Name: Een Multi-compartimenten CNS Neuron-glia Co-cultuur Microfluïdische Platform (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-10T16:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 24 s
Description: Leer een multi-compartiment microfluïdische co-cultuurmethode voor het bestuderen van axon-glia-interacties in het centrale zenuwstelsel met behulp van primaire rattenneuronen en oligodendrocyten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health / National Institute of Mental Health (NIH / NIMH) te verlenen # 1R21MH085267.

Deel 1: Het voorbereiden van een meester mal voor meerdere compartimenten neuron co-cultuur apparaat fabricage <ol><li> Eerste stap om de PMMA meester fabriceren is om 3,5 mm diep compartimenten. Een soma compartiment en zes axon / glia compartimenten zijn gedefinieerd op een PMMA blok met behulp van een micro-freesmachine (MDX-40, Roland of enige andere CNC freesmachine). PMMA meester is dan gesoniceerd in isopropylalcohol gedurende 10 minuten om vuil te verwijderen. </li><li> Arrays van 2,5 micrometer hoge bergrug structuren zijn patroon op een 50,8 mm x 50,8 mm glas dia door een standaard-fotolithografie proces, gevolgd door een nat etsen van het glas. Eerst worden array van ridge structuren patroon op een gereinigde glazen substraat met een positieve fotolak S1818 met behulp van fotolithografie. S1818 is spin-coating op het substraat (4000 rpm), zachte gebaseerd op 110 ° C gedurende 5 min, en vervolgens blootgesteld aan UV-licht (84 mJ / cm 2) met behulp van een masker aligner, gevolgd door de ontwikkeling van de fotoresist in MF319 voor 40 seconden. Vervolgens wordt de fotoresist figuurglas substraat is ingebed in een gebufferde oxide etsen (BOE) bij kamertemperatuur voor 6-7 minuten tot een 2.5 micrometer grote bergkam structuren te verkrijgen. Ten slotte wordt de fotolak laag verwijderd door aceton en isopropylalcohol, gevolgd door grondig spoelen in gedeïoniseerd (DI) water. </li><li> Glazen substraat met micro-ridge structuren is hot-reliëf tegen de PMMA meester zijn patronen te dragen. Eerst worden PMMA schimmel meester en glazen substraten handmatig op elkaar afgestemd en geplaatst op een hot-pers. Vervolgens wordt de temperatuur verhoogd tot 115 ° C. Zodra de gewenste temperatuur is bereikt, 0,5 ton gewicht wordt toegepast gedurende 5 minuten. Na 5 minuten wordt de temperatuur afgekoeld tot 40 ° C en de druk wordt vrijgegeven. De PMMA master is dan gesneden in een 50,8 mm x 50,8 mm groot blok. </li><li> PDMS pre-polymeer (Sylgard 184) wordt gemengd met verharder in de verhouding van 10: 1 door het gewicht. </li><li> PMMA master is geplaatst in een vat en PDMS mengsel wordt uitgegoten op de top van de PMMA meester om een ​​PDMS meester fabriceren. Het wordt dan geplaatst in een exsiccator is aangesloten op een vacuümpomp. PDMS goot op de top van PMMA master is vervolgens ontgast gedurende 15 minuten om belletjes die tijdens het PDMS mengproces te verwijderen. </li><li> Als alle bubbels worden verwijderd, is het PDMS gezet in een waterpas 85 ° C oven gedurende een uur voor de polymerisatie. </li><li> Zodra PDMS is volledig uitgehard, is PDMS meester afgepeld van de PMMA master en geplaatst in een exsiccator met 2-3 druppels trichloorsilaan en gestofzuigd gedurende 15 minuten aan damp de vacht van de PDMS meester oppervlak. Trichloorsilaan coating vergemakkelijkt de release van de uiteindelijke PDMS neuron co-cultuur apparaten van de PDMS meester. Na het coaten, is het PDMS meester kort gespoeld met isopropyl alcohol aan overmatige trichloorsilaan te verwijderen, en gedroogd met N 2 gas. </li></ol> Deel 2: Neuron cultuur-apparaat replicatie <ol><li> PDMS pre-polymeer (Sylgard 184) wordt gemengd met verharder in de verhouding van 10: 1 door het gewicht. </li><li> PDMS mengsel wordt uitgegoten op de top van de PDMS meester en ontgast in een exsiccator is aangesloten op een vacuümpomp voor 15 minuten. Het is belangrijk niet te gieten teveel PDMS dat de 3,5 mm hoog PDMS-structuur op de master niet volledig is ondergedompeld. </li><li> Als alle bubbels worden verwijderd, is het PDMS gezet in een waterpas 85 ° C oven gedurende een uur voor de polymerisatie. </li><li> PDMS wordt genomen uit de oven na een uur en bij kamertemperatuur afkoelen. Vervolgens worden PDMS neuron cultuur apparaten voorzichtig afgepeld van de PDMS meester. Afgepeld PDMS-apparaten zijn omwikkeld met parafilm om hen te beschermen tegen stof of vuil. </li><li> PDMS-apparaten, omwikkeld met parafilm, worden gesneden in individuele stukken met behulp van een boor pers uitgerust met een mes. </li></ol> Deel 3: Apparaat assemblage <ol><li> PDMS neuron cultuur apparaat is geplaatst in het plasma schoner en blootgesteld aan de lucht plasma gedurende 90 seconden om het oppervlak van het PDMS apparaat hydrofiel. Dit plasma behandeling zullen vergemakkelijken microkanalen te vullen met cultuur media na de montage aan poly-D-lysine gecoate substraat. </li><li> Apparaten die behandeld worden met plasma worden dan ondergedompeld in 70% ethanol gedurende 30 minuten voor sterilisatie en verhuisde in de gesteriliseerde bio-kap. </li><li> Gesteriliseerd apparaten zijn genomen uit 70% ethanol en gedroogd met Millipore gefilterd N 2 gas. Gedroogde apparaten zijn geplaatst op de top van poly-D-lysine gecoate polystyreen 6-well plaat en cultuur zachte druk wordt toegepast op de afdichting tussen het substraat en het apparaat te verzekeren. </li><li> Kweekmedia wordt dan gevuld in de soma compartiment, gevolgd door het vullen van de zes axon / glia compartimenten. Het is beter te geven 1-2 minuten pauze voor het vullen van axon / glia vakken na het toevoegen van cultuur media om de soma compartiment om ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen worden opgesloten in de microkanalen. </li><li> Apparaten gevuld met cultuur media wordt geïncubeerd in een 37 ° C incubator &#39;s nachts om eventuele vuil of giftige residu te spoelen. </li></ol> Deel 4: Cel laden en neuron-oligodendrocyt co-cultuur <ol><li> Op de eerste dag van de celkweek, primaire voorhersenen neuron cellen van embryonale dag 16-18 ratten zijn geladen in het soma compartiment op een oppervlaktedichtheid van 500 cellen / mm 2. Ten eerste, zijn cultuur media in zowel de soma compartiment en axon / gliacellen compartimenten opgezogen met behulp van een pipet voorafgaand aan de cel laden. Dan worden 38.500 cellen, verdund in 40 ul van cultuur media, geladen op de soma compartiment rond de microkanaal inhammen. Het is belangrijk dat u de PDMS-toestel aanraken tijdens het laden van de cellen, omdat het kan breken de afdichting tussen het apparaat en de ondergrond. </li><li> Incubeer de cel geladen apparaten voor 30 minuten in een 37 ° C incubator naar cel adhesie te verbeteren aan de ondergrond. Na incubatie worden alle compartimenten gevuld met cultuur media. </li><li> Cellen worden gekweekt bij 37 ° C in een bevochtigde 5% CO 2 incubator en slechts de helft van de cultuur media is veranderd op om de 3-4 dagen. </li><li> Na 14 dagen van neuron cultuur in vitro, zijn oligodendrocytes toegevoegd aan het axon / glia compartimenten voor co-cultuur. Oligodendrocyten, ontleed van de hersenhelften van Sprague-Dawley ratten bij postnatale dag 1-2, worden toegevoegd aan elk axon / glia compartiment op een oppervlakte dichtheid van 1000 cellen / mm 2. Voorafgaand aan het laden van cellen, zijn ongeveer 60% van de cultuur media in de vakken afgezogen met een pipet. Voorzichtigheid moet worden gemaakt niet tot op de bodem substraat te raken, want het kan het axonale netwerk gevormd op de ondergrond beschadigen. Vervolgens worden 6700 oligodendrocyt cellen, verdund in 5 ul van cultuur media, toegevoegd aan de axon / glia compartimenten. Cellen worden geïncubeerd gedurende 1 uur en compartimenten zijn gevuld met cultuur media. </li><li> Cellen worden gekweekt bij 37 ° C in een bevochtigde 5% CO 2 incubator en slechts de helft van de cultuur media is veranderd op om de 3-4 dagen voor twee weken. </li></ol> Deel 5: representatieve resultaten: Bij de experimenten correct worden uitgevoerd, neuron cellen geladen naar de soma compartiment vinden dicht bij microchannel inhammen en axonale laag beginnen te vormen binnen het axon / glia compartimenten na 1 week van de cultuur. Teken van neuron cel aggregatie in het soma compartiment kan een indicatie dat cellen niet gezond bent. Bij het laden van oligodendrocyten na twee weken van neuron cultuur, axon / glia compartimenten moeten worden gedekt met een dichte laag van de axonen en oligodendrocyten moeten worden geladen op de top van de axonale laag. <img src="/files/ftp_upload/1399/1399fig1tmb.jpg" border="0" alt="figuur 1" /> Figuur 1. Schematische afbeeldingen van de high-throughput microfluïdische meerdere compartimenten CNS neuron co-cultuur platform. Dwarsdoorsnede toont de isolatie van axonen van neuronale soma en dendrieten en vloeibare isolatie tussen de compartimenten met een minuut fluidisch niveau verschil. Gelieve <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1399/1399fig1.jpg">Klik hier</a> voor een grotere versie van figuur 1 te zien. <img src="/files/ftp_upload/1399/1399fig2tmb.jpg" border="0" alt="figuur 2" /> Figuur 2. Fabricage en assemblage stappen voor de meerdere compartimenten PDMS microfluïdische co-cultuur-apparaat. Elk apparaat past in een goed van een conventionele 6-well polystyreen celkweek plaat. Gelieve <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1399/1399fig2.jpg">Klik hier</a> voor een grotere versie van figuur 2 te zien.

<ol><li>Sherman, D. L., Brophy, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+axon+ensheathment+and+myelin+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth.</a> Nature Reviews. 6, 683-690 (2005).</li>
<li>Xia, Y., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem%22%5BJournal%5D)">Soft Lithography.</a> Angew. Chem. 37, 550-575 (1998).</li>
<li>Taylor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nature Methods. 2, 599-605 (2005).</li>
<li>Li, J., Baud, O., Vartanian, T., Volpe, J. J., Rosenberg, P. A., A, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxynitrite+generated+by+inducible+nitric+oxide+synthase+and+NADPH+oxidase+mediates+microglial+toxicity+to+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Peroxynitrite generated by inducible nitric oxide synthase and NADPH oxidase mediates microglial toxicity to oligodendrocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 102, 9936-9941 (2005).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te melden.

We hebben een multi-compartimenten co-cultuur platform voor het bestuderen van zoogdieren CNS axon-glia interactie. CNS axonen werden met succes geïsoleerd van neuronale cellichamen / dendrieten, en oligodendrocyten werden met succes samen gekweekt in het apparaat. Neuron dichtheid kan worden gevarieerd door toepassingen, maar te laag of te hoge concentratie kan leiden tot afsterven. Ook is het belangrijk om te veranderen maar de helft van de cultuur media, zodat de cellen of axonale laag op het substraat niet worden be...

een multi-compartimenten cns neuron-glia co-cultuur microfluïdische platform

A Multi-compartment CNS Neuron-glia Co-culture Microfluidic Platform

We presenteren een nieuw meerdere compartimenten neuron co-cultuur microsysteem platform voor in-vitro CNS axon-glia interactie tussen onderzoek, in staat is het uitvoeren van maximaal zes onafhankelijke experimenten in parallel voor een hogere throughput. Ontwikkelden we een nieuwe fabricage methode om microfluïdische apparaten met zowel micro-en macro-schaal structuren binnen het hetzelfde apparaat via een soft-lithografie-proces te creëren, waardoor de massa productie met een goede herhaalbaarheid. De multi-compartimenten microfluïdische co-cultuur platform is samengesteld uit een soma compartiment voor neuronen en zes axon / glia vakken voor oligodendrocyten (OLS). De soma compartiment en axon / gliacellen compartimenten zijn met elkaar verbonden door arrays van axon-guiding microkanalen die functioneren als fysieke barrières voor neuronale soma beperken in de soma compartiment, terwijl axonen uit te groeien tot axon / glia compartimenten. OLS geladen in axon / glia compartimenten kunnen alleen communiceren met axonen, maar niet met neuronale soma of dendrieten, waardoor gelokaliseerde axon-glia interactiestudies. De microkanalen het ook mogelijk vloeibare isolatie tussen compartimenten, waardoor zes onafhankelijke experimenten worden uitgevoerd op een enkel apparaat voor een hogere doorvoersnelheid. Soft-lithografie met behulp van poly (dimethylsiloxaan) (PDMS) is een veel gebruikte techniek in de biomedische Microdevices. Reservoirs op deze apparaten worden vaak bepaald door handmatig perforeren. Hoewel eenvoudige, slechte afstemming en tijdrovend karakter van het proces maakt dit proces niet geschikt wanneer grote aantallen reservoirs moeten herhaaldelijk worden gecreëerd. De nieuw ontwikkelde methode niet vereisen handmatige perforeren van de reservoirs, het overwinnen van dergelijke beperkingen. Eerste zeven reservoirs (diepte: 3,5 mm) werden gemaakt op een poly (methyl methacrylaat) (PMMA) blokkeren met behulp van een micro-freesmachine. Dan, arrays van nok microstructuren, gefabriceerd op een glazen substraat, waren hot-reliëf tegen de PMMA blok aan microkanalen dat de soma en axon / gliacellen compartimenten verbinden definiëren. Dit proces heeft geleid tot de macro-schaal reservoirs (3,5 mm) en micro-schaal kanalen (2,5 micrometer) te laten samenvallen in een enkele PMMA meester. Een PDMS replica die diende als een mal meester werd verkregen met behulp van soft-lithografie en het uiteindelijke PDMS apparaat werd gerepliceerd van deze meester. Primaire neuronen van de E16-18 ratten werden geladen om de soma compartiment en gekweekt voor twee weken. Na een week van celkweek, axonen gekruist microkanalen en vormde axonale alleen netwerklaag binnen axon / glia compartimenten. Axonen groeide gelijkmatig in zes axon / glia compartimenten en OLS van P1-2 ratten werden toegevoegd aan axon / glia compartimenten op 14 dagen in vitro voor co-cultuur.

We ontwikkelden een nieuw meerdere compartimenten neuron co-cultuur microsysteem platform voor in-vitro CNS axon-glia interactie onderzoek. Het platform is in staat het uitvoeren van maximaal zes onafhankelijke experimenten in parallel en werd vervaardigd met behulp van een nieuw ontwikkelde macro / micro hybrid fabricage methode.

Een Multi-compartimenten CNS Neuron-glia Co-cultuur Microfluïdische Platform

Wij presenteren een nieuw multi-compartimentaal neuron-cocultuur-microsysteemplatform voor in vitro onderzoek naar axon-glia-interacties in het centrale zenuwstelsel (CZS), dat in staat is om tot ... uit te voeren.

De fabricage van het microfluïdische apparaat voor neuronen-cocultuur met meerdere compartimenten begint met het definiëren van reservoirs op het PMMA-blok met een freesmachine, gevolgd door hot embossing van microkanaalarrays die de compartimenten met elkaar verbinden. Zodra de PMMA-mal is voorbereid, wordt de PDMS-malmaster gereproduceerd vanaf de PMMA-mal en gecoat met trichlooretheen. Het uiteindelijke apparaat wordt gereproduceerd vanaf de PDMS-malmaster en geassembleerd op een met PDL gecoate kweekplaat.Primaire ratneuronen van E 16 tot 18 worden vervolgens in het soma-compartiment geladen en gedurende twee weken gekweekt voordat P 1 tot 2 rat-oligodendrocyten bovenop de axonale lagen in het axon ggl-compartiment worden toegevoegd voor co-cultuur. Hallo, ik ben J Par van het Nano Bio Systems Laboratory in de afdeling Electrical and Computer Engineering aan de Texas A&amp;M University. Vandaag tonen we u een procedure voor het vervaardigen van een multi-compartiment microfluïdisch platform voor neuronaal co-cultuur.We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de interactie tussen neuronen en glia van het centraal zenuwstelsel in vitro te bestuderen. Laten we beginnen. Om deze procedure te starten, gebruikt u een micromolente om compartimenten met een diepte van 3,5 millimeter te maken.Definieer in het A-P-M-M-A blok één soma-compartiment en zes axon ggl-compartimenten. Nadat de compartimenten zijn voorbereid, dient men 10 minuten lang met isopropanol te sonceren om resten te verwijderen. Maak micro-ribstructuren op de glasplaat met behulp van conventionele fotolithografie en een nat-etsingsproces; breng de micro-ribpatronen vervolgens via hot embossing over van het glas op de PMMA-master. Schuif de plaat eerst op de PMMA-master en richt de PMMA-vormmaster en het glassubstraat handmatig uit.Verhoog vervolgens de temperatuur naar 115 °C op een warmpers. Zodra deze temperatuur is bereikt, wordt er gedurende vijf minuten een gewicht van 0,5 ton aangebracht. Laat het geheel na vijf minuten afkoelen tot 40 °C en laat de druk los.Begin nu met het voorbereiden van de PDMS-master. Meng het PDMS-prepolymeer met het uithardingsmiddel in een gewichtsverhouding van 10 op 1 en snijd de PMMA-master in blokken van 50 millimeter bij 50 millimeter. Plaats deze met behulp van een bowszaag in een bekerglas en giet het PDMS-mengsel over de PMMA-master; plaats het bekerglas gedurende 15 minuten in een vacuümexsikator die is aangesloten op een vacuümpomp en DGAs.Om luchtbellen te verwijderen die tijdens het mengproces van PDMS zijn ontstaan. Zodra alle bellen zijn verwijderd, wordt de houder gedurende één uur in een waterpas gestelde oven van 85 graden Celsius geplaatst voor polymerisatie. Nu het PDMS volledig is uitgehard, wordt de PDMS-master van de PMMA-master gepeld. De PDMS-master wordt vervolgens behandeld met een dampcoating door deze in een exsiccator te plaatsen met twee tot drie druppels trichloorethyleen en gedurende 15 minuten vacuüm aan te leggen.Het coaten van de PDMS-master vergemakkelijkt het losmaken van het uiteindelijke PDMS-apparaat voor neuronale co-cultuur van de PDMS-mastermal. Na het coaten wordt de PDMS-master kort gespoeld met isopropylalcohol om overtollig trichloorethyleen te verwijderen en gedroogd met stikstofgas. De fabricage van het neuronale co-cultuurapparaat uit het PDMS-polymeer is vergelijkbaar met het voorbereiden van de PDMS-mastermal zoals beschreven in de vorige sectie. Begin met het mengen van het PDMS-prepolymeer met het hardeningsmiddel in een gewichtsverhouding van 10 op 1; giet vervolgens het PDMS-mengsel bovenop de PDMS-master. Het is belangrijk om niet te veel PDMS te gieten, zodat de 3,5 millimeter hoge PDMS-structuur op de master niet volledig wordt ondergedompeld.Plaats de DGA's in een exsiccator die 15 minuten is aangesloten op een vacuümpomp. Wanneer alle luchtbellen zijn verwijderd, plaatst u het PDMS gedurende één uur in een waterpas gestelde oven op 85 °C voor polymerisatie. Haal het PDMS na één uur uit de oven en laat het afkoelen op kamertemperatuur. Pel vervolgens voorzichtig de PDMS-neuroncultuurapparaten van de PDMS-master af.Wikkel de PDMS-apparaten in parafilm om ze te beschermen tegen stof of vuil. Sluit af door de in parafilm gewikkelde PDMS met een boormachine uitgerust met een mes in afzonderlijke stukjes te snijden; de PDMS-apparaten voor neuronen-cocultuur zijn nu bijna klaar voor gebruik in celkweekplaten. Voordat het PDMS-apparaat voor neuronen-cocultuur in een celkweekplaat wordt geplaatst, wordt het apparaat in de plasmareiniger geplaatst en 90 seconden aan luchtplasma blootgesteld om het oppervlak hydrofiel te maken.Deze behandeling vergemakkelijkt het vullen van de microkanalen met kweekmedium na assemblage op met poly-D-lysine gecoate platen. Om het plasmabehandelde apparaat te steriliseren, wordt het gedurende 30 minuten ondergedompeld in 70% ethanol en wordt de container naar de steriele bio-hood verplaatst. Haal het apparaat na 30 minuten eruit en droog het met stikstofgas dat is gefilterd met een 0,2 micron milliporefilter.Plaats vervolgens de gedroogde apparaten op een met poly-D-lysine gecoate polystyreen zes-well kweekplaat en oefen lichte druk uit om een nauwe afsluiting tussen het oppervlak van de kweekplaat en het ijs van het apparaat te garanderen. Vul nu het soma-compartiment met kweekmedium. Wacht een minuut of twee om er zeker van te zijn dat er geen luchtbellen in de microkanalen zijn ingesloten.Vul vervolgens de zes axon-gliacompartimenten. Incubeer tot slot de apparaten, gevuld met kweekmedium, gedurende de nacht in een incubator op 37 °C om eventuele resten of toxische residuen te verwijderen. Na de incubatie gedurende de nacht kan de kweek worden gestart ter voorbereiding op het laden van cellen in het apparaat.Gebruik een pipet om het cultuurmedium uit de soma- en axoncompartimenten af te zuigen. Breng vervolgens 40 µL primaire voorhersencellen van ratten uit embryonale dag 16 tot 18 aan in het somacompartiment rond de openingen van het microkanaal, met een areale dichtheid van 500 cellen per vierkante millimeter. Het is belangrijk om het PDMS-apparaat niet aan te raken tijdens het laden van de cellen, omdat dit de afdichting tussen het apparaat en de celcultuurplaat kan verbreken.Deze microscopische beelden tonen neuronale cellen die zijn gekleurd voor calcium. Binnen het soma-compartiment zijn de cellen uniform geladen en bevinden ze zich dicht bij de microfluïdische kanalen. Incubeer de met cellen geladen apparaten gedurende 30 minuten in een incubator op 37 °C om de adhesie van de cellen aan het substraat te verbeteren.Vul na deze incubatie alle compartimenten aan met kweekmedium. Houd de cellen in het apparaat in groei bij 37 °C in een bevochtigde 5%CO2-incubator en vervang elke drie of vier dagen slechts de helft van het kweekmedium. Er moet een dicht axonaal netwerk zijn gevormd binnen de Axon glia-compartimenten.Na twee weken kweek, na 14 dagen cultivering, worden de primaire neuronen in vitro CLIA-cellen toegevoegd; vóór het laden van de cellen wordt ongeveer 60% van het kweekmedium uit de compartimenten geaspireerd. Oligodendrocyten werden gedissekeerd uit de cerebrale hemisferen van Sprague-Dawley-ratten op postnatale dag één tot twee. Voeg vijf microliters oligodendrocyten toe aan elk axon-glia-compartiment met een areale dichtheid van 1000 cellen per vierkante millimeter. Er moet nauwkeurig worden gewerkt om tijdens het laden de bodemsubstraat niet met de pipet aan te raken, aangezien dit het axonale netwerk dat op het substraat is gevormd kan beschadigen. Incubeer de cellen na toevoeging van de oligodendrocyten gedurende één uur bij 37 °C en vul vervolgens de compartimenten aan.Ga verder met het kweken van de neuronen in kweekmedium zoals voor de toevoeging van de CLIA; vervang alleen elke drie of vier dagen de helft van het kweekmedium gedurende nog twee weken tijdens het bestuderen van de interactie tussen axonen en glia in het centrale zenuwstelsel van zoogdieren, mits de experimenten correct worden uitgevoerd. Neuronale cellen die in het soma-compartiment zijn geladen, bevinden zich dicht bij de ingangen van de microkanalen en een axonale laag begint zich te vormen in de axon-Ggl-compartimenten.Na één week kweek kunnen tekenen van neuronale celaggregatie in het soma-compartiment een indicatie zijn dat de cellen niet gezond zijn bij het laden van oligodendrocyten. Na twee weken neuronale kweek moeten de axon-ggl-compartimenten bedekt zijn met een dichte laag axonen, en moeten de oligodendrocyten bovenop deze axonale laag worden geladen. We hebben u zojuist laten zien hoe u een multicompartimentaal neuroco-kweekplatform fabriceert en hoe u dit gebruikt om de interactie tussen neuroglia in het centrale zenuwstelsel in vitro te bestuderen.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de apparatuur stofvrij moet blijven en niet te lang in ethanol mag worden gesteriliseerd, omdat dit de hechting kan verslechteren. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

a-multi-compartment-cns-neuron-glia-co-culture-microfluidic-platform

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In deze video laten we zien de techniek van zachte lithografie met polydimethylsiloxaan (PDMS), dat we gebruiken om een ​​microfluïdische apparaat voor het kweken van neuronen farbricate.

Fabricage van een microfluïdische apparaat voor de compartimentering van Neuron Soma en axonen

In deze video laten we zien de voorbereiding van de E18 Corticale Rat neuronen.

Voorbereiden E18 Corticale Rat Neuronen voor Compartimentering in een microfluïdische apparaat

BioMEMS: het aangaan van nieuwe samenwerkingen tussen biologen en ingenieurs

Deze studie beschrijft de procedures van het opzetten van een nieuwe neuronale axon en (astro) glia co-cultuur platform. In deze co-cultuur systeem, manipulatie van directe interactie tussen een axon (en single gliale cel) wordt het mogelijk, waardoor mechanistische analyse van de wederzijdse neuron naar gliale signalering.

Imaging Analyse van de Neuron tot Glia Interactie in Microfluïdische Cultuur Platform (MCP)-gebaseerde Neuronale Axon en Glia Co-cultuur systeem

This video demonstrates the utilization of a pre-assembled plastic microfluidic chip for the compartmentalized culture of primary rat hippocampal neurons. The neurons are plated into one of the microfluidic compartments, where they attach and grow, extending their axons through the chip's microgrooves into the adjacent compartment. The narrow microgrooves prevent neuronal cell bodies from entering, thereby enabling physical separation between the somatic and axonal compartments.

Compartmentalized Primary Murine Neuron Culture Using Plastic Microfluidic Chips

This video demonstrates the assessment of neuronal electrical activity in a co-culture of hiPSC-derived cortical glutamatergic neurons and glioma cells using a microfluidic device with multielectrode arrays.

Assessing Glutamatergic Neurons and Glioma Cells Interactions in a Co-Culture

Protocollen voor enkel neuron microfluïdische arraying en water maskeren voor de in-chip plasma patroonvorming van biomateriaal coatings worden beschreven. Sterk verbonden co-culturen kan worden bereid met minimale cel ingangen.

Voorbereiding van Neuronale Co-culturen met Single Cell Precision

Dit protocol beschrijft het gebruik van plastic fiches om cultuur en grendelen primaire lymfkliertest neuronen. Deze chips zijn voorgemonteerd, gebruiksvriendelijke en compatibel met hoge resolutie, levend, en fluorescentie beeldvorming. Dit protocol wordt beschreven hoe plaat rat hippocampal neuronen binnen deze chips en uitvoeren van fluidic isolatie, axotomy en immunokleuring.

Gebruik van vooraf geassembleerde kunststof Microfluidic Chips voor primaire lymfkliertest neuronen compartimentering

Dit protocol demonstreert het gebruik van gecompartimenteerde microfluïdische chips, injectie gegoten in een cyclisch olefine copolymeer aan gekweekte neuronen die worden onderscheiden van menselijke stamcellen. Deze chips zijn voorgeassembleerd en gemakkelijker te gebruiken dan traditionele gecompartimentaliseerde poly (dimethylsiloxaan) apparaten. Meerdere gemeenschappelijke experimentele paradigma's worden hier beschreven, met inbegrip van virale labeling, fluidic isolatie, axotomie, en...

Compartimenlise ring van menselijke stamcel-afgeleide neuronen in voorgemonteerde kunststof Microfluïdische chips

Dit protocol beschrijft een microglia-neuronale co-cultuur die is opgezet uit primaire neuronale cellen geïsoleerd uit muizenembryo's op embryonale dagen 15-16 en primaire microglia gegenereerd uit de hersenen van neonatale muizen op postnatale dagen 1-2.

Genereren en co-cultureren van primaire microglia en corticale neuronen van muizen

Dit protocol beschrijft een microfluïdisch systeem dat neuronale metabole dynamiek modelleert na axonale verwonding, waardoor beeldvorming, multi-omics-analyse en mechanistische studies van intrinsieke metabole remodellering mogelijk zijn.

Microfluïdische chip voor axonale letselmodellen, constructie en het mogelijk maken van multi-omics-analyse

Leer een multi-compartiment microfluïdische co-cultuurmethode voor het bestuderen van axon-glia-interacties in het centrale zenuwstelsel met behulp van primaire rattenneuronen en oligodendrocyten.

Een Multi-compartimenten CNS Neuron-glia Co-cultuur Microfluïdische Platform

Meer video's verkennen