Een Multi-compartimenten CNS Neuron-glia Co-cultuur Microfluïdische Platform

De fabricage van het microfluïdische apparaat voor neuronen-cocultuur met meerdere compartimenten begint met het definiëren van reservoirs op het PMMA-blok met een freesmachine, gevolgd door hot embossing van microkanaalarrays die de compartimenten met elkaar verbinden. Zodra de PMMA-mal is voorbereid, wordt de PDMS-malmaster gereproduceerd vanaf de PMMA-mal en gecoat met trichlooretheen. Het uiteindelijke apparaat wordt gereproduceerd vanaf de PDMS-malmaster en geassembleerd op een met PDL gecoate kweekplaat.

Primaire ratneuronen van E 16 tot 18 worden vervolgens in het soma-compartiment geladen en gedurende twee weken gekweekt voordat P 1 tot 2 rat-oligodendrocyten bovenop de axonale lagen in het axon ggl-compartiment worden toegevoegd voor co-cultuur. Hallo, ik ben J Par van het Nano Bio Systems Laboratory in de afdeling Electrical and Computer Engineering aan de Texas A&M University. Vandaag tonen we u een procedure voor het vervaardigen van een multi-compartiment microfluïdisch platform voor neuronaal co-cultuur.

We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de interactie tussen neuronen en glia van het centraal zenuwstelsel in vitro te bestuderen. Laten we beginnen. Om deze procedure te starten, gebruikt u een micromolente om compartimenten met een diepte van 3,5 millimeter te maken.

Definieer in het A-P-M-M-A blok één soma-compartiment en zes axon ggl-compartimenten. Nadat de compartimenten zijn voorbereid, dient men 10 minuten lang met isopropanol te sonceren om resten te verwijderen. Maak micro-ribstructuren op de glasplaat met behulp van conventionele fotolithografie en een nat-etsingsproces; breng de micro-ribpatronen vervolgens via hot embossing over van het glas op de PMMA-master. Schuif de plaat eerst op de PMMA-master en richt de PMMA-vormmaster en het glassubstraat handmatig uit.

Verhoog vervolgens de temperatuur naar 115 °C op een warmpers. Zodra deze temperatuur is bereikt, wordt er gedurende vijf minuten een gewicht van 0,5 ton aangebracht. Laat het geheel na vijf minuten afkoelen tot 40 °C en laat de druk los.

Begin nu met het voorbereiden van de PDMS-master. Meng het PDMS-prepolymeer met het uithardingsmiddel in een gewichtsverhouding van 10 op 1 en snijd de PMMA-master in blokken van 50 millimeter bij 50 millimeter. Plaats deze met behulp van een bowszaag in een bekerglas en giet het PDMS-mengsel over de PMMA-master; plaats het bekerglas gedurende 15 minuten in een vacuümexsikator die is aangesloten op een vacuümpomp en DGAs.

Om luchtbellen te verwijderen die tijdens het mengproces van PDMS zijn ontstaan. Zodra alle bellen zijn verwijderd, wordt de houder gedurende één uur in een waterpas gestelde oven van 85 graden Celsius geplaatst voor polymerisatie. Nu het PDMS volledig is uitgehard, wordt de PDMS-master van de PMMA-master gepeld. De PDMS-master wordt vervolgens behandeld met een dampcoating door deze in een exsiccator te plaatsen met twee tot drie druppels trichloorethyleen en gedurende 15 minuten vacuüm aan te leggen.

Het coaten van de PDMS-master vergemakkelijkt het losmaken van het uiteindelijke PDMS-apparaat voor neuronale co-cultuur van de PDMS-mastermal. Na het coaten wordt de PDMS-master kort gespoeld met isopropylalcohol om overtollig trichloorethyleen te verwijderen en gedroogd met stikstofgas. De fabricage van het neuronale co-cultuurapparaat uit het PDMS-polymeer is vergelijkbaar met het voorbereiden van de PDMS-mastermal zoals beschreven in de vorige sectie. Begin met het mengen van het PDMS-prepolymeer met het hardeningsmiddel in een gewichtsverhouding van 10 op 1; giet vervolgens het PDMS-mengsel bovenop de PDMS-master. Het is belangrijk om niet te veel PDMS te gieten, zodat de 3,5 millimeter hoge PDMS-structuur op de master niet volledig wordt ondergedompeld.

Plaats de DGA's in een exsiccator die 15 minuten is aangesloten op een vacuümpomp. Wanneer alle luchtbellen zijn verwijderd, plaatst u het PDMS gedurende één uur in een waterpas gestelde oven op 85 °C voor polymerisatie. Haal het PDMS na één uur uit de oven en laat het afkoelen op kamertemperatuur. Pel vervolgens voorzichtig de PDMS-neuroncultuurapparaten van de PDMS-master af.

Wikkel de PDMS-apparaten in parafilm om ze te beschermen tegen stof of vuil. Sluit af door de in parafilm gewikkelde PDMS met een boormachine uitgerust met een mes in afzonderlijke stukjes te snijden; de PDMS-apparaten voor neuronen-cocultuur zijn nu bijna klaar voor gebruik in celkweekplaten. Voordat het PDMS-apparaat voor neuronen-cocultuur in een celkweekplaat wordt geplaatst, wordt het apparaat in de plasmareiniger geplaatst en 90 seconden aan luchtplasma blootgesteld om het oppervlak hydrofiel te maken.

Deze behandeling vergemakkelijkt het vullen van de microkanalen met kweekmedium na assemblage op met poly-D-lysine gecoate platen. Om het plasmabehandelde apparaat te steriliseren, wordt het gedurende 30 minuten ondergedompeld in 70% ethanol en wordt de container naar de steriele bio-hood verplaatst. Haal het apparaat na 30 minuten eruit en droog het met stikstofgas dat is gefilterd met een 0,2 micron milliporefilter.

Plaats vervolgens de gedroogde apparaten op een met poly-D-lysine gecoate polystyreen zes-well kweekplaat en oefen lichte druk uit om een nauwe afsluiting tussen het oppervlak van de kweekplaat en het ijs van het apparaat te garanderen. Vul nu het soma-compartiment met kweekmedium. Wacht een minuut of twee om er zeker van te zijn dat er geen luchtbellen in de microkanalen zijn ingesloten.

Vul vervolgens de zes axon-gliacompartimenten. Incubeer tot slot de apparaten, gevuld met kweekmedium, gedurende de nacht in een incubator op 37 °C om eventuele resten of toxische residuen te verwijderen. Na de incubatie gedurende de nacht kan de kweek worden gestart ter voorbereiding op het laden van cellen in het apparaat.

Gebruik een pipet om het cultuurmedium uit de soma- en axoncompartimenten af te zuigen. Breng vervolgens 40 µL primaire voorhersencellen van ratten uit embryonale dag 16 tot 18 aan in het somacompartiment rond de openingen van het microkanaal, met een areale dichtheid van 500 cellen per vierkante millimeter. Het is belangrijk om het PDMS-apparaat niet aan te raken tijdens het laden van de cellen, omdat dit de afdichting tussen het apparaat en de celcultuurplaat kan verbreken.

Deze microscopische beelden tonen neuronale cellen die zijn gekleurd voor calcium. Binnen het soma-compartiment zijn de cellen uniform geladen en bevinden ze zich dicht bij de microfluïdische kanalen. Incubeer de met cellen geladen apparaten gedurende 30 minuten in een incubator op 37 °C om de adhesie van de cellen aan het substraat te verbeteren.

Vul na deze incubatie alle compartimenten aan met kweekmedium. Houd de cellen in het apparaat in groei bij 37 °C in een bevochtigde 5%CO2-incubator en vervang elke drie of vier dagen slechts de helft van het kweekmedium. Er moet een dicht axonaal netwerk zijn gevormd binnen de Axon glia-compartimenten.

Na twee weken kweek, na 14 dagen cultivering, worden de primaire neuronen in vitro CLIA-cellen toegevoegd; vóór het laden van de cellen wordt ongeveer 60% van het kweekmedium uit de compartimenten geaspireerd. Oligodendrocyten werden gedissekeerd uit de cerebrale hemisferen van Sprague-Dawley-ratten op postnatale dag één tot twee. Voeg vijf microliters oligodendrocyten toe aan elk axon-glia-compartiment met een areale dichtheid van 1000 cellen per vierkante millimeter. Er moet nauwkeurig worden gewerkt om tijdens het laden de bodemsubstraat niet met de pipet aan te raken, aangezien dit het axonale netwerk dat op het substraat is gevormd kan beschadigen. Incubeer de cellen na toevoeging van de oligodendrocyten gedurende één uur bij 37 °C en vul vervolgens de compartimenten aan.

Ga verder met het kweken van de neuronen in kweekmedium zoals voor de toevoeging van de CLIA; vervang alleen elke drie of vier dagen de helft van het kweekmedium gedurende nog twee weken tijdens het bestuderen van de interactie tussen axonen en glia in het centrale zenuwstelsel van zoogdieren, mits de experimenten correct worden uitgevoerd. Neuronale cellen die in het soma-compartiment zijn geladen, bevinden zich dicht bij de ingangen van de microkanalen en een axonale laag begint zich te vormen in de axon-Ggl-compartimenten.

Na één week kweek kunnen tekenen van neuronale celaggregatie in het soma-compartiment een indicatie zijn dat de cellen niet gezond zijn bij het laden van oligodendrocyten. Na twee weken neuronale kweek moeten de axon-ggl-compartimenten bedekt zijn met een dichte laag axonen, en moeten de oligodendrocyten bovenop deze axonale laag worden geladen. We hebben u zojuist laten zien hoe u een multicompartimentaal neuroco-kweekplatform fabriceert en hoe u dit gebruikt om de interactie tussen neuroglia in het centrale zenuwstelsel in vitro te bestuderen.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de apparatuur stofvrij moet blijven en niet te lang in ethanol mag worden gesteriliseerd, omdat dit de hechting kan verslechteren. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.