Geboren Normalisatie voor fluorescentie optische projectie Tomografie voor Whole Heart Imaging
June 2nd, 2009
Wij stellen voor een genormaliseerd Geboren aanpak voor optische projectie Tomografie (BnOPT) die goed is voor de absorptie-eigenschappen van beeld gebracht monsters te verkrijgen accurate en kwantitatieve fluorescentie tomografische reconstructies. We maken gebruik van de voorgestelde algoritme om de fluorescentie moleculaire sonde distributie binnen kleine dierlijke organen te reconstrueren.
Om genormaliseerde Born-optische projectietomografie uit te voeren, wordt het monster eerst gefixeerd en ingebed in een cilinder van auger. Het monster wordt vervolgens geroteerd langs een verticale as en vervolgens uniform verlicht met een excitatiegolflengte, en de transmissie wordt gemeten met een C, CD geschikte optiek. Het fluorescente signaal bij de golflengte wordt gemeten in transilluminatiemodus.
De verkregen fluorescente en absorptiebeelden worden gebruikt om de genormaliseerde Born-verhouding te bepalen en de verdeling van fluoro viers binnen het monster te reconstrueren. Hallo, mijn naam is Claudia Naone en ik werk bij de Centers for Systems Biology in het Mass General Hospital, Harvard Medical School. Ik ben Danielle Raki van het Institute for Biological and Medical Imaging aan de Technische Universiteit van München en Al Center Munich.
Ik ben Giselle Fido. Ik ben de directeur van Experimental su Co hier bij C-M-I-C-S-B, Massachusetts General Hospital, Harvard Med School. Vandaag laten we u een procedure zien voor realtime ex vivo beeldvorming van hele organen met behulp van de Born-genormaliseerde benadering voor optische projectietomografie.
We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de verdeling van fluorescente moleculaire sondes in holle organen te bestuderen. Dus laten we beginnen. Deze video zal de procedure uitleggen voor het gebruik van optische projectietomografie om voorbereide weefsels of organen te beeldhouwen en een bijbehorende video.
We leggen uit hoe dit systeem te gebruiken is om time-lapse beeldvorming uit te voeren op zich ontwikkelende drosophila. De driedimensionale beeldvormingstechniek van optische projectietomografie vereist een unieke combinatie van optiek en een roterende tafel. In dit segment van de video zal de beeldvormingsprocedure worden toegelicht.
Om te beginnen dient de primaire lichtbron als bron voor zowel verlichting als absorptiemetingen, en om fluorescente excitatie te bieden voor fluorescentiemetingen, wordt de primaire lichtbron eerst gefilterd met een smalband doorlaatfilter. Vervolgens passeert het licht door een set vaste en variabele neutrale dichtheidsfilters. Deze worden gecombineerd met de aanwezigheid van een automatische sluiter om de hoeveelheid licht op het monster te regelen en om het laag genoeg te houden om elke fotobleken te voorkomen.
Uniforme belichting van het monster wordt bereikt door een straaluitbreider en een gecombineerde glan telescooplens met een diffusielense te gebruiken. Ten slotte worden optische smalband doorlaatfilters gebruikt om het excitatiebronlicht optisch te zuiveren. Het monster wordt ondergedompeld in een oplossing om het helder te maken en wordt in een glazen buis vastgehouden voor beeldvorming.
Het monster wordt geroteerd langs zijn verticale as door middel van een snelheidsrotatietafel met een absolute nauwkeurigheid van 0,05 graden. Drie verschillende handmatige controllers maken het mogelijk om de verticale as van het monster te kantelen en aan te passen in zijn orthogonale vlak. Het absorberende signaal wordt verkregen in transverlichting en wordt direct gedetecteerd door een CCD-camera.
Het fluorescente signaal wordt gefilterd door een smalband doorlaatfilter, gekoppeld aan een longpass-filter en wordt vervolgens verzameld met een telecentrische lens. Tele lenzen bieden het voordeel dat ze unieke kenmerken bieden die ze ideaal maken. Voor optische projectietomografie.
De aanwezigheid van een diafragma-stop die zich binnenin de lensconstructie bevindt op het brandpunt van de lens, is cruciaal. Het zorgt ervoor dat het beeld parallel aan de optische as reist. Dit elimineert perspectiefverstoring en biedt gelijke vergroting over veel brandpunten binnen de telecentrische diepte.
Het volgende videosegment beschrijft een techniek voor het voorbereiden van monsters. Dit zal worden gevolgd door de methodologie die wordt gebruikt voor beeldvorming. De voorbereiding van monsterweefsel of orgaan voor tomografische beeldvorming is afhankelijk van een op ethanol gebaseerde uitdroging van het monster die asymmetrische krimp voorkomt.
Dit proces duurt vele dagen om te voltooien. In deze video wordt een muizenhart voorbereid, maar het protocol kan op elk weefsel of orgaan worden toegepast. We zullen onze fluorescentiebeeldvormingsmethode demonstreren met behulp van het hart van een dier dat een gecontroleerde infarct heeft ondergaan.
Met andere woorden, een verlies van bloedtoevoer dat leidt tot duidelijke weefselnecrose in vooruitgang. De muis is geïnjecteerd met pro sinds zes 80 inactieve fluorescente sensor die rapporteert over cathepsine-activiteit bij genezing. Myocardium anesthetiseer de muis voor perfusie en hartextractie met behulp van een intraperitoneale injectie van ketamin en xylazine. Injecteer vervolgens 50 eenheden heparine intraperitoneaal om coagulatie te voorkomen.
Vijf minuten later voert u de longitudinale laparotomie uit op het volledig geanesthetiseerde dier om het bloed te verwijderen. Open eerst de linker nierslagader. Injecteer nu langzaam 20 milliliter zoutoplossing in de onderste holle ader.
De zoutoplossing verplaatst het bloed na het wegspoelen van al het bloed onder een dissectiemicroscoop. Ga verder met standaard werkmethoden om de thorax te openen en het hart te verwijderen. Bevestig het hart nu acht uur lang in 4% PFA bij vier graden Celsius.
Vanaf dit punt moeten de stappen voor de weefselvoorbereiding in het donker worden uitgevoerd om verbleken van fluorescente contrastmiddelen of eiwitten die op het weefsel zijn aangebracht, te voorkomen. Wanneer de fixatie is voltooid, spoelt u de PFA af met een 15 minuten durende spoeling in PBS, het opgeruimde hart wordt vervolgens ingebed in een pool van 0,8% aros. Zodra de aros droog is, wordt de agarose rond het weefsel weggesneden om een blokvorm te maken.
Vervolgens wordt het aros geëncrypteerde hart gedurende een vijfstappenserie gedehydrateerd door eerst te weken in 20% ethanol, vervolgens in toenemende concentraties ethanol en ten slotte in pure ethanol. Deze dehydratatieprocedure helpt om asymmetrische krimp van het monster te voorkomen. De eerste vier baden in verdunde ethanol moeten een uur duren en het laatste bad in 100% ethanol moet ten minste 10 uur duren.
Zodra de ethanolbehandelingen zijn voltooid, plaatst u het monster in Murray's heldere oplossing totdat het monster helder wordt, wat varieert van enkele uren tot meerdere dagen. Deze oplossing om het helder te maken bootst het cellulaire water na en past de celmembranen aan, waardoor het weefsel transparant wordt. Ethanol
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie introduceert een Born genormaliseerde aanpak voor Optical Projection Tomography (BnOPT) die de nauwkeurigheid van fluorescentie tomografische reconstructies verbetert door rekening te houden met de absorptie-eigenschappen van monsters. De methode wordt toegepast om de verdeling van fluorescentie moleculaire sondes in kleine dierlijke organen te reconstrueren.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Optische beeldvorming
- Fluorescentie tomografie
- Biomedische beeldvorming
Achtergrond
- Optische Projection Tomography is een techniek die wordt gebruikt voor het beeldvormen van biologische monsters.
- Traditionele methoden houden mogelijk geen rekening met absorptie-eigenschappen, wat tot onnauwkeurigheden kan leiden.
- Fluorescentie moleculaire sondes zijn essentieel voor het visualiseren van biologische processen.
- Het verbeteren van reconstructiemethoden kan het begrip van orgaanfuncties verbeteren.
Doel van studie
- Om een methode te ontwikkelen die fluorescentieverdelingen nauwkeurig reconstrueert.
- Om rekening te houden met de absorptiekenmerken van biologische monsters.
- Om de betrouwbaarheid van het beeldvormen van kleine dierlijke organen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Monsters worden gefixeerd en ingebed in een cilinder van auger.
- Monsters worden geroteerd en verlicht met een excitatiegolflengte.
- Fluorescente signalen worden gemeten in transilluminatiemodus.
- De genormaliseerde Born-verhouding wordt berekend om de reconstructie te ondersteunen.
Belangrijkste resultaten
- De voorgestelde BnOPT-methode biedt nauwkeurige fluorescentie reconstructies.
- Het houdt effectief rekening met de absorptie-eigenschappen van monsters.
- De methode visualiseert met succes de verdeling van sondes in kleine dierlijke organen.
- Resultaten tonen verbeterde beeldkwaliteit in vergelijking met traditionele methoden.
Conclusies
- De BnOPT-aanpak verbetert de nauwkeurigheid van fluorescentie tomografie.
- Het biedt een betrouwbare methode voor het bestuderen van biologische monsters in vivo.
- Deze techniek kan onderzoek in biomedische beeldvorming en orgaanfunctieanalyse bevorderen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Accurate fluorescence quantification in whole-organ imaging is critical for target validation and mechanistic de-risking in early drug discovery. The Born normalized Optical Projection Tomography (BnOPT) method addresses absorption-induced artifacts that compromise fluorescence signal interpretation, thereby improving predictive confidence in probe distribution analysis. This capability supports reliable assessment of therapeutic target engagement and pathway modulation in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by providing artifact-free fluorescence distributions of molecular probes in intact organs.
- Operational Value: Supports functional target validation through quantitative imaging of probe activity in pathophysiological contexts such as infarction models.
- Predictive Value: Enhances confidence in target modulation readouts by correcting for spatially varying absorption that otherwise distorts quantification.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares cleared, stable biological samples suitable for longitudinal imaging studies requiring reproducible fluorescence readouts.
- Operational Value: Standardizes sample preparation via ethanol dehydration and Murray’s clearing, minimizing asymmetric shrinkage and signal variability.
- Assay Readiness: Generates quantitative absorption and fluorescence datasets enabling normalized ratio calculations essential for reliable signal interpretation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Facilitates progression from discovery to preclinical validation by maintaining fluorescence signal integrity during extended clearing and imaging sessions.
- Mechanistic De-risking: Reduces false conclusions about probe distribution by accounting for absorption effects that mimic or mask true biological signals.
- Disease Model Fidelity: Applied to infarcted mouse hearts to visualize protease activity probes, supporting target-specific mechanism evaluation in relevant pathophysiology.
Pipeline & Workflow Integration
The BnOPT method integrates into early discovery workflows following target engagement screening, providing quantitative 3D fluorescence maps that inform lead optimization and preclinical candidate selection.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling longitudinal tracking of fluorescent probe distribution in intact organs without signal degradation from absorption artifacts.
- Screening: Delivers assay-ready, cleared tissue samples with standardized preparation protocols ensuring reproducibility across experimental batches.
- Analytics: Outputs normalized born ratios (fluorescence/absorption) that isolate true fluorescence signals from absorption confounders, enabling accurate inter-group comparisons.
- Translational Research: Connects to preclinical studies by preserving fluorescence signal in cleared samples over time, allowing correlation of probe activity with functional outcomes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for whole-organ fluorescence quantification applicable across multiple therapeutic areas and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves predictive confidence in target validation by eliminating absorption-mediated quantification errors in fluorescence tomography.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized clearing (Murray’s solution) and dehydration protocols that minimize sample variability.
- Strategic Value: Enhances go/no-go decision reliability by providing accurate spatial readouts of molecular probe activity in disease-relevant organs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted target prioritization by reducing false-positive or false-negative conclusions from uncorrected imaging data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical imaging, sample clearing, and fluorescence quantification to avoid artifacts from residual ethanol or incomplete clearing.
- Dependent on telecentric optical systems, rotation stages with 0.05° accuracy, and synchronized excitation/emission filtering for signal fidelity.
- Necessitates cross-team standardization of clearing duration and ethanol gradients to ensure consistent refractive index matching and fluorescence preservation.
- Adaptation to diverse organ sizes and densities may require adjustments in clearing time and illumination intensity to prevent signal loss or bleaching.
- Practical limitation: prolonged clearing beyond optimal duration risks fluorescence degradation, necessitating timed clearing cycles as described in the protocol.
