Name: Zuivering van Mitochondriën uit gistcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-24T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Leer een snelle methode voor zuivering van mitochondriën uit Saccharomyces cerevisiae met behulp van sphero-plastvorming, homogenisatie en sucrose-dichtheidsgradiëntcentrifugatie. Deze aanpak behoudt structurele en functionele integriteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de CIHR en de NSERC van Canada. VIT is een CIHR nieuwe onderzoeker en de Concordia University Research Chair in Genomics, Celbiologie en veroudering.

Materialen en methoden Giststammen en groei-omstandigheden De wild-type stam BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) werd gekweekt in een rijke YEPD medium (1% gistextract, 2% pepton, 2% glucose). Cellen werden gekweekt bij 30 ° C met een rotatie schudden bij 200 rpm in erlenmeyers op een &#39;fles volume / medium volume &quot;ratio van 5:1. Isolatie van ruwe mitochondriale fractie <ol><li> Grow een L van de wild-type stam BY4742 cultuur voor 48 uur </li><li> Giet cultuur in 500 ml Nalgene centrifugebuizen. De balans van de belasting en de oogst cellen door centrifugatie gedurende 5 min bij 3000 xg bij kamertemperatuur. </li><li> Decanteer supernatant en resuspendeer gepelleteerd cellen in 250 ml dH2O. Pellet cellen door centrifugatie gedurende 5 min bij 3000 xg bij kamertemperatuur. </li><li> Decanteer supernatant en resuspendeer gepelleteerd cellen in 250 ml dH2O. Pellet cellen door centrifugatie gedurende 5 min bij 3000 xg bij kamertemperatuur. </li><li> Bepaal natte gewicht van celpellet. </li><li> Resuspendeer gepelleteerd cellen in DTT buffer [2 ml buffer / g (nat gewicht) cellen]. </li><li> Breng de celsuspensie tot 50-ml Falcon plastic buizen. </li><li> Draai de buizen op 70 toeren per minuut in een shaker gedurende 20 min bij 30 ° C. </li><li> Oogst cellen door centrifugatie gedurende 5 min bij 3000 xg bij kamertemperatuur. </li><li> Resuspendeer gepelleteerd cellen in Zymolyase buffer zonder Zymolyase [7 ml van de buffer / g (nat gewicht) cellen]. </li><li> Pellet cellen door centrifugatie gedurende 5 min bij 3000 xg bij kamertemperatuur. </li><li> Resuspendeer gepelleteerd cellen in Zymolyase buffer zonder Zymolyase [7 ml van de buffer / g (nat gewicht) cellen]. </li><li> Overdracht celsuspensie om een ​​glazen flesje. </li><li> Voeg het poeder van Zymolyase-100T [1 mg Zymolyase-100T / g (nat gewicht) cellen] om de celsuspensie. </li><li> Draai de fles met celsuspensie op 70 toeren per minuut in een shaker gedurende 30 minuten bij 30 ° C. </li><li> Overdracht spheroplasts gevormd door de vertering van de celwand met Zymolyase-100T tot 50-ml plastic centrifugebuizen. </li><li> Pellet spheroplasts door middel van centrifugeren gedurende 8 minuten bij 2200 xg bij 4 ° C. </li></ol> ** Alle volgende stappen moeten worden uitgevoerd bij 4 ° C of op ijs. Suspensies van spheroplasts moeten worden behandeld zachtjes met pipetten met gesneden tips om te voorkomen dat het breken van organellen .** <ol start="18"><li> Resuspendeer gepelleteerd spheroplasts in ijskoude homogenisering buffer [6,5 ml van de buffer / g (nat gewicht) cellen]. </li><li> Pellet spheroplasts door middel van centrifugeren gedurende 8 minuten bij 2200 xg bij 4 ° C. </li><li> Resuspendeer gepelleteerd spheroplasts in ijskoude homogenisering buffer [6,5 ml van de buffer / g (nat gewicht) cellen]. </li><li> Overdracht cellen om een ​​pre-gekoeld op ijs glas homogenisator. </li><li> Met behulp van een strakke stamper, homogeniseren van de cellen door het maken van 15 slagen van de stamper. </li><li> Voeg een volume van ijs-koud homogenisering buffer. </li><li> Overdracht gehomogeniseerd spheroplasts tot 50-ml plastic centrifugebuizen. </li><li> Pellet ongebroken cellen, kernen en grote puin door centrifugeren gedurende 5 minuten bij 1500 xg bij 4 ° C. </li><li> Centrifugeer de resulterende supernatant gedurende 5 minuten bij 3000 xg bij 4 ° C. </li><li> Centrifugeer de resulterende supernatant gedurende 15 min bij 12.000 xg bij 4 ° C. </li><li> Decanteer supernatant en resuspendeer pellet in ijskoude homogenisering buffer [6,5 ml van de buffer / g (nat gewicht) cellen]. </li><li> Centrifugeer gedurende 5 min bij 3000 xg bij 4 ° C. </li><li> Centrifugeer de resulterende supernatant gedurende 15 min bij 12.000 xg bij 4 ° C. </li><li> Decanteer supernatant en resuspendeer pellet in 3 ml ijskoude SEM buffer. </li></ol> ** Hoewel deze opschorting is verrijkt met mitochondriën, het bevat ook andere organellen zoals het endoplasmatisch reticulum (microsomen), Golgi, en vacuolen. Om puur mitochondriën, kan dit ruwe mitochondriale fractie worden onderworpen aan verdere fractionering, zoals hieronder beschreven .** Zuivering van mitochondriën verstoken van besmetting door andere organellen <ol><li> Plaats 1,5 ml ijskoude 60% (w / v) sucrose in EM buffer in een Beekman Ultra-Clear centrifugebuis. </li><li> Overlay 60% (w / v) sucrose met 4 ml van 32%, 1,5 ml van 23%, 1,5 ml van 15% sucrose (alle wt / v in EM buffer). </li><li> Plaats 3 ml van het ruwe mitochondriale fractie in SEM buffer op de top van 15% (w / v) sucrose. </li><li> Centrifuge in een Beekman SW41 Ti swingende-bucket rotor gedurende 1 uur bij 134.000 xg (33.000 rpm) bij 4 ° C. </li><li> De intacte mitochondriën vormen een bruine band aan de 60% / 32% sucrose-interface. </li><li> Verwijder voorzichtig sucrose tot aan het bereiken van de mitochondriale band. </li><li> Verwijder de mitochondriale band met behulp van een pipet met een cut tip en plaats deze in een Beekman centrifugebuis voor een MLS-5 rotor. </li><li> Vul de buis met SEM buffer. </li><li> Pellet de zuivere mitochondria door centrifugeren in een MLS-5 rotor gedurende 30 min bij 10.000 xg (31.000 rpm) gedurende 30 minuten bij 4 ° C. </li><li> Decanteer supernatant met behulp vaneen pipet. </li><li> Gebruik de pure mitochondriën voor de analyse van mitochondriale functies, mitochondriale proteoom en lipidome, en mitochondriale DNA. </li></ol> Reagentia <ol><li> DTT buffer [100 mM Tris/H2SO4 (pH 9,4), 10 mM dithiothreitol] (voor 15 ml) <ul style="list-style-type:none;"><li> 1,5 ml van 1 M Tris/H2SO4 buffer (pH 9,4) </li><li> 150 ul van 1 M DTT </li><li> Volume tot 15 ml </li></ul></li><li> Zymolyase buffer [20 mM kaliumfosfaat (pH 7,4), 1,2 M sorbitol] (voor 100 ml) <ul style="list-style-type:none;"><li> 2 ml van 1 M kaliumfosfaatbuffer (pH 7,4) </li><li> 60 ml 2 M sorbitol </li><li> Volume op 100 ml </li></ul></li><li> Homogenisering buffer [10 mM Tris / HCl (pH 7,4), 0,6 M sorbitol, 1 mM EDTA, 0,2% (w / v) BSA] (voor 250 ml] <ul style="list-style-type:none;"><li> 2,5 ml van 1 M Tris / HCl buffer (pH 7,4) </li><li> 75 ml 2 M sorbitol </li><li> 500 pi van 500 mM EDTA </li><li> 0,5 g van de BSA </li><li> Volume tot 250 ml </li></ul></li><li> SEM buffer [10 mM MOPS / KOH (pH 7,2), 250 mM sucrose, 1 mM EDTA] (voor 250 ml) <ul style="list-style-type:none;"><li> 2,5 ml van 1 M MOPS / KOH buffer (pH 7,2) </li><li> 31,25 ml van 2 M sucrose </li><li> 500 pi van 500 mM EDTA </li><li> Volume tot 250 ml </li></ul></li><li> EM buffer [10 mM MOPS / KOH (pH 7,2), 1 mM EDTA] (voor 250 ml) <ul style="list-style-type:none;"><li> 2,5 ml van 1 M MOPS / KOH buffer (pH 7,2) </li><li> 500 pi van 500 mM EDTA </li><li> Volume tot 250 ml </li></ul></li></ol>

<ol><li>Voet, D., Voet, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Biochemistry.</a> , 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. (2004).</li>
<li>Suen, D. -F., Norris, K. L., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dynamics+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dynamics and apoptosis.</a> Genes Dev. 22, 1577-1590 (2008).</li>
<li>Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F. &amp, Hardwick, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+factors+with+dual+roles+in+death+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial factors with dual roles in death and survival.</a> Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).</li>
<li>Detmer, S. A., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+and+dysfunctions+of+mitochondrial+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Functions and dysfunctions of mitochondrial dynamics.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 870-879 (2007).</li>
<li>McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+more+than+just+a+powerhouse%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: more than just a powerhouse.</a> Curr. Biol. 16, R551-R560 (2006).</li>
<li>Balaban, R. S., Nemoto, S., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%2C+oxidants%2C+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria, oxidants, and aging.</a> Cell. 120, 483-495 (2005).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te melden.

Deze methode maakt het mogelijk hoog rendement isolatie van pure mitochondria uit gistcellen. Mitochondria gezuiverd door middel van deze methode zijn in wezen vrij is van besmetting door andere organellen en behouden hun structurele en functionele integriteit na de zuivering. De beschreven methode levert mitochondriën die geschikt zijn voor cel-vrije reconstructie van essentiële mitochondriale processen. Deze zeer zuivere mitochondriën kan ook worden gebruikt voor de analyse van mitochondriale structuur en functies, mi...

zuivering van mitochondriën uit gistcellen

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondriën zijn de belangrijkste site van ATP productie tijdens aërobe metabolisme in eukaryote niet-fotosynthetische cellen<sup&gt; 1</sup&gt;. Deze complexe organellen spelen ook een essentiële rol in apoptotische celdood<sup&gt; 2</sup&gt;, Overleving van de cel<sup&gt; 3</sup&gt;, Zoogdieren ontwikkeling<sup&gt; 4</sup&gt;, Neuronale ontwikkeling en functie<sup&gt; 4</sup&gt;, Intracellulaire signalisatie<sup&gt; 5</sup&gt;, En een lange levensduur regelgeving<sup&gt; 6</sup&gt;. Ons inzicht in deze complexe biologische processen gecontroleerd door mitochondria is gebaseerd op robuuste methoden voor de beoordeling van hun morfologie, hun eiwitten en lipiden, de integriteit van hun DNA, en hun talrijke vitale functies. De gist<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;, Een genetisch en biochemisch manipuleerbare eencellige eukaryote met geannoteerde genoom en goed gedefinieerde proteoom, is een waardevol model voor het bestuderen van de moleculaire en cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan essentiële biologische functies van de mitochondriën. Voor dit soort studies, is het cruciaal om zeer zuiver mitochondriën hebben. Hier presenteren we een gedetailleerde beschrijving van een snelle en effectieve methode voor het zuiveren van gist mitochondriën. Deze methode kan de isolatie van zeer zuivere mitochondriën die in wezen vrij is van besmetting door andere organellen en behouden hun structurele en functionele integriteit na de zuivering. Mitochondria gezuiverd door middel van deze methode zijn geschikt voor celvrij reconstructie van essentiële mitochondriale processen en kan worden gebruikt voor de analyse van mitochondriale structuur en functies, mitochondriale proteoom en lipidome, en mitochondriale DNA.

Beschrijven we een snelle en effectieve methode voor de zuivering van mitochondriën van de gist<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;. Deze methode maakt het mogelijk hoog rendement isolatie van pure mitochondriën die in wezen vrij is van besmetting door andere organellen en behouden hun structurele en functionele integriteit na de zuivering.

Zuivering van Mitochondriën uit gistcellen

Mitochondriën zijn de belangrijkste plaats voor de ATP-productie tijdens het aerobe metabolisme in eukaryote niet-fotosynthetische cellen1. Deze complexe organellen spelen ook een ...

Dit protocol begint met het omzetten van gistcellen in sferoplasten door de celwand te verteren met zymolyase, waarna de sferoplasten worden gehomogeniseerd met een glazen Teflon-homogenisator. Het resulterende homogenaat wordt tweemaal gecentrifugeerd om intacte cellen, kernen en groot celpuin te pelletteren. Vervolgens wordt het resulterende supernatant 15 minuten gecentrifugeerd bij 12.000 Gs om mitochondria te sedimenteren.Ten slotte wordt de ruwe mitochondriale fractie, die nog andere organellen bevat, 60 minuten lang gecentrifugeerd bij 134, 000 Gs in een sucrose-dichtheidsgradiënt, waarbij pure mitochondria zonder contaminatie door andere organellen worden teruggewonnen in de interface van 60% gewicht per volume en 32% gewicht per volume sucrose. Hallo, ik ben Dr. Christopher Greg van het laboratorium van Dr. Vladimir Tko van de afdeling biologie aan de Concordia University. Vandaag ga ik u laten zien hoe u mitochondria isoleert uit de gist *Saccharomyces cerevisiae*.We doen dit om de dynamiek en de ouderdomsgerelateerde veranderingen die plaatsvinden in de mitochondria te bestuderen. Naarmate de cellen verouderen, zullen we kijken naar veranderingen in het proteoom, het lipidoom en het DNA van de mitochondria. Laten we beginnen.Begin dit protocol door de giststam te kweken in tien kolven van 250 milliliter. Elke kolf bevat 50 milliliters YP-medium bij 30 °C met roterend schudden gedurende 48 uur. Giet de cultuur vervolgens over in Nalgene-centrifugebuizen van 500 milliliter.Oogst de cellen door vijf minuten te centrifugeren bij 3000 Gs bij kamertemperatuur, schenk het supernatant af en resuspendeer de gepelletteerde cellen in 250 milliliters gedestilleerd water; centrifugeer de cellen vijf minuten bij 3000 Gs bij kamertemperatuur. Herhaal deze stap, resuspendeer de gepelletteerde cellen in 250 milliliters gedestilleerd water en centrifugeer vijf minuten.Weeg de resulterende natte celpellet bij 3000 Gs bij kamertemperatuur, resuspendeer de gepelletteerde cellen vervolgens in DTT-buffer en overbreng de celsuspensie naar een kolf van 250 milliliter. Roteer de kolf bij 70 RPMs bij 30 degrees Celsius gedurende 20 minuten. Oogst na deze 20 minuten de cellen door centrifugatie gedurende vijf minuten bij 3000 Gs bij kamertemperatuur, resuspendeer de gepelletteerde cellen in Xs-buffer zonder Xs en centrifugeer gedurende vijf minuten.Resuspendeer de gepelletteerde cellen bij 3000 Gs bij kamertemperatuur opnieuw in Zy-buffer zonder Xs en breng de celsuspensie over naar een glazen kolf. Voeg het zy liase 100 T-poeder toe aan de celsuspensie en roteer dit 30 minuten lang bij 70 RPM in een shaker van 30 °C. De Zy liase 100 T zal de celwanden verteren om sferoplasten te vormen. Alle stappen volgende op de eerder getoonde X-vertering moeten worden uitgevoerd bij 4 °C of op ijs.Suspensies van splats moeten voorzichtig worden behandeld met pipetten met afgesneden tips om het breken van organellen te voorkomen. Na voltooiing van de 30 minuten durende XMO-digestie worden de Sphero plats overgebracht naar plastic centrifugebuizen van 50 milliliter en acht minuten gecentrifugeerd bij 2200 Gs bij vier graden Celsius; resuspendeer de gepellette S splats in ijskoud homogenisatiebuffer en centrifugeer de S splats gedurende acht minuten bij 2200 Gs bij vier graden Celsius.Resuspendeer de gepellette sphero-plasten in ijskoud homogenisatiebuffer en breng de cellen over naar een vooraf gekoelde glazen homogenisator. Homogeniseer de cellen met een nauwsluitende stamper door 15 keer met de stamper op en neer te bewegen.Voeg een gelijk volume ijskoud homogenisatiebuffer toe aan de gehomogeniseerde S-splats en breng deze over naar plastic centrifugebuisjes van 50 milliliter. Centrifugeer de gehomogeniseerde splats gedurende vijf minuten bij 1500 Gs bij vier graden Celsius om onbeschadigde cellen, kernen en groot debris te pelletteren. Giet het resulterende supernatant in nieuwe buisjes en centrifugeer gedurende vijf minuten.Bij 3000 Gs bij vier graden Celsius. Centrifugeer daarna het resulterende supernatant gedurende 15 minuten bij 12.000 Gs bij vier graden Celsius, schenk het supernatant af en resuspendeer de pellet in ijskoude homogenisatiebuffer.Centrifugeer het resuspendeerde pellet vijf minuten lang bij 3000 Gs bij vier graden Celsius. Centrifugeer vervolgens het resulterende supernatant gedurende 15 minuten bij 12.000 Gs bij vier graden Celsius. Giet het supernatant af en resuspendeer het pellet in drie milliliter ijskoud water.SEM-buffer. Deze suspensie is de ruwe mitochondriale fractie. Hoewel deze verrijkt is met mitochondriën, bevat deze ook andere organellen zoals het endoplasmatisch reticulum of microsomen GOGI en VAs om zuivere mitochondriën te verkrijgen.De suspensie zal verder worden gefractioneerd zoals beschreven in de volgende sectie. Om te beginnen met de fractionering van de ruwe mitochondriale suspensie om pure mitochondriën te verkrijgen, plaatst u 1,5 milliliters ijskoude, 60% gewicht per volume sucrose in em-buffer in een Beckman UltraClear centrifugebuis.Breng vervolgens voorzichtig over de 60%sucrose vier milliliter 32%sucrose, 1,5 milliliter 23%sucrose en 1,5 milliliter 15%sucrose aan, allen gewicht per volume in SEM-buffer. Plaats drie milliliter van de ruwe mitochondriale fractie in SEM-buffer bovenop de 15%gewicht per volume sucrose. Centrifugeer in een Beckman SW 41 TI swinging bucket rotor gedurende één uur bij 134.000 Gs of 33.000 RPMs bij vier graden Celsius.Na centrifugatie vormen de intacte mitochondriën een bruine band op de interface tussen 60% en 32% sucrose. Verwijder voorzichtig de sucrose tot de mitochondriale band met een pipet met een afgeknipt tipje, neem de mitochondriale band op en breng deze over in een Beckman-centrifugeebuis. Vul de buis bij gebruik van een MLS five-rotor aan met SEM-buffer, pelleteer de zuivere mitochondriën door centrifugatie in een MLS five-rotor bij 10 000 g of 31 000 RPM gedurende 30 minuten bij 4 °C en schenk het supernatant af.Deze zuivere mitochondriën kunnen nu worden gebruikt voor de analyse van mitochondriale functies, het mitochondriale proteoom, lipiden en mitochondriaal DNA. De ruwe mitochondriale fractie in de linkerbanen en de door centrifugatie in een sucrose-dichtheidsgradiënt gezuiverde mitochondriën in de rechterbanen werden onderworpen aan SDS-PAGE en immunoblotting met antilichamen tegen eiwitmarkers van diverse organellen. De aanwezigheid van mitochondriën in beide preparaten werd bevestigd door PO one P en COX one p immunoreactiviteit; immunoblotting wees op de aanwezigheid van DP M1 P, FO 13 p en VPS 10 P, die respectievelijk staan voor eiwitten van het endoplasmatisch reticulum, ribosomen en het Golgi-apparaat in de ruwe mitochondriale fractie.In tegenstelling hiermee werden deze marker-eiwitten niet aangetroffen in de gezuiverde mitochondriën, wat bevestigt dat het protocol resulteerde in mitochondriën zonder contaminatie door andere organellen. We hebben u zojuist laten zien hoe u mitochondriën isoleert uit de gist *Saccharomyces cerevisiae*. Houd er bij het uitvoeren van dit experiment rekening mee dat de cellen niet langer dan een half uur in lysisbuffer 100 T mogen incuberen, omdat u anders riskeert dat de membraaneiwitten of organel-eiwitten die in de cellen aanwezig zijn, degraderen.Dit zou kunnen worden veroorzaakt door proteasen die in het reagens aanwezig zijn. Daarnaast kunt u, wanneer u de mitochondria en de sucrosegradiënt gaat isoleren, deze mitochondria bij -20 °C invriezen en ze vervolgens ontdooien voordat u daadwerkelijk de centrifugatiestap uitvoert. Dat is alles.Veel succes met uw experimenten.

purification-of-mitochondria-from-yeast-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Verontreiniging van de voorbereidingen van eukaryotische ribosomen gezuiverd door middel van traditionele methoden door co-zuiveren nucleasen en proteasen negatief effect op de downstream-biochemische en structurele analyses. Een snelle en eenvoudige chromatografische zuivering methode wordt gebruikt om dit probleem op met behulp van gist ribosomen als een modelsysteem op te lossen.

Chromatografische zuivering van sterk actieve gist Ribosomen

Veel mRNAs coderend mitochondriale eiwitten zijn geassocieerd met de mitochondriën buitenmembraan. We beschrijven een subcellulaire fractionering procedure gericht op isolatie van gist mitochondriën met de bijbehorende mRNA en ribosomen. Dit protocol kan worden toegepast op cellen onder verschillende omstandigheden gekweekt om de mechanismen van mRNA lokalisatie en translatie gelokaliseerd nabij de mitochondriën onthullen.

Isolatie van mRNA&#39;s geassocieerd met Gist Mitochondriën Mechanismen van Gelokaliseerde Vertaling Studie

Hier presenteren we een protocol om express, solubilize en zuiveren van diverse eukaryotic boraat vervoerders met homologie aan de SLC4 transporter familie met behulp van gist. Ook beschrijven we een chemische cross-linking test om te beoordelen van de gezuiverde homomeric eiwitten voor montage van de multimeric. Deze protocollen kunnen worden aangepast voor andere uitdagende membraaneiwitten.

Meningsuiting, solubilisatie en zuivering van eukaryotische boraat Transporters

Baker's gist mitochondriaal genoom codeert voor acht polypeptiden. Het doel van het huidige protocol is om ze allemaal te labelen en ze vervolgens als afzonderlijke banden te visualiseren.

Etikettering en visualisatie van Mitochondriale genoomexpressieproducten in Baker&apos;s Yeast Saccharomyces cerevisiae

Ondanks recente vooruitgang blijven veel mitochondriale gisteiwitten nog steeds met hun functies volledig onbekend. Dit protocol biedt een eenvoudige en betrouwbare methode om de submitchondriale lokalisatie van eiwitten te bepalen, wat fundamenteel is geweest voor de opheldering van hun moleculaire functies.

Beoordeling van submitchondrial protein localization in ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae

We presenteren een tweestappenprotocol voor hoogwaardige mitochondrische isolatie dat compatibel is met eiwitontdekking en kwantificering op proteoomschaal. Ons protocol vereist geen genetische manipulatie en is dus geschikt voor het bestuderen van mitochondriën uit primaire cellen en weefsels.

Tweestaps tagvrije isolatie van mitochondriën voor verbeterde eiwitontdekking en kwantificering

Mitochondriale contactplaatsen zijn eiwitcomplexen die interageren met mitochondriale binnen- en buitenmembraaneiwitten. Deze plaatsen zijn essentieel voor de communicatie tussen de mitochondriale membranen en dus tussen het cytosol en de mitochondriale matrix. Hier beschrijven we een methode om kandidaten te identificeren die in aanmerking komen voor deze specifieke klasse van eiwitten.

Een verbeterde methode om mitochondriale contactplaatsen te isoleren

Dit werk legt uit hoe gistmitochondriën kunnen worden getransformeerd met behulp van een biolistische methode. We laten ook zien hoe de transformanten kunnen worden geselecteerd en gezuiverd en hoe de gewenste mutatie in de doelpositie binnen het mitochondriale genoom kan worden geïntroduceerd.

Mitochondriale transformatie bij Baker

Mitochondriale ademhaling in gistcellen is een waardevolle indicator van de bio-energetica van cellen. Hier presenteren we een protocol om dit fenotype te kwantificeren dat van toepassing is op verschillende gistsoorten.

Kwantificering van mitochondriale ademhaling in hele gistcellen

De splijtingsgist Schizosaccharomyces pombe is in opkomst als een aantrekkelijk model voor het bestuderen van mitochondriën. Hier beschrijven we een protocol voor het analyseren van de overvloed en assemblage van de mitochondriale ademhalingscomplexen in S. pombe. Dit maakt de karakterisering mogelijk van de nieuwe functies van geconserveerde genen in de mitochondriale ademhalingsketen.

Analyse van de expressie en complexassemblage van de mitochondriale respiratoire keteneiwitten in de splijtingsgist Schizosaccharomyces pombe

Leer een snelle methode voor zuivering van mitochondriën uit Saccharomyces cerevisiae met behulp van sphero-plastvorming, homogenisatie en sucrose-dichtheidsgradiëntcentrifugatie. Deze aanpak behoudt structurele en functionele integriteit.

Zuivering van Mitochondriën uit gistcellen

Meer video's verkennen