor het zuiveren van blaasjes uit culturen op verschillende schalen, afwegingen tussen methodologieën en overwegingen voor het werken met veldmonsters worden ook besproken.

Isolatie en karakterisering van cyanobacteriële extracellulaire blaasjes

Deze studie beschrijft een methode om bacteriële extracellulaire vesikels (BEV's) verrijkt uit menselijke uitwerpselen te isoleren en te zuiveren via dichtheidsgradiëntcentrifugatie (DGC), identificeert de fysieke kenmerken van BEV's op basis van morfologie, deeltjesgrootte en concentratie, en bespreekt de mogelijke toepassingen van de DGC-benadering in klinisch en wetenschappelijk onderzoek.

Isolatie en zuivering van bacteriële extracellulaire blaasjes uit menselijke uitwerpselen met behulp van dichtheidsgradiëntcentrifugatie

Hier presenteren we een eenvoudige techniek om antimicrobiële resistentie in het milieu (AMR) te beoordelen door het aandeel extracellulair DNA met een laag moleculair gewicht te verbeteren. Voorafgaande behandeling met 20%-30% PEG en 1,2 M NaCl maakt detectie van zowel genomische als horizontaal overgedragen AMR-genen mogelijk. Het protocol leent zich voor een kit-vrij proces met extra optimalisatie.

Verbeterde extractie van DNA met een laag moleculair gewicht uit afvalwater voor uitgebreide beoordeling van antimicrobiële resistentie 

Leer DNA-extractie uit planktonische biomassa op Sterivex-filters met cesiumchloride-dichtheidsgradiëntcentrifugatie voor milieu-DNA-onderzoek in mariene microbiële ecologie.

DNA-extractie van 0,22 uM Sterivex Filters en Cesium Chloride dichtheidsgradiënt centrifugatie

Meer video's verkennen