Name: Micro-injectie technieken voor het bestuderen van mitose in de Drosophila melanogaster Syncytieel Embryo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Leer micro-injectietechnieken om mitose te bestuderen in Drosophila melanogaster syncytiale embryo's met hoge-resolutiebeeldvorming. Deze methode helpt onderzoekers celdelingsdynamiek in vivo te analyseren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit protocol wordt momenteel gebruikt in ons laboratorium en is verfijnd door de jaren heen door vele mensen, waaronder Drs David Sharp, Mijung Kwon, Patrizia Sommi, Dhanya Cheerambathur. Wij danken dr. Bill Sullivan (UCSC) die ons voorzien van een uitstekend advies over de manipulatie en micro-injectie van vroege Drosophila embryo&#39;s bij ons werk op dit systeem werd geïnitieerd (ref. 13). Wij danken alle leden van de Scholey laboratorium. Ons werk op de mitose in Drosophila wordt ondersteund door NIH subsidie ​​GM55507.

Recepten: Grape Juice platen: <ul><li> 5.5g Bacto agar </li><li> 14,5 g dextrose of glucose </li><li> 7,15 g sucrose </li><li> 45 ml druivensap concentraat (100% sap). </li><li> 204,5 ml H 2 0 </li><li> 625 ul 10N NaOH </li></ul> Meng alle ingrediënten en een magnetron aan de kook. Voeg 2,8 ml zure mix (acid mix: 20,9 ml propionzuur, 2,1 ml fosforzuur, 27 ml H 2 0) Mix en giet op 35 mm petrischalen. Laat stollen op kamertemperatuur voor een of twee dagen. Als platen zijn niet van plan om binnenkort worden gebruikt, afdichting met parafilm en blijf bij 4 ° C (laat het aan RT evenwicht voor gebruik). Gist plakken: Los ongeveer een theelepel gist (Sigma YSC2, gist Saccharomyces cerevisiae van type II) in water tot een dikke pasta te vormen. Plaats een kleine hoeveelheid van deze op ieder druivensap bord vlak voor gebruik. G-PEM buffer: <ul><li> 80 mM Na-buizen, pH 6,9 </li><li> 1 mM MgCl 2 </li><li> 1 mM EGTA </li><li> 1 mM GTP </li></ul> Injectie buffer: <ul><li> 150 mM K-Aspartaat </li><li> 10 mM K-fosfaat </li><li> 20 mM imidazool, pH 7,2 </li></ul> Heptaan lijm: Rol dubbele plakband en plaats in een 100 ml fles, voeg ongeveer 50 ml heptaan, sluit de fles, en rock voor meerdere dagen. Bij het gebruik van, voeg heptaan als de lijm te dik is. Uitdroging kamer: Neem een ​​100 mm petrischaal, zet een deel van een 35 mm schotel naar binnen om een ​​&quot;tafel&quot; te maken en toe te voegen Drierite (watervrij calciumsulfaat) rond het zo dat de hoogte van Drierite is niet hoger dan de &quot;tafel&quot; en te dekken. Het dekglaasje met embryo&#39;s zullen worden geplaatst op deze &quot;tafel&quot; voor uitdroging vóór de injectie. Het is een goed idee om ten minste een aantal aangeeft Drierite te gebruiken en te wijzigen wanneer het is veranderd kleur. Protocol: Dit protocol kan gebruikt worden voor injectie van vrijwel elke oplosbaar reagens in het Drosophila embryo syncytieel: bijvoorbeeld, of een fluorescerend eiwit ter observatie of een doelwit eiwit-remmer of beide. Aan alles klaar: 1 .- 2 tot 3 dagen voor experiment, maken druivensap borden en het opzetten van lay kooi: Neem een plastic fles (6 oz, ronde bodem van Toegepast Natuurwetenschappelijk Drosophila), twee kleine gaten (ongeveer 1 cm 2) snijden aan weerszijden van de fles en vul deze met een katoenen stuk (dit zal de lucht te laten stromen), tikt u op de vliegen in de fles en bedek het met een druivensap plaat. Bewaren bij 25 ° C (of op kamertemperatuur), moet vliegt leggen embryo&#39;s voor ongeveer 10 dagen. 2 .- Ten minste een dag voor het experiment naalden voor injectie trekken, gebruiken we een Kopf Naald / Pipetteer puller model 720 en dunwandige glas filamenten (World precisie-instrumenten tw100f). Voor de injectie van TL-tubuline, houden naalden bij 4 ° C om de temperatuur-geïnduceerde polymerisatie in de naald te voorkomen. Tubuline voorbereiding: Opmerking: Alle werken met tubuline moet worden gedaan bij 4 ° C om polymerisatie te voorkomen. <ol><li> Neem het label tubuline uit de vriezer en zet het op ijs gedurende 5 tot 15 minuten. </li><li> Verdunnen met G-PEM buffer (4 tot 10 maal, afhankelijk van de gewenste intensiteit). </li><li> Centrifugeer bij 13k rpm bij 4 ° C gedurende 10-15 minuten. </li><li> Belasting 1-2 ui in de naald. </li></ol> Antilichaam of chemische inhibitor: Bereid naalden als voor tubuline, met behulp van een juiste concentratie (dit kan getest moeten worden). Het antilichaam kan worden in injectie buffer, G-PEM buffer of PBS. Als een andere buffer nodig is, zal deze buffer moeten worden geïnjecteerd als een controle om ervoor te zorgen dat deze buffer veroorzaakt geen schade aan zijn eigen. Let op: Inhibitor en tl-tubuline kunnen worden gemengd en samen geïnjecteerd als de concentraties toestaan. Anders, injecteer de tl-tubuline en wacht 5 tot 10 minuten voor het inspuiten van de remmer. Bij het uitvoeren van een dubbele injectie, te beginnen met meer embryo&#39;s, omdat er minder embryo&#39;s zal normaal herstellen. Embryoteams: <ol><li> Plaats een nieuw druivensap plaat op de lay kooi. </li><li> Verwijder deze plaat na een uur, dit is de eerste collectie van de dag en vaak is niet erg goed. Het kan worden weggegooid. </li><li> Wijzig de plaat elk uur aan het verzamelen van embryo&#39;s te houden gedurende een uur elk. </li></ol> Dekglaasje voorbereiding: <ol><li> Zet een 50 x 22mm dekglaasje aan een kant van een microscoop dia. Tape de vier hoeken aan de dia zodat het niet bewegen. </li><li> Met behulp van een katoenen tip applicator, leg een laag van heptaan lijm in een lijn op de dekglaasje (de lijm mag niet viskeus zijn en moet droog in een paar seconden, anders voegt meer heptaan). </li><li> Leg een stukdubbele kleefband op de dia naar de zijkant van het dekglaasje. </li></ol> Embryo voorbereiding: Let op: embryo&#39;s worden afgebeeld ongeveer 2 uur na het begin van inzameling, dus begin van de volgende stappen, die voldoende tijd om ze te voltooien binnen dit tijdsbestek. <ol><li> Met een vochtige borstel zorgvuldig pick-up van de embryo&#39;s uit het druivensap bord en leg ze op dubbele kleefband op de dia. </li><li> Met behulp van het buitenste deel van het pincet, rol de embryo&#39;s over de dubbele kleefband tot het chorion (het buitenste membraan) breekt open. </li><li> Pak de embryo door zacht glooiende het over het chorion zo vastzit aan de pincet en plaats deze op de heptaan lijm op de dekglaasje met de lange zijde van het embryo parallel aan de lange kant van het dekglaasje. Opgezet 10 tot 20 embryo&#39;s in een rij. </li><li> Verwijder de dekglaasje en plaats deze in de uitdroging kamer voor 3 tot 8 minuten (dit is afhankelijk van de vochtigheid van de ruimte en de hoeveelheid te injecteren). </li><li> Leg ze op een metalen kamer met een vacuüm vet. </li><li> Bedek de embryo&#39;s met halogene olie 700 om te voorkomen dat verdere uitdroging. Embryo&#39;s zijn nu klaar voor injectie. </li></ol> Embryo injectie: <ol><li> Vind de embryo&#39;s onder een 16x doelstelling. </li><li> Af te stappen van de embryo&#39;s, en vind de naald, zonder het verplaatsen van de focal plane. </li><li> Het centrum van de naald en beweeg deze omhoog, zonder te bewegen in x-of y-richting. </li><li> Als de naald niet is geopend, zet de rand van het dekglaasje op het gebied van uitzicht, maar niet waar de naald zal zijn, en laat de naald naar dezelfde focal plane. Heel voorzichtig gaan de dekglaasje totdat hij raakt de naald en voorzichtig breekt open het. Als de naald is geopend, ga dan naar stap 5. (Naalden kan worden geopend met fluorwaterstofzuur voor het vullen). </li><li> Zet de embryo&#39;s met het oog op (maar niet waar de naald zal zijn), hoe lager de naald in de olie en zorg ervoor dat je leuke vloeibare druppels te verkrijgen van de naald. </li><li> Voorzichtig maar gestaag beweegt het embryo in de naald en injecteer een daling in het embryo en de buurt van de embryo. (Of volg de instructies van uw injectie apparaat). </li><li> Nadat alle embryo&#39;s zijn geïnjecteerd, zijn ze klaar voor waarnemingen aan een confocale microscoop. </li></ol> Beeldvorming: Het imago van de embryo&#39;s op een confocale microscoop met een 60 of 100x objectief: Opmerkingen: <ol><li> Het tijdsinterval op een time lapse serie dient te worden hooguit een paar seconden, omdat de mitose in het embryo is zeer snel, afhankelijk van de exacte proces te bestuderen. </li><li> Een 3D-serie of een enkel vlak kan worden verkregen, afhankelijk van het proces van belang. </li><li> Voor snelwerkende remmers, de overdracht van de injectie microscoop tot imaging microscoop moet snel. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1382/1382fig1.jpg" alt="figuur 1" /> Figuur 1: Studie van de mitose in de Drosophila syncytieel embryo. Kernen in het vroege embryo ondergaan snelle divisies zonder cytokinese tijdens cycli 10 tot en met 13 kernen vormen een monolaag op de cortex. A. Schematische voorstelling van vroege embryo met de kernen op cortex. Embryo kunnen uitdrukken GFP en / of RFP gelabelde eiwitten en kan worden gemicroinjecteerd met andere gelabelde eiwitten en / of inhibitoren. B. Time lapse beeldvorming van embryo tot expressie GFP-tubuline en RFP-histon. C. Perceel van pole-pole scheiding voor fietsen 11 , 12 en 13 in een wild-type embryo. As lengte vertoont periodes van isometrische lengte en periodes van rek, die zeer consistent en reproduceerbaar zijn. D. Dynamica van spindel microtubuli. Injectie van lage concentratie van rhodamine tubuline leidt tot spikkels gevormd uit een enkele tubuline subeenheden, die kan worden gebruikt om de dynamiek van microtubuli te bestuderen.

<ol><li>Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+spindle+dynamics+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Mitotic spindle dynamics in Drosophila.</a> Int Rev Cytol. 259, 139-172 (2007).</li>
<li>Duffy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GAL4+system+in+Drosophila%3A+a+fly+geneticist%27s+Swiss+army+knife%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife.</a> Genesis. 34, 1-15 (2002).</li>
<li>Morris, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+methods+for+analyzing+the+functions+of+kinesins+in+early+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Microinjection methods for analyzing the functions of kinesins in early embryos.</a> Methods Mol Biol. 164, 163-172 (2001).</li>
<li>Brust-Mascher, I., Sommi, P., Cheerambathur, D. K., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin-5-dependent+poleward+flux+and+spindle+length+control+in+Drosophila+embryo+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Kinesin-5-dependent poleward flux and spindle length control in Drosophila embryo mitosis.</a> Mol Biol Cell. 20, 1749-1762 (2009).</li>
<li>Brust-Mascher, I., Civelekoglu-Scholey, G., Kwon, M., Mogilner, A., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+for+anaphase+B%3A+role+of+three+mitotic+motors+in+a+switch+from+poleward+flux+to+spindle+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Model for anaphase B: role of three mitotic motors in a switch from poleward flux to spindle elongation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 15938-15943 (2004).</li>
<li>Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+flux+and+sliding+in+mitotic+spindles+of+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Microtubule flux and sliding in mitotic spindles of Drosophila embryos.</a> Mol Biol Cell. 13, 3967-3975 (2002).</li>
<li>Cheerambathur, D. K., Brust-Mascher, I., Civelekoglu-Scholey, G., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+partitioning+of+mitotic+kinesin-5+crosslinkers+between+microtubule-bound+and+freely+diffusing+states%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic partitioning of mitotic kinesin-5 crosslinkers between microtubule-bound and freely diffusing states.</a> J Cell Biol. 182, 421-428 (2008).</li>
<li>Cheerambathur, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+an+anaphase+B+switch%3A+predicted+role+for+a+microtubule+catastrophe+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of an anaphase B switch: predicted role for a microtubule catastrophe gradient.</a> J Cell Biol. 177, 995-1004 (2007).</li>
<li>Kwon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chromokinesin%2C+KLP3A%2C+dives+mitotic+spindle+pole+separation+during+prometaphase+and+anaphase+and+facilitates+chromatid+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The chromokinesin, KLP3A, dives mitotic spindle pole separation during prometaphase and anaphase and facilitates chromatid motility.</a> Mol Biol Cell. 15, 219-233 (2004).</li>
<li>Sharp, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+coordination+of+three+mitotic+motors+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional coordination of three mitotic motors in Drosophila embryos.</a> Mol Biol Cell. 11, 241-253 (2000).</li>
<li>Sharp, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bipolar+kinesin%2C+KLP61F%2C+cross-links+microtubules+within+interpolar+microtubule+bundles+of+Drosophila+embryonic+mitotic+spindles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The bipolar kinesin, KLP61F, cross-links microtubules within interpolar microtubule bundles of Drosophila embryonic mitotic spindles.</a> J Cell Biol. 144, 125-138 (1999).</li>
<li>Sharp, D. J., Rogers, G. C., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+dynein+is+required+for+poleward+chromosome+movement+during+mitosis+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic dynein is required for poleward chromosome movement during mitosis in Drosophila embryos.</a> Nat Cell Biol. 2, 922-930 (2000).</li>
<li>Sharp, D. J., Yu, K. R., Sisson, J. C., Sullivan, W., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonistic+microtubule-sliding+motors+position+mitotic+centrosomes+in+Drosophila+early+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Antagonistic microtubule-sliding motors position mitotic centrosomes in Drosophila early embryos.</a> Nat Cell Biol. 1, 51-54 (1999).</li>
<li>Waterman-Storer, C. M., Desai, A., Bulinski, J. C., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+speckle+microscopy%2C+a+method+to+visualize+the+dynamics+of+protein+assemblies+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent speckle microscopy, a method to visualize the dynamics of protein assemblies in living cells.</a> Curr Biol. 8, 1227-1230 (1998).</li>
</ol>

Dit protocol is relatief eenvoudig, maar elke stap de praktijk nodig heeft om te zorgen dat de embryo&#39;s niet beschadigd zijn. Een zorgvuldige controle-experimenten moeten altijd worden gedaan om ervoor te zorgen dat betrouwbare resultaten worden verkregen. Een goede manier om dit te beginnen is door microinjecting buffer of rhodamine tubuline in de controle-embryo&#39;s uiten van GFP-tubuline om ervoor te zorgen dat de mitose normaal verloopt door alle cycli bij de embryo oppervlak (cycli 10 tot en met 13). In contr...

micro-injectie technieken voor het bestuderen van mitose in de drosophila melanogaster syncytieel embryo

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Dit protocol beschrijft het gebruik van de Drosophila melanogaster syncytieel embryo&#39;s voor het bestuderen van mitose 1. Drosophila is nuttig genetica met een gesequenced genoom, en kan eenvoudig worden onderhouden en gemanipuleerd. Veel mitotische mutanten bestaan, en transgene vliegen uiten van functionele fluorescent (bijv. GFP) - tagged mitotische eiwitten zijn en worden gegenereerd. Gerichte genexpressie is mogelijk met de GAL4/UAS systeem 2. De Drosophila vroege embryo voert meerdere mitoses zeer snel (celcyclus duur, ≈ 10 min). Het is zeer geschikt voor de beeldvorming mitose, want tijdens de cycli 10-13, kernen verdelen snel en synchroon zonder in te grijpen cytokinese op het oppervlak van het embryo in een monolaag net onder de cortex. Deze snel delende kernen waarschijnlijk gebruik maken van dezelfde machines als mitotische andere cellen, maar ze zijn geoptimaliseerd voor snelheid, het ijkpunt wordt algemeen aangenomen dat niet te streng, waardoor de studie van de mitotische eiwitten wier afwezigheid zou de celcyclus veroorzaken in cellen met een sterke checkpoint . Embryo&#39;s uitdrukken GFP gelabelde eiwitten of gemicroinjecteerd met fluorescent gelabelde eiwitten kunnen eenvoudig worden gescand om te leven dynamiek (fig. 1) te volgen. Daarnaast kunnen embryo&#39;s worden gemicroinjecteerd met functie-blokkerende antilichamen of remmers van specifieke eiwitten om het effect van het verlies of verstoring van hun functie 3 studie. Deze reagentia kan diffunderen door het embryo, het bereiken van een groot aantal spindels met een helling van de concentratie van de remmer, die op zijn beurt resulteert in een gradiënt van gebreken die vergelijkbaar zijn met een allelische reeks van mutanten. Productie In het ideale geval als het doel eiwit fluorescent gelabeld is, kan de gradiënt van remming direct gevisualiseerd 4. Aangenomen wordt dat de sterkste fenotype is vergelijkbaar met de nul-fenotype, ook al is het moeilijk om formeel uitgesloten dat de antilichamen kunnen dominante effecten in zeldzame gevallen, zo strenge controle en voorzichtige interpretatie hebben moeten worden toegepast. Verder weg van de plaats van injectie, eiwit-functie is slechts gedeeltelijk verloren gaat waardoor andere functies van het doelwit eiwit aan zichtbaar worden.

Dit protocol beschrijft het gebruik van micro-injectie en een hoge resolutie beeldvorming in de<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Syncytieel embryo mitose te bestuderen.

Micro-injectie technieken voor het bestuderen van mitose in de Drosophila melanogaster Syncytieel Embryo

Dit protocol beschrijft het gebruik van het syncytiale embryo van Drosophila melanogaster voor het bestuderen van mitose1. Drosophila beschikt over nutige genetische eigenschappen met een gesequenced...

Deze procedure begint met het verzamelen van embryo's op verse druivensapplaten gedurende 30 tot 60 minuten. Haal de plaat uit de kooi in het meer, raap de embryo's op met een bevochtigde kwast en plaats ze op dubbelzijdige plakband. Rol één embryo voorzichtig over het plakband met één helft van een pincet totdat het chorion openscheurt.Pak het embryo op en plaats het voorzichtig op het dekglas. Breng een laag hete lijm aan. Herhaal dit totdat u voldoende embryo's heeft.Na dehydratie zijn de embryo's klaar voor injectie. Hallo, ik ben Ingrid Bruce Musher van het laboratorium van Dr. Jonathan Sculley van de afdeling Moleculaire en Cellulaire Biologie aan de University of California Davis. Vandaag laten we u een procedure zien voor het micro-injecteren van syncytiale embryo's van drosophila.We gebruiken deze procedure om de rol van microtubuli en mitrale motoren tijdens de mitose te bestuderen. Zo micro-injecteren we antilichamen of andere remmers van specifieke mitotische eiwitten. Door het effect van de remmer op de mitose te analyseren, kunnen we de functie van het doeleiwit bepalen.Laten we beginnen. Om twee tot drie dagen voor het experiment met de voorbereidingen te starten, richt u de legkooi in door twee kleine gaten van ongeveer één centimeter vierkant aan tegenovergestelde zijden van een plastic fles te snijden. Vul de gaten met een stukje watten, zodat de luchtstroom behouden blijft.Tik de vliegen in de fles en dek deze vervolgens af met een druivensapplaat. Bewaar de kooi met gist op kamertemperatuur; de vliegen zullen tot 10 dagen eitjes leggen, minstens één dag vóór het experiment. Trek de injectienaalden klaar en bewaar deze bij vier graden Celsius.Bereid op de dag van het experiment de naalden voor en laad deze. Haal eerst de gelabelde tubuline uit de vriezer en plaats deze gedurende vijf tot 15 minuten op ijs. Verdun het vervolgens met GPEM-buffer en centrifugeer het daarna 10 tot 15 minuten bij 13 000 RPM op vier graden Celsius.Laad tot slot één tot twee µL in de naald en bewaar deze bij 4 °C om temperatuurgeïnduceerde polymerisatie in de naald te voorkomen. Maak voor het plaatsen van het dekglas heptaanlijm door dubbelzijdige plakband op te rollen en dit in een fles van 100 mL te plaatsen.Voeg ongeveer 50 milliliters heptaan toe, sluit de fles af en schud deze gedurende enkele dagen. Maak, voordat de embryo's worden voorbereid, een dehydratiekamer waarin de embryo's vóór de injectie worden geplaatst. Doe dit door een deel van een 35 millimeter schaaltje in een 100 millimeter Petrischaal te plaatsen om een tafel te vormen; voeg vervolgens droogmiddel, namelijk watervrij calciumsulfaat, eromheen toe, zodat de hoogte van het droogmiddel niet hoger is dan de tafel, en dek dit af.Om de embryo's voor te bereiden, verzamel je deze eerst uit de lake-cage door elk uur de druivensapplaat met gist te vervangen; de embryo's moeten ongeveer twee uur na het begin van de collectie worden gefotografeerd. Om het dekglas voor te bereiden, plaats je dit op één zijde van een microscoopglaasje en plak je de vier hoeken vast zodat het niet verschuift. Breng met een wattenstaafje één laag heptaanlijm in een lijn aan op het dekglas.De lijm mag niet stroperig zijn en moet binnen enkele seconden drogen. Als deze te dik is, voeg dan meer heptaan toe. Plak tot slot een stukje dubbelzijdige plakband op de objectglas naast het dekglas.Breng een beetje slip aan met een vochtig penseel. Pak de embryo's voorzichtig op van de druivensapplaat en plaats ze op de dubbelzijdige plakband op de objectglas. Gebruik vervolgens één zijde van een pincet om de embryo's over de dubbelzijdige plakband te rollen totdat het chorion openscheurt.Pak het embryo op door het voorzichtig over het Corian te rollen zodat het aan de pincet hecht, en plaats het op de heptaanlijm op het dekglas. Schuif het dekglas zodanig dat de lange zijde van het embryo parallel loopt aan de lange zijde van het dekglas. Plaats 10 tot 20 embryo's in één rij.Verwijder het dekglas en plaats het gedurende drie tot acht minuten in de dehydratiekamer. De tijd is afhankelijk van de lokale luchtvochtigheid en de hoeveelheid die geïnjecteerd moet worden. Plaats het dekglas vervolgens op een metalen kamer met vacuümvet.Dek de embryo's ten slotte af met halocarbonolie om verdere uitdroging te voorkomen. De embryo's zijn nu klaar voor injectie. Lokaliseer eerst de embryo's onder een 16 x objectief.Verplaats de embryo's en zoek de naald zonder het brandvlak te wijzigen. Centreer de naald en beweeg deze omhoog zonder deze in de X- of Y-richting te verplaatsen. Om de naald te openen, plaatst u de rand van het dekglas in het gezichtsveld, maar niet op de plek waar de naald zich zal bevinden.Breng de naald vervolgens naar hetzelfde brandvlak. Verplaats het dekglas zeer voorzichtig totdat het de naald raakt en deze zachtjes openbreekt. Beweeg de naald omhoog.Breng nu de embryo's in beeld. Laat de naald in de olie zakken en zorg ervoor dat er mooie vloeistofdruppels uit de naald komen. Beweeg het embryo gestaag naar de naald toe, injecteer een druppel in het embryo en verplaats het embryo vervolgens weg.Nadat alle embryo's zijn geïnjecteerd, kunnen ze worden geobserveerd met een confocale microscoop met een 60x of 100x objectief. Een controle-embryo zou eruit moeten zien als het embryo in deze video. Dit is een embryo dat GFP-tubuline en RFP-histon tot expressie brengt, gefotografeerd met een 100x objectief op een spinning disc confocale microscoop.De totale getoonde tijd is acht minuten. Grafieken van de afstand van pool tot pool zijn zeer reproduceerbaar en vormen een betrouwbare maatstaf voor succes in controle-embryo's. Deze zouden eruit moeten zien als die die hier worden getoond voor cyclus 11 tot en met 13.In deze film wordt een ander controle-embryo getoond. Dit embryo tot overexpressie van KLP 61 FGFP en is geïnjecteerd met r Domine tubuline. Ook dit is gefotografeerd met een 100 x objectief op een spinning disc confocale microscoop, en de totale tijdsduur is zeven minuten.Deze film is onmiddellijk na micro-injectie opgenomen, en de gradiënt in de concentratie van r Domine tubuline is duidelijk zichtbaar aan het begin van de film. Deze embryo's kunnen worden gebruikt om de inhibitie van Klp 61 F te bestuderen na micro-injectie van Klp 61 F-antilichamen. We kunnen het verlies van Klp 61 FGFP uit de spoelen zien.We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u micro-injecties uitvoert in drosophilas incisional embryo's. Bij deze procedure is het belangrijk om controles uit te voeren; oefen eerst met het injecteren van alleen buffer of rutin, en controleer of de mitose normaal verloopt tijdens de cellulaire fase. Zodra al uw injecties betrouwbaar zijn en geen schade veroorzaken, kunt u een inhibitor injecteren en het effect van die specifieke inhibitie bestuderen.Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

microinjection-techniques-for-studying-mitosis-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Drosophila hemocytes verspreiden over het geheel van de zich ontwikkelende embryo. Dit protocol laat zien hoe te monteren en het imago van deze migraties met behulp van embryo's met fluorescent gelabelde hemocytes.

Live-beeldvorming van Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migraties

De kinetochoor is waar de SAC initieert het signaal het toezicht op de mitotische segregatie van de zuster chromatiden. Een methode wordt beschreven om de werving en de omzet van een van de kinetochoor eiwitten en de coördinatie te visualiseren met het chromosoom beweging...

Studeren Mitotische Checkpoint door te laten zien Dynamic kinetochoor Protein Gedrag en Chromosoom Motion in Living<em&gt; Drosophila</em&gt; Syncytieel Embryo&#39;s

Vanwege hun grote omvang en relatief eenvoudige organisatie zijn drosophila-verpleegkundige cellen bij uitstek geschikt voor live celbeeldvormingsstudies. Deze video beschrijft een micro-injectiemethode voor de levering van exogene verbindingen in de cellen, en het aanbevolen protocol demonstreert de procedure met fluorescerende oligonucleotide-sondes genaamd moleculaire bakens (MB's) die worden gebruikt om endogene mRNA-transcripties te visualiseren.

Micro-injection van Drosophila Verpleegkundige Cellen: Een Methode van Intracellulaire Levering

Deze video beschrijft hoe u micro-invoegingen uitvoert die reagentia leveren in levende Drosophila-embryo's. Onderzoekers kunnen deze methode gebruiken om exogene verbindingen zoals nucleïnezuren en eiwitten te introduceren tijdens de vroege stadia van embryo-ontwikkeling. Het aanbevolen protocol demonstreert hoe de procedure voor injectie van een oplosbaar reagens moet worden opgezet en uitgevoerd - hier een fluorescerend eiwit voor live beeldvormingsexperimenten.

Micro-injection van Levende Embryo's Drosophila: Vroege Levering van Reagentia aan het Ontwikkelende Embryo

We een techniek voor etikettering enkele neuronen in het centrale zenuwstelsel (CNS)...

Labeling van afzonderlijke cellen in het centrale zenuwstelsel van<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Hier presenteren we een protocol voor de visualisatie, detectie, analyse en tracking van endogene mRNA-handel in levende Drosophila melanogaster Eier kamer met behulp van moleculaire bakens, draaiende schijf confocale microscopie en open-source analyse Software.

Visualisering en opvolging van endogene Mrna's in levende Drosophila melanogaster Eier kamers

Het doel van dit protocol is om Rhodamine-geconjugeerde bolvormige actine te injecteren in Drosophila embryo's en beeld intranucleaire actine staaf assemblage na hitte stress.

Beeldvorming Intranucleaire Actin Staven in Live Heat Stressed Drosophila Embryo's

Hier gepresenteerd is een protocol om micro-injectie en tegelijkertijd beeld meerdere Drosophila embryo's tijdens de embryonale ontwikkeling met behulp van een plaat-gebaseerde, hoog gehalte imager.

Drosophila Embryo Preparatuur en microinjectie voor live celmicroscopie uitgevoerd met behulp van een geautomatiseerde high content analyzer

Dit artikel neemt de phiC31-integrase-gemedieerde transgenese in Drosophila als voorbeeld en presenteert een geoptimaliseerd protocol voor micro-injectie van embryo's, een cruciale stap voor het creëren van transgene vliegen.

Embryo-micro-injectie voor transgenese bij Drosophila

Hier bieden we een gedetailleerd protocol om live beeldvorming uit te voeren van de asymmetrische deling van germinale stamcellen (GSC's) in de Drosophila ovarium-niche. We gebruiken een transgene lijn die ubiquitair een groen fluorescent eiwit (GFP) tot expressie brengt, een fusie van het spectrosoom-eiwit Par-1.

Uitgebreide live beeldvorming van vrouwelijke Drosophila melanogaster kiembaanstammecellen niches

Deze protocollen beschrijven hoe de organisatie en occluderende functie van geplooide septaatverbindingen in controle- en mutante Drosophila-embryonale epitheel karakteriseerd kunnen worden.

Immunokleuring en kleurstofpenetratie-experimenten om kerngeplooide septaat-junction-eiwitten te definiëren in het embryonale epitheel van Drosophila

Leer micro-injectietechnieken om mitose te bestuderen in Drosophila melanogaster syncytiale embryo's met hoge-resolutiebeeldvorming. Deze methode helpt onderzoekers celdelingsdynamiek in vivo te analyseren.

Micro-injectie technieken voor het bestuderen van mitose in de Drosophila melanogaster Syncytieel Embryo

Meer video's verkennen