Geboren Normalisatie voor fluorescentie optische projectie Tomografie voor Whole Heart Imaging

Om genormaliseerde born optische projectietomografie uit te voeren, wordt het monster eerst gefixeerd en ingebed in een cilinder agar. Het monster wordt vervolgens gedraaid langs een verticale as en daarna uniform belicht met een excitatiegolflengte, waarna de transmissie wordt gemeten met C, CD geschikte optica. Het fluorescentiesignaal bij de golflengte wordt gemeten in transilluminatiemodus.

De verkregen fluorescentie- en absorptiebeelden worden gebruikt om de genormaliseerde born-ratio te bepalen en de distributie van fluoroforen binnen het monster te reconstrueren. Hoi, mijn naam is Claudia Naone en ik werk bij de Centers for Systems Biology van het Mass General Hospital, Harvard Medical School. Ik ben Danielle Raki van het Institute for Biological and Medical Imaging aan de Technische Universiteit München en Al Center München.

Ik ben Giselle Fido. Ik ben de directeur van Experimental su Co hier bij C-M-I-C-S-B, Massachusetts General Hospital, Harvard Med School. Vandaag laten we u een procedure zien voor real-time ex vivo beeldvorming van hele organen met behulp van de Born-genormaliseerde benadering voor optische projectietomografie.

Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de distributie van fluorescentie moleculaire probes in holle organen te bestuderen. Laten we beginnen. Deze video legt de procedure uit voor het gebruik van optische projectietomografie om geprepareerde weefsels of organen te beelden, samen met een begeleidende video.

Wij leggen uit hoe dit systeem kan worden gebruikt om time-lapse-imaging uit te voeren op ontwikkelende drosophila. De driedimensionale beeldvormingstechniek van optische projectietomografie vereist een unieke combinatie van optica en een roterende tafel. In dit segment van de video zal de beeldvormingsprocedure worden toegelicht.

Om te beginnen dient de primaire lichtbron als bron voor zowel verlichtings- als absorptiemetingen, en om fluorescente excitatie te bieden voor fluorescentiemetingen wordt de primaire lichtbron eerst gefilterd met een smalbandig interferentiefilter. Vervolgens gaat het licht door een reeks vaste en variabele neutrale dichtheidsfilters. Deze zijn gecombineerd met een automatische sluiter om de hoeveelheid licht op het monster te regelen en laag genoeg te houden om fotobleken te voorkomen.

Een uniforme verlichting van het monster wordt bereikt door gebruik te maken van een beam expander en een gecombineerde Glan-telescooplens met een diffusielens. Tot slot worden optische smalbandige interferentiefilters gebruikt om het licht van de excitatiebron optisch te zuiveren. Het monster wordt ondergedompeld in een clearing-oplossing en voor beeldvorming op zijn plaats gehouden in een glazen buis.

Het monster wordt rond zijn verticale as gedraaid met behulp van een precisierotatietrap met een absolute nauwkeurigheid van 0,05 graden. Drie afzonderlijke handmatige controllers maken het mogelijk om de verticale as van het monster in het orthogonale vlak te kantelen en af te stellen. Het absorptiesignaal wordt verkregen via transmissieverlichting en wordt direct gedetecteerd door een CCD-camera.

Het fluorescentiesignaal wordt gefilterd via een nauwbandig banddoorlaat-interferentiefilter, gekoppeld aan een langdoorlaatfilter, en wordt vervolgens opgevangen met een telecentrische lens. Telecentrische lenzen bieden het voordeel van unieke kenmerken die hen ideaal maken voor optische projectietomografie.

De aanwezigheid van een diafragmastop in de lensbehuizing op het brandpunt van de lens is essentieel. Dit waarborgt dat het beeld parallel aan de optische as loopt. Hierdoor wordt perspectivische vervorming geëlimineerd en ontstaat een gelijke vergroting over diverse brandvlakken binnen de telecentrische diepte.

Het volgende videosegment beschrijft een techniek voor de preparatie van monsters. Hierna volgt de methodologie die wordt gebruikt voor beeldvorming. De preparatie van het monsterweefsel of orgaan voor tomografische beeldvorming berust op een ethanolgebaseerde dehydratie van het monster om asymmetrische krimp te voorkomen.

Dit proces duurt meerdere dagen om te voltooien. In deze video wordt een muizenhart geprepareerd, maar het protocol kan worden toegepast op elk weefsel of orgaan. We zullen onze fluorescentie-beeldmethode demonstreren met behulp van het hart van een dier dat een gecontroleerd infarct heeft ondergaan.

Met andere woorden, een verlies van bloedtoevoer die voorafgaand leidt tot duidelijke weefselnecrose. De muis is geïnjecteerd met pro sinds zes 80 inact fluorescente sensor die rapporteert over cathepsine-activiteit in het herstellende myocard. Anestheseer de muis voor perfusie en extractie van het hart middels een intraperitoneale injectie van ketamine en xylazine. Injecteer vervolgens 50 units heparine intraperitoneaal om coagulatie te voorkomen.

Voer vijf minuten later de longitudinale laparotomie uit bij het volledig geanestheseerde dier om het bloed te verwijderen. Open eerst de linker nierven. Injecteer vervolgens langzaam 20 milliliters zoutoplossing in de vena cava inferior.

De zoutoplossing verdringt het bloed nadat al het bloed onder een dissectiemicroscoop is weggespoeld. Gebruik vervolgens standaardoperatiemethoden om de thorax te openen en het hart te verwijderen. Fixeer het hart nu gedurende acht uur in 4% PFA bij vier graden Celsius.

Vanaf dit punt moeten de stappen voor de weefselpreparatie in het donker worden uitgevoerd om het bleken van fluorescerende contrastmiddelen of proteïnen die op het weefsel zijn aangebracht te voorkomen. Wanneer de fixatie voltooid is, wordt de PFA afgewassen met een spoeling van 15 minuten in PBS; het gereinigde hart wordt vervolgens ingebed in een plasje 0,8% agarose. Zodra de agarose is opgedroogd, wordt de agarose rondom het weefsel weggesneden om een blokvorm te creëren.

Dehydrateer vervolgens het encrypted hart van de aros via een vijfstapsreeks, beginnend met het weken in 20% Ethanol, gevolgd door progressief hogere concentraties ethanol en tenslotte pure ethanol. Deze dehydratatieprocedure helpt om asymmetrische krimp van het monster te voorkomen. De eerste vier baden in verdunde ethanol moeten gedurende een uur worden uitgevoerd en het laatste bad in 100% Ethanol moet gedurende ten minste 10 uur worden uitgevoerd.

Zodra de ethanolbehandelingen zijn voltooid, wordt het monster geplaatst in Murray's clear solution totdat het monster transparant wordt, wat kan variëren van enkele uren tot meerdere dagen. Deze klaring-oplossing bootst het cellulaire water na en matcht de brekingsindex van de celmembranen, waardoor het weefsel transparant wordt. Aan het einde van het klaringsproces kunnen minimale sporen ethanol aanwezig zijn, wat kan leiden tot diverse artefacten in de reconstructies door de thermische beweging van de alcohol binnen de klaringsoplossing zelf.

Om dit probleem te voorkomen, wordt een tweede klaringcyclus aanbevolen. Dit zou niet langer dan vier uur in beslag nemen. Zodra dit is voltooid, is het monster klaar voor optische projectie.

Tomografie met behulp van een computer. De reconstructie van optische absorptie in afwezigheid van lichtverstrooiing kan worden verkregen met een gangbaar gefilterd Radon-backprojection-algoritme. Dit proces is analoog aan tweedimensionale röntgen-computertomografie.

Plaats het blok aëros in de transparante beeldvormingskamer die is gevuld met de klaringoplossing. Monteer nu de kamer op de tafel en belicht het monster met een gecollimeerde bundel voor zowel excitatie- als transmissiemetingen. De keuze voor de excitatiebron is gebaseerd op het gekozen fluorescerende eiwit of het moleculaire beeldvormingscontrastmiddel.

Het is handig om de verticale as van het monster parallel uit te lijnen met de pixelkolom van de CCD. Roteer het monster over 360 projecties met hoekstappen van één graad en leg bij elke hoek beelden vast in transmissie-illuminatie bij zowel de absorptie- als de fluorescentiegolflengten. De software die de acquisitie aanstuurt, regelt automatisch de sluiter van de primaire lichtbron om continue belichting te voorkomen en fotobleking van het monster te verminderen.

De sluiter is bijzonder belangrijk wanneer lange integratietijden vereist zijn om een 3D-reconstructie te maken op basis van de absorptiegegevens. Gebruik voor de 3D-reconstructie van de fluorescentiebeelden simpelweg een gefilterd Radon-backprojection-algoritme. Andere absorptiebijdragen moeten in overweging worden genomen, welke worden beschreven in het volgende videosegment.

Na het voltooien van de stappen die vereist zijn voor een absorptiereconstructie, moeten er nog enkele stappen worden doorlopen om een fluorescentiereconstructie te voltooien. De reconstructie van een optische kaart in afwezigheid van lichtverstrooiing kan worden verkregen met behulp van een gangbaar gefilterd radon-backprojection-algoritme. Het proces is analoog aan tweedimensionale röntgentomografie.

Bij het reconstrueren van de fluorescentieverdeling maakt de variërende, ruimtelijk afhankelijke absorptie het gebruik van de inverse Radon-transformatie voor terugprojectie van de fluorescentiebeelden onjuist, wat de verkregen distributies van het fluorescerende eiwit of de fluorescerende moleculaire sonde en de kwantificeringsmogelijkheden ernstig beïnvloedt. Elke straal bij de excitatiegolflengte Lambda X die wordt uitgezonden vanuit een willekeurige bronpositie Xs, wordt exponentieel verzwakt terwijl deze door het afgebeelde object gaat.

Na excitatie van het fluorochroom op positie X wordt de straling bij de emissiegolflengte gefilterd en opgevangen door de pixel van de CCD op positie XD met behulp van het Teleric imaging lenssysteem. Hoewel de uitgezonden fluorescentie niet hetzelfde pad volgt als de excitatiestraal, benadert de geregistreerde intensiteit per pixel een projectie van alle fluorochromen die zijn geëxciteerd langs de gehele focale zone die overeenkomt met deze specifieke excitatiestraal. Dankzij de hoge telecentriciteit van het systeem wordt het afgebeelde object vervolgens 360 graden gedraaid en worden met de CCD-camera meerdere bron-detector-metingen verworven, UX bij de excitatiegolflengte en UFL bij de emissiegolflengte.

Deze worden vervolgens gecombineerd onder het genormaliseerde born-veld UB, gedefinieerd als de ratio van de twee. De reconstructie van de fluorochroomverdeling kan worden vergemakkelijkt door het voorwaartse model te schrijven voor zowel de excitatie- als emissielichtvoortplanting, waarbij de greens-functie de excitatie beschrijft. De straalvoortplanting volgt een eenvoudige beer-lambert-wet, waarbij moo A de eerder bepaalde optische absorptieverdeling is.

De lichtintensiteit UX die wordt uitgestraald door de bron op positie excess en wordt gemeten door de detector op positie XD op de C.C, D kan worden geschreven als het product van de Green-functie met een constante B die systeemafhankelijk is. De precieze distributie van de excitatie-lichtintensiteit GX langs elk straalpad kan vervolgens worden berekend. De fluorescentie-intensiteit UFL die wordt gedetecteerd bij de detector XD en die wordt gestimuleerd door het licht dat wordt uitgestraald vanuit de bron Xs, houdt rekening met de bijdrage van alle theros die zijn geëxciteerd langs het straalpad van X naar xd.

Het voorwaartse model van ons beeldvormingsprobleem kan vervolgens worden geschreven als ub ub, waarbij alpha de onbekende constanten bevat die systeemafhankelijk zijn. Het voorwaartse model wordt vervolgens gediscretiseerd op het aangenomen raster en er wordt een inversie uitgevoerd om de fluorochroomdistributie te extraheren, zowel het transmissie- als het fluorescentiesignaal te verwerven en het conventionele back-projection-algoritme te gebruiken om het monster te reconstrueren. Hier worden reconstructies via transmissie en conventionele fluorescentie optische projectietomografie getoond.

Een reconstructie van een enkel vlak van het hart wordt getoond in zowel absorptie als fluorescentie. De genormaliseerde Born-reconstructie wordt gepresenteerd en deze laat het verschil in de distributie van de kleurstof binnen het hart zien. Na normalisatie hebben we u zojuist laten zien hoe de opstelling voor optische projectietomografie werkt en hoe artefacten als gevolg van optische absorptie in de reconstructies voor fluorescentietomografie kunnen worden verwijderd.

Het is in feite zeer belangrijk om eraan te denken het monster te klaren om de bijdrage van verstrooid licht te verwijderen, maar tegelijkertijd is het ook belangrijk om het klaringsproces in balans te houden om zoveel mogelijk van de fluorescentiebijdrage te behouden. Een ander punt dat zeer belangrijk is om te onthouden bij het gebruik van deze aanpak, is het berekenen van de bot-genormaliseerde ratio, die wordt verkregen door de fluorescentiebeelden te delen door de absorptiebeelden. Dat is alles.

Bedankt voor het bekijken van ons gevisualiseerde experiment en veel succes met uw eigen experimenten.