Snelle en gevoelige colloïdaal Coomassie G-250 Kleuring voor Eiwitten in polyacrylamidegels

In deze video demonstreren we de kracht van een gemodificeerd Coomassie-kleuringsprotocol voor het detecteren van enkele nanogrammen eiwit in polyacrylamidegels. Aan de hand van het voorbeeld van tweedimensionale gelelektroforese, voorafgaand aan de scheiding in de eerste dimensie, worden geïmmobiliseerde pH-gradiëntstrips gerehydrateerd onder denaturerende buffercondities.

Na het overnacht herzwelling van de strips worden de eiwitmonsters aangebracht via anodische cup-loading. Tijdens het focusproces worden de eiwitten gescheiden op basis van hun isoelektrische punten. De scheiding in de tweede dimensie wordt uitgevoerd via SDS-PAGE.

De gel wordt vervolgens overgebracht naar een kleurbak en de eiwitten worden aangetoond door kleuring met kolloïdaal Coomassie. Hallo, ik ben Nadine de Bala van het laboratorium van Sabina Meka in het biologisch medisch onderzoekscentrum van de Universiteit van Olor. Vandaag vestig ik uw aandacht op een procedure die volgens collega's van Kangan niet breed bekend is; Coomassie Brilliant Blue is een kleurstof die veelvuldig wordt gebruikt voor de visualisatie van eiwitten na elektroforetische scheidingen, maar waarvan vaak wordt aangenomen dat deze minder geschikt is voor vergelijkende proteomics.

Echter biedt cos colloidal kleuring superieure kenmerken met betrekking tot gevoeligheid, kosten en praktische toepasbaarheid. In ons laboratorium gebruiken we het K-kleuringsprotocol voor bijna elke gelgebaseerde applicatie, maar met name in de analytische proteomics om veranderingen in de myocardiale eiwitexpressie te bepalen. Ik zal het gebruik van deze methode demonstreren om myocardiale eiwitten te detecteren in het alkalische pH-bereik van tweedimensionale elektroforesegels.

Laten we beginnen. De eerste dimensie van 2D-gelelektroforese is isoelektrische focusering of IEF, waarbij strips met een geïmmobiliseerde pH-gradiënt of IPG-strips worden gebruikt voor deze analyse.

Vóór de IEF worden vier IPG-strips individueel gehydrateerd in 125 µL rehydratie-oplossing met gebruik van de IM Mobilly dry strip swelling tray gedurende ten minste 10 uur, waarna de IPG-strips gehydrateerd zijn en gereed voor het aanbrengen van de eiwitmonsters. Met TCA geprecipiteerde eiwitmonsters van vier verschillende hartpreparaten worden opgelost in IEF-monsterbuffer tot een concentratie van 100 µg eiwit per 100 µL. De solubilisatie van de eiwitmonsters duurt ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur op een vortex.

Bereid ondertussen de aanvullende componenten van de IM Molene dry strip-kit voor om IEF uit te voeren in de multi four elektroforese-unit. Stel eerst de temperatuur van de koelunit in op 20 °C, pipetteer drie tot vier milliliters dekvloeistof op de koelplaat en plaats het Immobilien dry strip-plateau hierop met de rode elektrode-aansluiting in de richting van de anode. Giet ongeveer 10 milliliters dekolie in het Immobilien dry strip-plateau en plaats de Immobilien dry strip-uitlijner met de groefzijde naar boven op het met olie bedekte plateau.

Verwijder vervolgens de gehydrateerde strip uit het zwelbakje en breng deze met de gelzijde naar boven over naar de groeven van de uitlijner. Het zure uiteinde van de strip moet naar de anode zijn gericht. Aan het einde moeten alle strips met hun anodische randen zijn uitgelijnd.

Plaats met gedestilleerd water verzadigde elektrodestrips zijdelings over de uiteinden van de gelstrips, waarbij u ervoor zorgt dat de elektrodestrips het geloppervlak ten minste gedeeltelijk raken. Positioneer tot slot de elektroden op de elektrodestrips, zodat de gekleurde markering naar het overeenkomstige elektronische contact is gericht. Plaats de houder voor de monsterbekers nabij de anode bij het immobilien droge stripblad en plaats een monsterbeker boven elke IPG-strip.

Druk de monsterbekers voorzichtig naar beneden om een goed contact met de IPG-strip te waarborgen. Giet 70 tot 80 milliliters dekolie in de tray om de IPG-strips te bedekken. Er mag geen olie in de monsterbekers lekken.

Als er olie in de cup lekt, verwijder deze dan met een pipet en stel de cups opnieuw af. Voeg ten slotte ongeveer 150 milliliter dekolie toe om de monstercups volledig te bedekken. Breng nu de eiwitmonsters aan in de monstercups door te pipetteren onder het oppervlak van de dekvloeistof.

Het volume van het cupje is 100 µL. Zodra alle eiwitmonsters zijn aangebracht, worden alle leads aangesloten. Sluit de multi four unit aan op de stroomvoorziening en voer isoelektrische focussering uit gedurende 11,1 kV uren in gradiusmodus; na de IEF worden de IPG-strips met de gelzijde naar boven in een tray geplaatst en ondergaan ze reductie en alkylering tijdens de equilibratie.

Gebruik voor de reductie 2,5 milliliters van 1% DTT-equilibratie-oplossing per strip. Schud daarna 15 minuten en vervang vervolgens de DTT-oplossing volledig om de strips te alkyleren in 2,5% iodoacetamide-equilibratie-oplossing onder schudden gedurende nog eens 15 minuten. Spoel de geëquilibreerde strips één keer in een met water gevulde beker en dep ze op filterpapier om overtollige equilibratiebuffer te verwijderen.

Breng vervolgens de strips over naar één XSDS-runbuffer. De eiwitten in de strips zijn nu klaar voor de tweede dimensie van de 2D-gelelektroforese. De tweede dimensie wordt uitgevoerd middels SDS-PAGE op een verticaal elektroforesesysteem.

Een 적vaardig aantal 12% acrylamidegels met een dikte van één millimeter wordt één dag voor gebruik gegoten en afgedekt met nat papier bewaard. Bij kamertemperatuur worden de geëquilibreerde IPG-strips bovenop de scheidingsgels geplaatst en vastgezet met warme agarose-oplossing. De eiwitten worden gedurende 2,5 uur gescheiden, beginnend bij 80 volt gedurende 15 minuten, gevolgd door 120 volt totdat het kleurfront de onderkant van de gelcassette bereikt.

Terwijl de eiwitten worden gescheiden via SDS-PAGE, bereidt u de oplossingen voor de collïdaal kumasi-kleuring van de gel voor. Bij het maken van de kleuringsoplossing is het zeer belangrijk om de componenten in de volgende volgorde sequentieel toe te voegen. Los eerst 100 gram aluminiumsulfaat op in ongeveer 1,5 liter Milli-Q-water in een bekerglas en roer dit door. Nadat het aluminiumsulfaat is opgelost, mengt u 200 milliliter ethanol erdoorheen en voegt u 0,4 gram CBG two 50 toe aan de oplossing.

Zodra de CBB G two 50 volledig is opgelost, voegt u 47 milliliters orthofosforzuur toe. Deze stap stelt de kamasi-moleculen in staat om te aggregeren tot hun colloïdale toestand. Voeg tot slot milli Q water toe tot een eindvolume van twee liters.

De uiteindelijke rustoplossing zal zwevende deeltjes bevatten. Filtreer deze oplossing niet. De kleuringsoplossing kan ook vooraf worden bereid en in het donker worden bewaard tot gebruik.

Wanneer de SDS-gel klaar is, wordt de gel voorzichtig van de glasplaten verwijderd en overgebracht naar een kleurbak gevuld met Milli Q water. Plaats de bak met de gel op een horizontale schudmachine en schud gedurende 10 minuten.

Herhaal de wasbeurt nog twee keer gedurende ongeveer vijf tot 10 minuten. Gebruik hiervoor vers milli-Q-water; het is belangrijk om de gel grondig te wassen, omdat resterend SDS op de gel de binding van de kleurstof aan het eiwit kan verstoren en kan leiden tot een geringe gevoeligheid. Giet na de derde wasbeurt het water uit het bakje.

De gel is nu klaar om gekleurd te worden. Schud eerst de Kumasi-oplossing om de colloïdale deeltjes gelijkmatig te verspreiden. Voeg vervolgens voldoende oplossing toe om de gel volledig te bedekken.

Plaats de schaal met de Coomassie-oplossing afgedekt. Zet de gel op een schudmachine en schud gedurende twee tot 12 uur. Na 10 minuten zullen de eerste eiwitvlekken verschijnen.

Tussen de 80 en honderd procent van de kleuring kan worden bereikt binnen twee uur incubatie. We raden echter een incubatie overnacht aan om een kleuring van bijna 100% te bereiken. Wanneer de kleuring voltooid is, wordt de Kamasi-oplossing verwijderd en de gel twee keer gespoeld met Milli Q-water.

Spoel de gel na en verwijder kleurende kleurstofdeeltjes uit de kleurbak met een pluisvrije papieren handdoek. Voeg ontkleuringsoplossing toe aan de gel en ontkleur gedurende 10 tot 60 minuten op de schudmachine. Spoel de gel tot slot twee keer na met Milli Q water.

De gel zal zijn oorspronkelijke dikte herstellen en de kleurintensiteit van de kumasi-kleuring zal eveneens toenemen. Wanneer u dit protocol volgt, moet uw 2D-gel duidelijk opgelost zijn en goed gekleurd zijn met donkerblauwe eiwitspots. Het resultaat van onze kumasi-kleuring van 2D-gels is vergelijkbaar met dat van zilverkleuring.

Volgens het protocol van Chef Chenko et al, waarvan is gerapporteerd dat het een hoge gevoeligheid heeft en compatibel is met massaspectrometrie. Aan de hand van het voorbeeld van tweedimensionale gelelektroforese hebben we zojuist aangetoond hoe snel, eenvoudig en gevoelig kangs cooma-kleuring is. Om eiwitten in po-acrylamidegelen te detecteren, kan de kleuring binnen twee uur worden voltooid.

De procedure zelf vereist weinig arbeid. En tot slot kan het zijn dat u hoeveelheden tot een nanogram proteïne kunt detecteren. Dit protocol is dus zeker een goed alternatief voor de labelvrije methoden van gel-gebaseerde proteomics.

Bij het gebruik van deze procedure is het belangrijk om chemicaliën van analytische zuiverheid en water van de hoogste zuiverheid te gebruiken. Bovendien is de opeenvolgende toevoeging van de componenten aan de kleuringsoplossing een kritische stap bij de bereiding. Vergeet tot slot niet om het resterende SDS efficiënt uit de gels te wassen na de elektroforetische scheiding.

Anders ziet u niets op uw gels. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.