Tissue Gerichte Embryonale Chimera: Zebravis gastrula Cell Transplantation

Deze procedure begint met het plaatsen van zebravisembryoen in het een-celstadium in een micro-injectieplaatje. Injecteer een fluorescerende dextrine-oplossing in de dooier. De geïnjecteerde embryoen direct onder de cel zijn de transplantatiedonoren.

Coat donor- en hostembryo's en laat ze groeien tot het schildstadium. Plaats twee met DEC gecoate, met dextrine geïnjecteerde embryo's naast elkaar in één well van een transplantatieplaat. Herhaal dit voor elk donorpaar. Voeg één hostembryo per well toe om de getransplanteerde cellen naar het toekomstige diecephalon van de voorhersenen te richten; transplanteer cellen van en naar de middenlijn.

Halverwege tussen de dierpool en het schild. Transplanteer cellen van de donor-gasa naar de gast-gasa. Laat groeien tot 30 uur en fixeer vervolgens.

Voer indien nodig immunochemie uit, monteer en beeldvorm. Alternatief kan de gastheer levend worden gemonteerd voor time-lapse imaging. Hallo, mijn naam is Elizabeth De Shane van het laboratorium van Dr. Michael ESI van de afdeling Biological Sciences aan Smith College in Northampton, Massachusetts.

Ik ben de hoofdonderzoeker van het laboratorium, Dr. Michael Besi. Vandaag laten we u zien hoe u chimeere embryo's creëert door gastrulatiefase-celtransplantaties uit te voeren met behulp van het modelorganisme zebravis. In mijn laboratorium gebruiken we deze procedure om de functie van specifieke genen bij de ontwikkeling van de commissura van de voorhersenen te bestuderen, evenals het proces van axon-gliale interacties tijdens de vorming van de commissura.

Laten we beginnen. Bereid eerst de trogvormen voor de microinjectieplaten voor door voorzichtig drie niet-filamentaire capillairen van 1 mm dik en 4 inch lang doormidden te breken. Plak met secondelijm twee van de capillaire helften zij aan zij op een vlak oppervlak.

Plaats de derde capillaire bovenop deze twee, genesteld in de groef om een piramidevorm te creëren. Laat de mal drogen met de drie capillairen erin. U dient ongeveer drie tot vijf mallen te maken voor elke injectieplaat.

Bereid vervolgens de injectieplaten voor door 20 tot 25 milliliter gesmolten 1,5% aros in embryo-medium in een Petri-schaal van 100 millimeter te gieten. Plaats onmiddellijk drie tot vijf van de voorbereide gootvormen op de bodem van de schaal, waarbij u erop let dat de platte zijde van de vorm de bodem van de Petri-schaal raakt en volledig door het aros wordt bedekt. Wanneer het aros is gestold, verwijdert u de gootvormen door een groot aros-vierkant uit te snijden waarin deze zich bevinden.

Verwijder voorzichtig de agar aan de rand van het uitgesneden vierkant en gooi deze weg. Draai het vierkante stuk agar om en verwijder de trogvormen volledig met een fijne pincet. Giet gesmolten agar in de Petrischaal rondom het vierkant om de nieuw gevormde putjes op hun plaats te houden.

Laat het uitharden. Platen kunnen met parafilm worden afgesloten en wekenlang worden bewaard bij vier graden Celsius. Ze moeten worden weggegooid als er tekenen van groei in de agar zichtbaar zijn.

Ten slotte, gebruik voor het bereiden van de injectienaalden een micropipet-capillaire trekker om naalden te maken uit glazen capillairen van één millimeter met een lengte van vier inch en interne filamenten, waarbij de micro-injectieplaat en naalden zijn voorbereid. Laten we kijken naar het verzamelen van embryo's en het opstellen van de micro-injectieapparatuur. Gebefalteerde eieren worden onmiddellijk na de legging verzameld en in een Petrischaal gevuld met embryo-medium bewaard.

Gebruik een glazen pipet met een brede tip om de embryo's in de putjes van een injectieplaat op kamertemperatuur te brengen, die is gevuld met embryo-medium. Gebruik gebogen stompe pincetten om de embryo's voorzichtig tegen de bodem van de troggen te drukken; embryo's waarvan het chorion of de dooier zijn aangetast, moeten worden weggegooid.

Vul vervolgens de injectienaald met één tot twee µL van de verdunde fluorescerende Alexa 594 dextrine-oplossing. Laat de dextrine door capillaire werking naar de punt van de injectienaald vloeien. Bevestig de injectienaald aan de capillaire houder van een stereotactische micromanipulator en stel in eerste instantie de druk op het micro-injectieapparaat in.

40 tot 50 PSI en een polsduur van 500 milliseconden. Gebruik een pincet om voorzichtig de punt van de injectienaald aan te raken of af te knippen om de verzegeling te breken. Idealiter moet de diameter 0,05 tot 0,15 millimeter zijn.

Om de naald te kalibreren, gebruikt u een stereomicroscoop en brengt u de dextrine aan op een micrometer met minerale olie erbovenop. Pas de bolusgrootte aan door de duur van de luchtdrukpuls en de maat van de naald te variëren. Tip: Er moet gedurende de injecties een bolusgrootte worden gehandhaafd die gelijkstaat aan een volume van 0,8 tot 1 nanoliter.

We kunnen nu beginnen met de micro-injectie van dextrine met een vergroting van ongeveer 3,2x op een stereomicroscoop. Begin de embryo-injecties aan één uiteinde van het gootje door soepel door het chorion en het celmembraan van de embryo's heen te prikken om in de dooier te komen. Injecteer de dextrine-oplossing net onder de cel.

Zorg ervoor dat de injectienaald met dezelfde vloeiende beweging wordt verwijderd als waarmee deze het embryo is binnengedrongen. Verplaats de Petrischaal om het volgende embryo in de rij te positioneren en ga door met injecteren over de gehele lengte van het trogje. Controleer periodiek de druk en de bolusgrootte.

Gebruik nu een pincet om de embryo's voorzichtig uit de gootjes te duwen. Breng ze over naar een Petrischaal gevuld met antibiotisch embryo-medium. Incubeer de embryo's bij 28,5 °C en controleer ze op onbevruchte eieren of sterfte.

De embryo's zijn nu klaar voor toekomstige transplantaties. Voorafgaand aan de voltooiing van een poli tijdens gas ration blijven delen van de dooier blootgesteld. De dooier is uiterst fragiel en zal aan het plastic van de Petrischaal hechten en gemakkelijk scheuren.

Daarom moeten embryo's een dag voor de transplantaties op gecoate platen worden geplaatst. Maak deze decoratieplaten door vijf tot 10 milliliters gesmolten aros in een Petrischaal van 100 millimeter te gieten. Er is slechts een dunne laag aros van ongeveer twee tot drie millimeter nodig om de embryo's tijdens de decoratie te ondersteunen.

Laat de platen afkoelen. Maak vervolgens aparte transplantatieplaten door 30 milliliters van een 1,5% agaroplossing in een Petri-schaal van 100 millimeter te gieten en plaats daar een mal voor transplantatieputjes in. De mal moet 104 driehoekige inkepingen bevatten, elk bestaande uit drie zijden van 90 graden en één zijde met een hoek van 45 graden.

De putjes zijn ontworpen om twee embryo's naast elkaar te bevatten. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen onder de mal vast komen te zitten en laat de agarose uitharden. Na het verwijderen van de mal komt een verdiept gebied tevoorschijn met de vierkante putjes met een schuine rand.

Om gastheer- en donorembryo's voor transplantatie voor te bereiden, moet hun ontwikkeling worden gemonitord om koppelingen met een nagenoeg gelijke leeftijd te behouden. Hiervoor kunnen embryo's worden gekweekt bij variërende temperaturen van 23 tot 31 °C om de ontwikkeling te vertragen of te versnellen. Zowel de gastheer- als donorembryo's moeten één uur vóór de gewenste leeftijd handmatig worden gecoat op een gecoate coatingplaat.

In het geval van transplantaties in het gastrulatiestadium moet dit zijn voltooid binnen vijf uur na bevruchting (HPF), voorafgaand aan het schildstadium bij 5,5 HPF. Gebruik een glazen pipette om de gastheer- en donorembryo's in een transplantatieplaat te laden die is gevuld met antibiotisch embryo-medium. Hierbij is de eerste rij gevuld met donorembryo's, met twee embryo's per well, en zijn de volgende twee rijen gevuld met één enkel gastheemembryo per well.

Voor transplantaties gebruiken we een Zeiss luer fluorescent stereomicroscoop met volledig geautomatiseerde joystickbediening voor zoom en focusmanipulatie. Hoewel deze geautomatiseerde microscoop niet strikt noodzakelijk is, verhoogt deze de eenvoud en efficiëntie van deze fijne chirurgische transplantaties aanzienlijk, vooral wanneer een groot aantal transplantaties gewenst is. Om de transplantatieapparatuur op te stellen, stelt u de einor luchttram in op de middelste positie van de schaal, verbindt u de luchttramslang met de capillaire houder en bevestigt u de houder aan de einor geautomatiseerde micromanipulator. Nu de embryo's en de transplantatieapparatuur gereed zijn, kunnen we overgaan naar celtransplantaties in het gastrula-stadium.

De belangrijkste vaardigheid bij het uitvoeren van celtransplantaties in het gastrula-stadium is het vermogen om de cellulaire anatomie van de dorsale blastopore lip te herkennen, ook wel het schild genoemd bij zebravisjes. Hier presenteren we een sequentiefilm van de gastrula vanuit verschillende gezichtspunten en markeren we waar het schild zich bevindt in dit laterale aanzicht. Het schild of de dorsale zijde bevindt zich rechts in de rode omtrek om cellen te targeten voor transplantatie naar de voorhersenen en naar de middellijn.

Precies halverwege de dierpool en het schild beginnen we het embryo eerst naar u toe te draaien om de dierpool te bekijken, waarbij het schild en de transplantatieplaats gaandeweg worden geaccentueerd. Vervolgens draait het embryo om zijn as om het schild aan de onderzijde te positioneren. De gastrula roteert nu weer omhoog, waardoor u een rechtstreeks dorsaal aanzicht krijgt.

Het embryo wordt nu in omgekeerde volgorde teruggedraaid naar een lateraal aanzicht bij zes HPF. Gebruik de micromanipulator om het embryo voorzichtig met de punt van de capillair aan te raken en het te draaien naar een positie voor cel-extractie, zodanig dat de middellijn en het schild zichtbaar zijn en tegenover de punt van de capillair liggen; donor-embryo's zijn eenvoudig te verifiëren door over te schakelen van brightfield- naar fluorescentieverlichting. Hier fluoresceren de cellen van de gastrula rood. Aspireer een kleine hoeveelheid embryo-medium in de capillair om elke kans uit te sluiten dat cellen in contact komen met de lucht-waterinterface, wat hen zou kunnen beschadigen.

Doorboor voorzichtig het ectoderm van het donor embryo op de middellijn, precies tussen de dierpool en het schild. In de gasa bevonden zich slechts ongeveer 20 micrometers cellen tussen het oppervlakte-ectoderm en de onderliggende dooier. Wees daarom voorzichtig om de dooier niet te doorboren, aangezien dit vaak binnen enkele uren tot de dood leidt.

Aspiratie van de cellen in de capillair gebeurt langzaam met behulp van de luchtpomptang. Houd de waterlijn altijd in zicht terwijl u de tip lichtjes beweegt. De vloeistof in de donor helpt om de cel-celcontacten los te maken.

Er moeten ongeveer 10 tot 50 cellen uit het donorembryo worden geëxtraheerd. Verwijder vervolgens de capillaire uit de donor. Orienteer het gastembryo op dezelfde wijze, doorboor het en breng de cellen op exact dezelfde locatie in het gastembryo over; bij het overschakelen van brightfield- naar fluorescentieverlichting is de beweging van de met dextrine gelabelde cellen vanuit de capillaire naald in het gastembryo zichtbaar.

Verwijder tenslotte, na de transplantatie, de donor- en gastembryo's uit de putjes. Scheid ze en plaats ze voorzichtig in een met antibiotica gecoate Petrischaal gevuld met embryo-medium. Incubeer de embryo's bij 28,5 °C; de transplantaties zijn nu voltooid.

Laten we beginnen met de visualisatie en beeldvorming. De embryo's worden eerst gefixeerd in een voor immunochemie geverifieerd conserveermiddel op het juiste stadium voor beeldvorming. In ons geval gebeurt dit in 4% formaldehyde gedurende twee uur bij kamertemperatuur of overnacht bij vier graden Celsius onder rotatie.

Spoel de gefixeerde embryo's vervolgens twee keer af en was ze daarna gedurende drie tot vijf minuten. In 0,1 molair pb. Voer indien nodig de juiste immunolabeling uit.

Plaats de embryo's in 75% glycerol, laat ze op kamertemperatuur zinken en bewaar ze bij vier graden Celsius. Bereid een objectglas voor om twee embryo's te monteren door twee vierkante contouren van vaseline op een objectglas aan te brengen die overeenkomen met de binnendiameter van een dekglas. Plaats een dekglas naast het embryo en voer eventuele noodzakelijke dissecties uit om een frontaal aanzicht van de voorhersenen te verkrijgen.

Dissekeer de voorhersenen door loodrecht door het middenbrein te snijden. Plaats dit weefsel met een minimale hoeveelheid glycerol in het petroleum. Orienteer het weefsel zorgvuldig in de juiste positie en plaats een dekglas over het preparaat.

Als alternatief kunnen levende embryo's in een 0,75% agro-oplossing op glas worden gemonteerd. Gebruik bodemkweekschalen en hanteer de embryo's met een wolfraamnaald om ze in de juiste oriëntatie voor beeldvorming te brengen voordat de agro stolt. Zowel gefixeerde als levende gastheren worden afgebeeld.

Met behulp van de Leica SP five laser scanning confocale microscoop worden Z-stacks verkregen en wordt er drie- of vierdimensionale beeldverwerking uitgevoerd met velocity-software om chimeere embryo's te genereren waarin een deel van de astrogliale populatie binnen het embryo verschilt in genotype of fenotype. We gebruikten een veelzijdige aanpak die het gebruik van GFP-transgene embryo's, die astroglia labelen, combineert met celtransplantatie in het gastrula-stadium om onze klonen specifiek op het cephalon te richten. We maakten gebruik van de gastrula-lotkaart (fate map) van de zebravis om selectief cellen te extraheren op de middellijn, op gelijke afstand van de animalpool en het schild.

Deze geëxtraheerde cellen werden vervolgens getransplanteerd naar dezelfde locatie in een wild-type gastgas, die vervolgens werd gekweekt tot 30 HPF en immunogemarkeerd voor alle axonen als referentielandmerken voor de anatomie van de voorhersenen. In het hier getoonde voorbeeld onthult confocale beeldvorming van één gastembryo geïsoleerde GFP-positieve cellen verspreid over het cephalon en cephalon. De volledige morfologie van deze GFP-positieve cellen kan worden waargenomen in deze clonale assay, waaruit blijkt dat de meeste van deze cellen de kenmerkende radiale gliamorfologie aannemen, waarbij het soma zich bevindt direct naast de ventriculaire zone en een grote eindvoet een radiaal proces beëindigt aan het pioppervlak.

Een driedimensionale weergave van de stapel van deze verzamelde optische coupes laat duidelijk de positie van deze cellen ten opzichte van de gelabelde axonen zien. Een andere veelgebruikte methode voor het visualiseren van getransplanteerde cellen is om in eerste instantie een fluorescente cellijnagekleurstof via micro-injectie in de dooier van een wild-type embryo of een GFP-transgeen embryo in het één-celstadium te brengen. In dit voorbeeld hebben we Alexa 594 dextrine geïnjecteerd in wild-type embryo's.

In het eencellige stadium lieten we ze zich ontwikkelen tot het gastrula-stadium en voerden we vervolgens vier hersenegerichte transplantaties uit zoals hierboven vermeld. In plaats daarvan transplanteerden we echter in transgene gastrula-gastheren; de dorsale cephalon werd gevisualiseerd met laser-scanning confocale microscopie. Confocale microscopie onthulde fluorescerend rode clusters van donorcellen te midden van GFP-positieve kernen binnen de voorhersenen.

We hebben deze gastheer verder geanalyseerd door gedurende twee uur elke drie minuten beelden op te nemen met de laser scanning confocale microscoop. Een vierdimensionale weergave van deze time-lapse, gemaakt met velocity-software ter beschikking gesteld door IMP, toont dynamische cellulaire bewegingen van de membranen van de staafjesdomeincellen en de GFP-positieve kernen. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u alle benodigde apparatuur en reagentia kunt voorbereiden voor celtransplantaties in zebravissenbryo's.

Specifiek hebben we de techniek gedemonstreerd in het gastrula-stadium. De methode is echter ook toepasbaar op transplantaties in het blastula-stadium. Bij het gebruik van deze procedure is het belangrijk om de uiteindelijke gewenste locatie van de getransplanteerde cellen nauwkeurig te correleren met de eerdere locatie van deze cellen op de fate map in de gastrula; raadpleeg voor verdere richtlijnen de gedetailleerde studie van Dr. Scott Frazier uit 1995 over fate maps van zebravis, getiteld Fate Maps of the Zebrafish Embryo.

Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.