Micro-injectie technieken voor het bestuderen van mitose in de Drosophila melanogaster Syncytieel Embryo
15 september 2009
Dit protocol beschrijft het gebruik van micro-injectie en een hoge resolutie beeldvorming in de Drosophila melanogaster Syncytieel embryo mitose te bestuderen.
Deze procedure begint met het verzamelen van embryo's op verse druivensap platen gedurende 30 tot 60 minuten. Nadat de plaat uit de vijverkooi is verwijderd, pak je de embryo's op met een vochtige borstel en plaats ze op dubbelzijdig plakband. Rol voorzichtig één embryo over het plakband met één helft van een pincet totdat het corion openbreekt.
Pak het embryo op en plaats het voorzichtig op de cover. Plaats er een laagje het lijm over. Herhaal dit totdat je genoeg embryo's hebt.
Na dehydratatie zijn de embryo's klaar voor injectie. Hallo, ik ben Ingrid Bruce Musher van het laboratorium van Dr. Jonathan Sculley in de afdeling Moleculaire en Cellulaire Biologie aan de Universiteit van Californië Davis. Vandaag laten we je een procedure zien om micro injecties uit te voeren in syncytiale embryo's van de fruitvlieg.
We gebruiken deze procedure om de rol van microtubuli en mitral gebaseerde motoren in mitose te bestuderen. Bijvoorbeeld, we micro injecteren antilichamen of andere remmers van specifieke mitotische eiwitten. Door de effecten van de remmer op de mitose te analyseren, kunnen we de functie van de doeleiwitten bepalen.
Dus laten we beginnen. Om voorbereidingen te treffen twee tot drie dagen voor het experiment, zet je de legkooi op door twee kleine gaatjes van ongeveer een centimeter vierkant aan te snijden aan tegenoverliggende kanten van een plastic fles. Vul de gaatjes met een stukje katoen, zodat er lucht kan stromen.
Tap de vliegen in de fles en bedek het vervolgens met een druivensapplaat. Met gist, houd de legkooi op kamertemperatuur; vliegen leggen gedurende maximaal 10 dagen eieren, minimaal één dag voor het experiment. Maak naalden klaar voor injectie en bewaar ze op vier graden Celsius.
Op de dag van het experiment, bereid en laad de naalden. Neem eerst het gelabelde tubuline uit de vriezer en leg het vijf tot vijftien minuten op ijs. Verdun het vervolgens met GPEM buffer en centrifugeer het vervolgens gedurende 10 tot 15 minuten bij 13.000 RPM en vier graden Celsius.
Laad ten slotte een tot twee microliters in de naald en bewaar het op vier graden Celsius. Om temperatuurgeïnduceerde polymerisatie in de naald te voorkomen. Voordat je de coverslip gaat plaatsen, maak heptaanlijm door dubbelzijdig plakband te rollen en in een 100 milliliter fles te plaatsen.
Voeg ongeveer 50 milliliter heptaan toe, sluit de fles en schudden gedurende enkele dagen. Voordat je de embryo's voorbereidt, maak je een dehydratiekamer waarin de embryo's geplaatst worden voorafgaand aan de injectie. Om dit te doen, plaats je een deel van een 35 millimeter schaal in een 100 millimeter petrischaal om een tafel te maken, voeg een anhydrous calciumsulfaat aan de rechterkant toe zodat de hoogte van de droogkamer niet hoger is dan de tafel en dek af.
Om te beginnen met het voorbereiden van de embryo's, verzamel ze eerst uit de vijverkooi door elke uur de druivensapplaat met gist te vervangen, de embryo's moeten ongeveer twee uur na het begin van het verzamelen geïmageed worden. Om de coverslip voor te bereiden, plaats je deze aan één kant van een microscoop, leg de vier hoeken vast zodat deze niet beweegt. Gebruik een wattenstaafje om een laagje heptaanlijm in een lijn op de coverslip te leggen.
De lijm mag niet stroperig zijn en moet binnen enkele seconden drogen. Als het te dik is, voeg je meer heptaan toe. Plaats ten slotte een stukje dubbelzijdig plakband naast de cover op de glijbaan.
Slip met een vochtige borstel. Pak de embryo's voorzichtig van de druivensapplaat en plaats ze op het dubbelzijdige plakband op de glijbaan. Gebruik vervolgens één helft van een pincet om de embryo's over het dubbelzijdige plakband te rollen totdat het corion openbreekt.
Pak het embryo op door het voorzichtig over het Corian te rollen zodat het aan het pincet blijft plakken en plaats het op de heptaanlijm op de cover. Plaats de glijbaan met de lange kant van het embryo evenwijdig aan de lange kant van de coverslip. Plaats 10 tot 20 embryo's in een rij.
Verwijder de coverslip en plaats deze gedurende drie tot acht minuten in de dehydratiekamer. De tijd hangt af van de lokale luchtvochtigheid en de hoeveelheid die moet worden geïnjecteerd. Plaats vervolgens de coverslip op een metalen kamer met vacuümvet.
Bedek tenslotte de embryo's met halo koolstof olie om verdere dehydratie te voorkomen. De embryo's zijn nu klaar voor injectie. Zoek eerst de embryo's onder een 16 x objectief.
Verplaats de embryo's weg en vind de naald zonder het brandpunt te verplaatsen. Centreer de naald en verplaats deze omhoog zonder deze in de X of Y richting te verplaatsen. Om de naald te openen, plaats je de rand van de coverslip in het gezichtsveld, maar niet waar de naald zal zijn.
En laat de naald naar hetzelfde brandpunt zakken. Beweeg voorzichtig de coverslip totdat deze de naald raakt en breekt deze voorzichtig open. Verplaats de naald omhoog.
Breng nu de embryo's in beeld. Laat de naald in de olie zakken en zorg ervoor dat je mooie vloeibare druppels uit de naald haalt. Beweeg het embryo gestaag de naald in, injecteer een druppel in het embryo en verplaats vervolgens het embryo weg.
Nadat alle embryo's zijn geïnjecteerd, zijn ze klaar voor observatie op een confocale microscoop met een 60 of 100 x objectief. Een controle-embryo zou eruit moeten zien als deze in deze film. Dit is een embryo dat GFP tubuline en RFP histone toont, geïmageed met een 100 x objectief op een spinning disc confocale microscoop.
De getoonde tijd is acht minuten. Plots van pool tot pool afstand zijn zeer reproduceerbaar en zijn een betrouwbare maatstaf voor succes in controle-embryo's. Ze zouden eruit moeten zien zoals hier getoond voor cycli 11 tot 13.
In deze film wordt een ander controle-embryo getoond. Dit toont KLP 61 FGFP en is geïnjecteerd met r Domine tubuline. Dit werd ook geïm
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft het gebruik van micro-injectie en imaging met een hoge resolutie in het syncytiale embryo van Drosophila melanogaster om mitose te bestuderen. De procedure omvat een zorgvuldige hantering van de embryo's om succesvolle imaging en analyse te waarborgen.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Ontwikkelingsbiologie
- Celbiologie
Achtergrond
- Drosophila melanogaster is een modelorganisme dat veelvuldig wordt gebruikt in biologisch onderzoek.
- Een goed begrip van mitose is essentieel voor inzicht in celdeling en ontwikkeling.
- Beeldvormingstechnieken met een hoge resolutie verbeteren de observatie van cellulaire processen.
- Micro-injectie maakt nauwkeurige manipulatie van embryo's mogelijk voor experimentele doeleinden.
Doel van de studie
- Het onderzoeken van de dynamiek van mitose in Drosophila-embryo's.
- Het benutten van geavanceerde beeldvormingstechnieken voor gedetailleerde cellulaire observatie.
- Het vaststellen van een betrouwbaar protocol voor toekomstige studies in de ontwikkelingsbiologie.
Gebruikte methoden
- Verzamelen van embryo's op druivensapplaten.
- Micro-injectie van embryo's voor experimentele manipulatie.
- Hoge-resolutiebeeldvorming om mitotische processen waar te nemen.
- Voorzichtige behandeling van embryo's om schade tijdens de preparatie te voorkomen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van mitotische fasen in Drosophila-embryo's.
- Aantoonde effectiviteit van microinjectietechnieken.
- Bood inzichten in de timing en regulatie van celdeling.
- Vormde een kader voor toekomstig onderzoek naar embryonale ontwikkeling.
Conclusies
- Het protocol is effectief voor het bestuderen van mitose in Drosophila-embryo's.
- Beeldvorming met een hoge resolutie is cruciaal voor het begrijpen van cellulaire dynamiek.
- Deze studie draagt bij aan het bredere vakgebied van de ontwikkelingsbiologie.
Veelgestelde Vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Dit protocol maakt functionele analyse van mitotische eiwitten mogelijk in een snel, synchroon in vivo-systeem, wat doelwitvalidatie ondersteunt via fenotypische uitlezingen van eiwitremming. Het syncytiale Drosophila-embryo biedt een ziekterelateerd systeem voor mechanische risicoanalyse van mitotische doelwitten, waardoor de eiwitfunctie kan worden beoordeeld voorafgaand aan de identificatie van lead-verbindingen. Kwantitatieve beeldvorming van spoeldynamiek biedt voorspellend vertrouwen in de essentialiteit van het doelwit en de betrokkenheid van de signaalroute.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door het visualiseren van loss-of-function-fenotypes via eiwit-specifieke antilichaam-microinjectie.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door gradiënt-afhankelijke fenotypische series die lijken op allelische mutanten.
- Voorspellende waarde: Faciliteert de beoordeling van target-betrouwbaarheid door de remmingssterkte te correleren met de ernst van mitotische defecten.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Genereert gestandaardiseerde, reproduceerbare mitotische resultaten (pool-tot-pool afstand) voor het screenen van verbindingen of inhibitoren.
- Kwantitatieve output: Levert meetbare, op beeldvorming gebaseerde eindpunten die dosis-responsanalyse van proteïne-inhibitie mogelijk maken.
- Schaalbaarheid: Maakt parallelle embryo-preparatie en beeldvorming mogelijk voor functionele validatie met een gemiddelde doorvoersnelheid.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: De conservatie van het mitotische apparaat ondersteunt de translationele uitlijning van biomarkers met menselijke celdelingsroutes.
- Preklinische continuïteit: Maakt mechanistische follow-up mogelijk van genetische hits naar functionele validatie in een levend systeem.
- Risicogebaseerde beslissingen: Helpt bij het prioriteren van targets op basis van fenotypische penetrantie en specificiteit van inhibitie.
Integratie van pipeline & workflow
De methode past binnen de vroege ontdekkingsfase om mitotische targets te valideren vóór de stadia van assay-ontwikkeling en lead-identificatie, waarbij gebruik wordt gemaakt van in vivo functionaliteit.
- Discovery Biology: Ondersteunt de verduidelijking van signaalpaden en functionele targetvalidatie via directe perturbatie van mitotische eiwitten.
- Screening: Maakt assay-gereedheid mogelijk door gestandaardiseerde, kwantificeerbare read-outs van mitotische imaging.
- Analytics: Levert objectieve, op imaging gebaseerde metingen (bijv. spoellengte) om experimentele condities te vergelijken.
- Translationeel onderzoek: Legt een verband met preklinisch werk via geconserveerde mitotische mechanismen en behoud van eiwitfunctie.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor iteratieve targetvalidatie over meerdere mitotische regulatoren.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen in de doelfunctie door directe, reversibele proteïnremming in vivo.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid via gestandaardiseerde protocollen voor embryo-preparatie en injectie.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door mechanistische ambiguïteit in doelpaden te verminderen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van doelen mogelijk met behulp van fenotypische ernstgradiënten.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in de hantering van embryo's, micro-injectie en live confocale beeldvorming.
- Afhankelijk van micro-injectieapparatuur, antifade-oliën en imaging-systemen met een hoge resolutie.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor de stadiering van embryo's en de consistentie van de injecties.
- Overwegingen bij aanpassing omvatten de oplosbaarheid van eiwitten, de functionaliteit van antilichamen en de compatibiliteit van fluorescerende tags.
- Praktische beperkingen omvatten de levensvatbaarheid van embryo's na injectie en potentiële diffusiebarrières in grotere embryo's.
