Dissectie van de imaginaire Discs uit 3e Instar Drosophila Larven
February 17th, 2007
Dit protocol laat de dissectie techniek die wordt gebruikt voor het isoleren van verbeelding schijven van Drosophila larven in de 3e instar stadium. Methoden voor de vaststelling van het weefsel na het zeggen en het verwijderen van de vleugel, poot, en ogen schijven worden gedemonstreerd direct op een objectglaasje voor verdere visualisatie.
Vandaag ga ik je laten zien hoe je imaginaire schijven uit derde instar drosophila-larven dissecteert. Derde instar larvale schijven kunnen voor verschillende ontwikkelingsprocessen worden gebruikt. We bekijken ze in ons lab om het proces van apoptose te zien, maar je kunt er verschillende eiwitten in uitdrukken en ze op die manier bestuderen en allerlei ontwikkelingsprocessen zien gebeuren binnen de schijven in orde.
Om dat te doen, ga ik verschillende zeer belangrijke hulpmiddelen gebruiken. De eerste is de plukstok waarmee we de larven uit hun schalen zullen halen. Vervolgens is het belangrijkste de dissectietang, die extreem scherp moet zijn om de dissectie te laten doorgaan.
Vervolgens zullen we een chirurgisch mes gebruiken, nummer 11 chirurgisch mes om de schijven uit het hoofd te verwijderen. En dan zullen we de schijven op een dia plaatsen met wat vector shield als onze montage media. Dus het eerste wat we gaan doen is wat derde en sterren-rondtrekkende, derde en sterrenlarven verzamelen.
Ik gebruik hier gewoon mijn plukstok om ze een beetje los te prijzen van de zijkant van de fles. Soms helpt het als je stok een beetje nat is en zet ze dan in een druppel PBS. Oké, hier hebben we onze derde sterlarven.
Omdat ik rechtshandig ben, ga ik zijn hoofd naar mijn rechterkant draaien en we gaan een paar oriëntatiepunten gebruiken om ons te leiden over waar we hem moeten grijpen. Eerst is het hoofdgedeelte van de trachea hier en hier. En dan is er een kleine dwarsdoorsnede hier naar het hoofd.
Dus eerst ga ik de larve voorzichtig ongeveer twee derde van de weg naar beneden vanaf het hoofd grijpen. En dan ga ik met mijn rechterhand een paar millimeter achter het dwarsstuk hier grijpen, proberen ongeveer halverwege de breedte van de larve te komen. Dus dat is een goede greep.
Je kunt zien dat ik ongeveer halverwege ben. Dus dan zal ik voorzichtig met mijn rechterhand naar voren trekken, zie daar alle darmen uitkomen. Oké. Het hoofdgedeelte van het lichaam kan nu worden weggegooid.
En hier hebben we het hoofd, dat de imaginaire schijven omvat die aan de monddelen zijn bevestigd. Dus ik ga hem bij de monddelen grijpen, zodat ik geen van de schijven verpletter en hem naar een verse druppel PBS verplaatsen. Dus nu hebben we ons vaste larvale hoofd.
We gaan al het overtollige weefsel verwijderen en ofwel de larve bij de monddelen grijpen zoals eerder, of we kunnen hem met de pincet tegen de dissectieplaat drukken. De monddelen zijn nu naar links. Oké, hier hebben we de darm, die we niet willen, en er is een speekselklier.
Er is wat vetlichaam of vetlichaam. Blijf gewoon trekken, vooral vet, dat kan interfereren met sommige tests en vlekken van alles wat je niet wilt. Dus nu hebben we de schoongemaakte larvale kop.
Dus nu hebben we onze larvale koppen, die zijn gedissecteerd van het lichaam, vastgelegd en gewassen, het overtollige weefsel is verwijderd, en ze zijn behandeld met wat ze moeten worden behandeld, wat een antilichaamkleuring in C twee tunnel of andere functionele kleuring kan zijn. En nu hebben we ze op een dia geplaatst en we zijn klaar om de eigenlijke schijven van het hoofd te dissecteren. De monddelen.
Oké, dus deze keer zijn onze monddelen hier links. Ik ga mijn pincet nemen en die gewoon tegen de schuif drukken. Aan mijn rechterhand heb ik een nummer 11 scalpelmes, dat is ook een iets fijner instrument, waarmee ik kan dissecteren.
Dus eerst ga ik het CNS en de optische lobben verwijderen. En je ziet daar het CNS, daar zijn de twee optische lobben, en hier zijn de oogantenneschijven eraan bevestigd. Dus als ik het CNS verwijder door mijn mes tussen de optische lobben en de oogschijven te steken en langzaam te trekken, rekken de oogschijven daar een beetje uit.
Oké, dus daar hebben we het CNS en de optische lobben. Dus nu hebben we de twee oog lo oogschijven, die los zijn gemaakt van het CNS. Nu ga ik ze van de monddelen verwijderen door gewoon voorzichtig te snijden en aan de basis te trekken.
Oké, dus daar is een oogantenneschijf, de andere oog inten schijf. Oké. En nu kunnen we de vleugelschijf hier zien uitsteken. Ik ga weer voorzichtig de basis vinden, snijden en trekken.
Dus daar hebben we een vleugelschijf en een beenschijf eraan bevestigd, samen met een beetje trachea. Oké, daar is je vleugelschijf met een beenschijf eraan, en er zijn duidelijk verschillende beenschijven. Dus we kunnen hier rondzoeken en meer schijven vinden door gewoon voorzichtig te proberen met de mes.
Dat zijn alle schijven die we in deze zullen vinden. Er zijn nog een paar meer beenschijven.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol toont de dissectietechniek die wordt gebruikt voor het isoleren van imaginale schijven van drosophila-larven in het 3e larvale stadium. Methoden voor het fixeren van het weefsel na het verwijderen van de vleugel-, been- en oogschijven worden direct op een microscoopglas gedemonstreerd voor latere visualisatie.
Belangrijke studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Ontwikkelingsbiologie
- Genetica
Achtergrond
- Imaginale schijven zijn cruciaal voor het bestuderen van ontwikkelingsprocessen in Drosophila.
- Larven in het derde larvale stadium bieden een model voor het onderzoeken van apoptose en eiwitexpressie.
- Dissectietechnieken zijn essentieel voor het isoleren van specifiek weefsel voor analyse.
- Juiste gereedschappen en methoden verbeteren de nauwkeurigheid van dissecties.
Doel van de studie
- Om imaginale schijven te isoleren voor ontwikkelingsstudies.
- Om cellulaire processen binnen de schijven te visualiseren en analyseren.
- Om een gedetailleerd protocol te bieden voor onderzoekers in het veld.
Gebruikte methoden
- Gebruik van een plukstaaf om larven uit schalen te extraheren.
- Gebruik van scherpe dissectiepincetten voor precisie.
- Fixatie van weefsel op microscoopglazen voor visualisatie.
- Demonstratie van dissectietechnieken voor vleugel-, been- en oogschijven.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van imaginale schijven van larven.
- Effectieve visualisatie van ontwikkelingsprocessen na dissectie.
- Demonstratie van het belang van scherpte van gereedschap bij dissecties.
- Protocol biedt een basis voor verder onderzoek in de ontwikkelingsbiologie.
Conclusies
- De dissectietechniek is effectief voor het isoleren van imaginale schijven.
- Juiste methoden verbeteren de studie van ontwikkelingsprocessen in Drosophila.
- Dit protocol dient als een waardevolle bron voor onderzoekers.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This protocol provides a foundational method for isolating Drosophila imaginal discs, enabling mechanistic studies of developmental pathways and apoptosis. The technique supports target validation by allowing precise interrogation of gene function in a genetically tractable model system. It enhances predictive confidence in early discovery by facilitating phenotypic screening and pathway analysis relevant to conserved human disease mechanisms.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of genes and pathways in a living tissue context to support target hypothesis testing.
- Operational Value: Provides a reproducible method for isolating specific tissues to reduce variability in downstream assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates isolated disc preparations suitable for protein expression studies and functional staining to assess compound effects.
- Operational Value: Standardizes tissue preparation for consistent readouts in apoptosis and developmental process screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by linking genetic perturbations to observable developmental phenotypes in a disease-relevant system.
- Operational Value: Facilitates continuity from gene discovery to functional validation in a genetically manipulable model.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where genetic and phenotypic screening inform target selection and lead identification efforts.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing through tissue-specific protein expression and phenotypic analysis in imaginal discs.
- Screening: Delivers standardized tissue samples for quantitative assessment of developmental processes and compound-induced phenotypes.
- Analytics: Produces isolatable tissues compatible with staining, imaging, and molecular readouts for pathway analysis.
- Translational Research: Connects genetic findings to phenotypic outcomes in a conserved developmental system relevant to human biology.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable tissue preparation platform for iterative screening and mechanistic studies across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence through direct observation of developmental phenotypes in intact tissues.
- Operational Value: Improves assay reproducibility via standardized dissection and tissue mounting procedures.
- Strategic Value: Reduces false positives in target selection by providing functional validation in a physiological context.
- Portfolio Impact: Supports early go/no-go decisions by clarifying mechanism-of-action and phenotypic relevance.
Implementation Considerations
- Requires proficiency in microsurgical techniques and tissue handling to maintain sample integrity.
- Dependent on sharp dissection tools and clean PBS-based workflows to prevent tissue damage or contamination.
- Necessitates standardization across operators to ensure consistent disc isolation and mounting quality.
- Adaptable to various staining and fixation protocols depending on downstream assay requirements.
- Limited by the small tissue size, which may constrain multiplexed analytical approaches.
