Name: Snelle en gevoelige colloïdaal Coomassie G-250 Kleuring voor Eiwitten in polyacrylamidegels (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-03T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Leer een gemodificeerde colloïdale Coomassie G-250 kleuringsmethode voor snelle detectie van nanogram hoeveelheden eiwitten in polyacrylamidegels. Deze efficiënte protocol verbetert de workflow in gel-gebaseerde proteomics.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken dr. Nicola Wiethölter voor de voorbereiding en kleuring van een D-gels. Dit werk werd gefinancierd door een subsidie ​​van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (GRK 1089/project 5 tot ND en SM) en ondersteund door een onderzoeksbeurs van de Jürgen Manchot Stiftung te ND.

Deel 1: Twee-dimensionale (2-D) gelelektroforese met cup-loading <ol><li> IPG-strip rehydratie en iso-elektrische focussering (IEF) <ul><li> Hydrateren Immobiline DryStrip gels, pH 6-11 (7 cm) in 125 ul rehydration solution [7 M ureum, 2 M thio, 4% CHAPS, 50 mM hydroxyethyldisulfide en 2% IPG Buffer pH 6-11] met behulp van Immobiline DryStrip Reswelling Lade voor ten minste 10 uur. </li><li> Los neergeslagen eiwitmonster in IEF monsterbuffer [7 M ureum, 2 M thio, 2% CHAPS, 2% ASB-14, 50 mM hydroxyethyldisulfide en 2% IPG Buffer pH 6-11] die overeenkomt met 60-100 ug eiwit per 100 ul . </li><li> Na solubilisatie (ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur), van toepassing eiwitmonster via anodische cup-laden met sample cups. Het volume van de beker is 100 pi (Manifold bekers laten tot 150 pi). Opmerking: u kunt laden grotere steekproef in aanmerking nemen indien u een laagspannings-stap aan het begin van de focus protocol en vul de beker, terwijl er nog een vloeistof film in de beker! </li><li> Voer iso-elektrische focussering voor 11,1 KVH in de gradiënt-modus in de Multiphor II Electrophoresis Unit. </li></ul></li><li> Evenwicht en SDS-PAGE <ul><li> Na het IEF, werden de IPG-strips onderworpen aan reductie en alkylering, elke keer 15 minuten op een shaker, met behulp van 1% en 2,5% dithiothreitol joodacetamide respectievelijk equilibratie oplossing [50 mM Tris-HCl/pH 8,8, 6 M ureum, 30% glycerol en 2% SDS]. </li><li> Spoel de geëquilibreerd strips met H 2 O en blot ze op Whatman papier om overtollig equilibratiebuffer te verwijderen. Daarna duik de strips in SDS-running buffer (1x). </li><li> Tweede dimensie is uitgevoerd door SDS-PAGE op een verticale elektroforese systemen met een totale acrylamide concentratie van 12%. Het evenwicht IPG-strips werden geplaatst op de top van de scheidende gels en vastgezet met hete agarose oplossing [0,5% agarose in rijklare buffer met broomfenolblauw]. </li><li> Eiwitten zijn gescheiden voor 2,5 uur, te beginnen bij 80 V gedurende 15 minuten gevolgd door 120 V tot de kleurstof front bereikt de onderkant van de gel cassette. </li></ul></li></ol> Deel 2: Colloidal Coomassie kleuring met CBB G-250 1. Kleuroplossingen Let op: voor de voorbereiding van de kleuring oplossingen, chemicaliën te gebruiken met een hoge kwaliteit, zoals pa (pa) en water van hoge zuiverheid als je van Millipore systemen (Milli-Q water). <table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Coomassie oplossing: </td><td> ad 2000 ml H 2 O </td></tr><tr><td> 0,02% (w / v) </td><td> CBB G-250 </td><td> 0,4 g </td></tr><tr><td> 5% (w / v) </td><td> aluminiumsulfaat-(14-18)-hydraat </td><td> 100 g </td></tr><tr><td> 10% (v / v) </td><td> ethanol (96%) </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> 2% (v / v) </td><td> fosforzuur (85%) </td><td> 47 ml </td></tr></tbody></table> Let op: voor de voorbereiding van de kleuroplossing, de sequentiële toevoeging van de componenten in de volgende volgorde moet worden gehandhaafd: <ol><li> eerst opgelost aluminiumsulfaat in Milli-Q water </li><li> daarna toe te voegen ethanol, homogeniseren, en mix CBB G-250 aan de oplossing </li><li> zoals onlangs als de oplossing volledig is opgelost, voeg fosforzuur (de opname van het zuur aan de alcoholische media laat de Coomassie moleculen aggregaat in hun colloïdale toestand) </li><li> eindelijk vullen met Milli-Q water </li></ol> Let op: de uiteindelijke kleuroplossing heeft een donkere groen-blauwachtige uitstraling en is vol van deeltjes zwemmen rond: <ul><li> Niet filtraat deze oplossing! </li><li> Als u de volgorde van voorbereiding, zou je een meer violet-blauw oplossing die minder gevoelig is. </li></ul><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Ontkleuroplossing: </td><td> ad 2000 ml H 2 O </td></tr><tr><td> 10% (v / v) </td><td> ethanol (96%) </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> 2% (v / v) </td><td> fosforzuur (85%) </td><td> 47 ml </td></tr></tbody></table> 2. Kleuringsprocedure <ul><li> Na de tweede dimensie scheiding, verwijder voorzichtig de gels uit de glasplaten en breng ze in een kleuring schaal gevuld met Milli-Q water. </li><li> Was de gels drie keer met Milli-Q water gedurende 10 minuten op een horizontale shaker (onvoldoende wassen veroorzaakt een slechte gevoeligheid omdat de resterende SDS op de gels verstoort het selectiekader van de kleurstof aan het eiwit). </li><li> Schud de Coomassie-oplossing voor gebruik gelijkmatig verspreiden van de colloïdale deeltjes. </li><li> Incubeer de gels goed bedekt met de Coomassie oplossing door roeren op een shaker voor 2-12 uur. Deze vlekken genereert marginale achtergrond, zodat u kunt zien de vlekken vooruitgang in tussen. Let op: na 10 minuten zie je eerste eiwit plekken verschijnen, binnen 2 uur incubatie ongeveer 80% vlekken tes maximale niveau is voltooid. Voor bijna 100% kleuring, wordt een nacht incubatie aanbevolen. In sommige gevallen, wanneer de hoeveelheid eiwit te worden gemerkt enorm is en de oplossing verandert in een helder blauw, een refresh van de kleuring oplossing nodig is. </li><li> Na de kleuringsprocedure verwijder de Coomassie-oplossing en spoel twee keer de gels met Milli-Q water. Opmerking: u kunt de kleuroplossing hergebruik, zolang deeltjes zijn nog steeds blijven, anders gooi hem (in gedachten houden dat uw laboratorium kan speciale regelgeving voor afvalverwijdering hebben). </li><li> Verwijder plakken kleurstof deeltjes uit de kleuring schotel met een niet-pluizende papieren handdoek en destain voor 10 - 60 minuten. Opmerking: U kunt ook de gels wassen alleen met Milli-Q water, maar we raden alleen voor preparatieve gels omdat er een onregelmatige, zwakke Coomassie film laatst op de gels die zullen ontstaan ​​tijdens het scannen procedure. </li><li> Tenslotte twee keer spoelen de gels met Milli-Q water: de gels hun oorspronkelijke dikte te bereiken (de alcohol-zuur media maakt de gels krimpen) en neutralisatie in het water bovendien verbetert Coomassie de kleur van intensiteit. </li></ul> Deel 3: Representatieve resultaten Als u de beschreven protocol hiervoor krijgt u op uw 2-D gel onderscheidende oplossing en goed gekleurd donkerblauw eiwit vlekken. Zelfs in vergelijking met een 2-D gel gekleurd met zilver volgens Shevchenko et al.. Vijf, een protocol beweert goede gevoeligheid en compatibiliteit met massaspectrometrie, bereiken we gelijk kleuringen. <img src="/files/ftp_upload/1431/fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1: uiteindelijke resultaat van het experiment zoals hierboven beschreven. Kang&#39;s Coomassie protocol (A) voert sterk als de zilverkleuring volgens Shevchenko et al.. (B) bij het ​​opsporen van eiwitten na 2-D gel elektroforese. Deel 4: Tips en trucs <ul><li> Doe een aantal testen kleuringen voor het verwerken van uw eigen monsters. Om onverklaarbare redenen meldden we wel eens dat een eiwit van belang niet met succes zou kunnen worden ontdekt, zelfs wanneer milligram werden toegepast. In dit geval raden wij u aan een aantal verdunningsreeks voor te bereiden om de gevoeligheid te testen. </li><li> Als u een lage in-gel detectie van eiwit (s) in het algemeen, mislukte transfer van het stapelen van de scheiding van gel tijdens de SDS-PAGE zal mogelijk de reden. U kunt controleren voor dergelijke plakkerige eiwitten door het kleuren van de volledige gel met inbegrip van het stapelen gebied. </li><li> Voor een snelle controle van uw iso-elektrische focussering resultaten, kunt u direct vlekken op de IPG-strips, zonder enige verdere tweede dimensie scheiding. </li><li> Af en toe draai de gels tijdens de kleuringsprocedure, zodat ze gelijkmatig in lood van beide kanten (als je de gels onbewogen, de kleurstof maar bindt zich aan een kant van de gel). </li><li> We ervaren dat de opslag van de kleuring oplossing in een donkere fles verhoogt de levensduur van de (in doorzichtige flessen tot 4 maanden). </li><li> Na kleuring en documenteren kunt u de gels te houden in de koelkast gedurende enkele jaren (als u toevoegt zure oplossing die u voorkomen dat besmettingen door schimmels). </li><li> Ontkleuroplossing gel pluggen voor een tryptische digest kan worden versneld door opwarming in een blok verwarming. </li></ul>

<ol><li>Fazekas de St Groth, S., Webster, S. R. G., Datyner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+new+staining+procedures+for+quantitative+estimation+of+proteins+on+electrophoretic+strips%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Two new staining procedures for quantitative estimation of proteins on electrophoretic strips.</a> Biochim. Biophys. Acta. 71, 377-391 (1963).</li>
<li>Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels+including+isoelectric+focusing+gels+with+clear+background+at+nanogram+sensitivity+using+Coomassie+Brilliant+Blue+G-250+and+R-250%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250.</a> Electrophoresis. 9, 255-262 (1988).</li>
<li>Candiano, G., Bruschi, M., Musante, L., Santucci, L., Ghiggeri, G. M., Carnemolla, B., Orecchia, P., Zardi, L., Rigetti, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+Silver%3A+A+very+sensitive+colloidal+Coomassie+G-250+staining+for+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Blue Silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis.</a> Electrophoresis. 25, 1327-1333 (2004).</li>
<li>Kang, D., Gho, S. G., Suh, M., Kang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Sensitive+and+Fast+Protein+Detection+with+Coomassie+Brilliant+Blue+in+Sodium+Dodecyl+Sulfate-Polyacrylamide+Gel+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Bull.+Korean+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Highly Sensitive and Fast Protein Detection with Coomassie Brilliant Blue in Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis.</a> Bull. Korean Chem. Soc. 11, 1511-1512 (2002).</li>
<li>Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+sequencing+of+proteins+silver-stained+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels.</a> Anal. Chem. 68, 850-858 (1996).</li>
</ol>

Innovatieve of gewoon een andere Coomassie protocol? Op dit moment bestaan ​​er verschillende protocollen voor kleuringen met Coomassie Brilliant Blue. De meesten van hen het gevolg zijn van kleine of grote wijzigingen van een van de meest gebruikte protocollen door Neuhoff en collega&#39;s 2. Ook Kang&#39;s protocol op basis van formule Neuhoff&#39;s. Maar is het echt een alternatief Coomassie kleuring methode voor proteomics onderzoek? We zullen foto twee belangrijke kwesties, d...

<table border="1" ><tr><td> Naam van het product </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus Nee. </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Voor IEF en SDS-PAGE: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Immobiline DryStrip gels </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-6001-94 </td><td> Kan zelfs gebruikt worden 2 jaar na vervaldatum. </td></tr><tr><td> Immobiline DryStrip Reswelling Tray </td><td> GE Healthcare </td><td> 80-6371-84 </td><td> Niet schoon met organische oplosmiddelen. Ontworpen voor 7-18 cm IPG-strips. </td></tr><tr><td> Immobiline DryStrip Kit </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1004-30 </td><td> Inclusief een lade, lastang, anode en kathode elektroden, aligner en sample cup bar en proef de cups. </td></tr><tr><td> EPS 3501 XL Power Supply </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1130-05 </td><td> Levert spanning tot 3500 V. </td></tr><tr><td> Multiphor II elektroforeseapparaat </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1018-06 </td><td> Beweegbare elektroden kan IEF in IPG stroken van alle lengte (7-24 cm IPG-strips) </td></tr><tr><td> PerfectBlue gel systeem Twin S </td><td> Peqlab </td><td> 45-1010-C </td><td> SDS-PAGE in 10x10 cm mini-gel-formaat. Gel kamer is voorzien van een koelsysteem. </td></tr><tr><td> Voor colloïdaal Coomassie G-250 kleuring: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> vlekken gerechten met deksels </td><td> VWR </td><td> 216-3412 </td><td> Past voor mini-gels. Stapelbaar op de shaker. </td></tr><tr><td> aluminiumsulfaat-18-hydraat </td><td> Merck </td><td> 1.01102.5000 </td><td> We hebben de beste ervaring met Merck. Alleen beschikbaar in 5 kg pakket. </td></tr><tr><td> orthofosforzuur </td><td> Prolabo </td><td> 20 624.295 </td><td> Verkocht in glazen flessen. </td></tr></table>

snelle en gevoelige colloïdaal coomassie g-250 kleuring voor eiwitten in polyacrylamidegels

Fast and Sensitive Colloidal Coomassie G-250 Staining for Proteins in Polyacrylamide Gels

Coomassie Brilliant Blue (CBB) is een kleurstof gebruikt voor de visualisatie van eiwitten gescheiden door SDS-PAGE, het aanbieden van een eenvoudige procedure kleuren en een hoge kwantificatie. Bovendien is het volledig compatibel met massaspectrometrische eiwit identificatie. Maar ondanks deze voordelen, is het CBB beschouwd worden minder gevoelig dan zilver of fluorescentie kleuringen en dus zelden gebruikt voor de detectie van proteïnen in de analytische gel op basis van proteomics benadering. Diverse verbeteringen van de oorspronkelijke Coomassie protocol 1 zijn gedaan om de gevoeligheid van de CBB te verhogen. Twee belangrijke wijzigingen werden ingevoerd om de detectie van lage-overvloedige eiwitten te verbeteren door het omzetten van de kleurstof moleculen in colloïdale deeltjes: In 1988, Neuhoff en collega&#39;s toegepast 20% methanol en hogere concentraties van ammonium sulfaat in het CBB G 250-gebaseerde kleuroplossing 2, en in 2004 Candiano et al.. opgericht Blue Silver met behulp van CBB G-250 met fosforzuur in de aanwezigheid van ammoniumsulfaat en methanol 3. Toch zijn al deze aanpassingen maar laat een detectie van ongeveer 10 ng eiwit. Een breed fameless protocol voor het colloïdale Coomassie kleuring werd gepubliceerd door Kang et al.. In 2002, waar ze aangepaste colloïdaal CBB Neuhoff&#39;s kleuringsprotocol ten aanzien van de complexvormers stoffen. In plaats van ammoniumsulfaat ze gebruikt aluminiumsulfaat en methanol werd vervangen door de minder toxische ethanol 4. De nieuwe aluminium-gebaseerde vlekken in de studie van Kang&#39;s toonde superieure gevoeligheid die detecteert zo laag als 1 ng / band (fosforylase b) met weinig gevoeligheid variëren afhankelijk van eiwitten. Hier tonen we de toepassing van het protocol Kang&#39;s voor een snelle en gevoelige colloïdale Coomassie kleuring van eiwitten in analytische doeleinden. We illustreren de snelle en gemakkelijke protocol met behulp van twee-dimensionale gels routinematig uitgevoerd in onze werkgroep.

Deze video zal populariseren een colloïdale Coomassie G-250 kleuringsprotocol volgens Kang<em&gt; Et al..</em&gt; Voor de detectie van gemiddeld 4 ng eiwit in gels. De kleuring is binnen twee uur en zonder enige inspanning. We routinematig gebruik van Kang&#39;s protocol voor analytische doeleinden in gel op basis van proteomics.

Snelle en gevoelige colloïdaal Coomassie G-250 Kleuring voor Eiwitten in polyacrylamidegels

Coomassie Brilliant Blue (CBB) is een kleurstof die veel wordt gebruikt voor de visualisatie van eiwitten die zijn gescheiden via SDS-PAGE, en die een eenvoudige kleuringsprocedure biedt en ...

In deze video demonstreren we de kracht van een gemodificeerd Coomassie-kleuringsprotocol voor het detecteren van enkele nanogrammen eiwit in polyacrylamidegels. Aan de hand van het voorbeeld van tweedimensionale gelelektroforese, voorafgaand aan de scheiding in de eerste dimensie, worden geïmmobiliseerde pH-gradiëntstrips gerehydrateerd onder denaturerende buffercondities.Na het overnacht herzwelling van de strips worden de eiwitmonsters aangebracht via anodische cup-loading. Tijdens het focusproces worden de eiwitten gescheiden op basis van hun isoelektrische punten. De scheiding in de tweede dimensie wordt uitgevoerd via SDS-PAGE.De gel wordt vervolgens overgebracht naar een kleurbak en de eiwitten worden aangetoond door kleuring met kolloïdaal Coomassie. Hallo, ik ben Nadine de Bala van het laboratorium van Sabina Meka in het biologisch medisch onderzoekscentrum van de Universiteit van Olor. Vandaag vestig ik uw aandacht op een procedure die volgens collega's van Kangan niet breed bekend is; Coomassie Brilliant Blue is een kleurstof die veelvuldig wordt gebruikt voor de visualisatie van eiwitten na elektroforetische scheidingen, maar waarvan vaak wordt aangenomen dat deze minder geschikt is voor vergelijkende proteomics.Echter biedt cos colloidal kleuring superieure kenmerken met betrekking tot gevoeligheid, kosten en praktische toepasbaarheid. In ons laboratorium gebruiken we het K-kleuringsprotocol voor bijna elke gelgebaseerde applicatie, maar met name in de analytische proteomics om veranderingen in de myocardiale eiwitexpressie te bepalen. Ik zal het gebruik van deze methode demonstreren om myocardiale eiwitten te detecteren in het alkalische pH-bereik van tweedimensionale elektroforesegels.Laten we beginnen. De eerste dimensie van 2D-gelelektroforese is isoelektrische focusering of IEF, waarbij strips met een geïmmobiliseerde pH-gradiënt of IPG-strips worden gebruikt voor deze analyse.Vóór de IEF worden vier IPG-strips individueel gehydrateerd in 125 µL rehydratie-oplossing met gebruik van de IM Mobilly dry strip swelling tray gedurende ten minste 10 uur, waarna de IPG-strips gehydrateerd zijn en gereed voor het aanbrengen van de eiwitmonsters. Met TCA geprecipiteerde eiwitmonsters van vier verschillende hartpreparaten worden opgelost in IEF-monsterbuffer tot een concentratie van 100 µg eiwit per 100 µL. De solubilisatie van de eiwitmonsters duurt ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur op een vortex.Bereid ondertussen de aanvullende componenten van de IM Molene dry strip-kit voor om IEF uit te voeren in de multi four elektroforese-unit. Stel eerst de temperatuur van de koelunit in op 20 °C, pipetteer drie tot vier milliliters dekvloeistof op de koelplaat en plaats het Immobilien dry strip-plateau hierop met de rode elektrode-aansluiting in de richting van de anode. Giet ongeveer 10 milliliters dekolie in het Immobilien dry strip-plateau en plaats de Immobilien dry strip-uitlijner met de groefzijde naar boven op het met olie bedekte plateau.Verwijder vervolgens de gehydrateerde strip uit het zwelbakje en breng deze met de gelzijde naar boven over naar de groeven van de uitlijner. Het zure uiteinde van de strip moet naar de anode zijn gericht. Aan het einde moeten alle strips met hun anodische randen zijn uitgelijnd.Plaats met gedestilleerd water verzadigde elektrodestrips zijdelings over de uiteinden van de gelstrips, waarbij u ervoor zorgt dat de elektrodestrips het geloppervlak ten minste gedeeltelijk raken. Positioneer tot slot de elektroden op de elektrodestrips, zodat de gekleurde markering naar het overeenkomstige elektronische contact is gericht. Plaats de houder voor de monsterbekers nabij de anode bij het immobilien droge stripblad en plaats een monsterbeker boven elke IPG-strip.Druk de monsterbekers voorzichtig naar beneden om een goed contact met de IPG-strip te waarborgen. Giet 70 tot 80 milliliters dekolie in de tray om de IPG-strips te bedekken. Er mag geen olie in de monsterbekers lekken.Als er olie in de cup lekt, verwijder deze dan met een pipet en stel de cups opnieuw af. Voeg ten slotte ongeveer 150 milliliter dekolie toe om de monstercups volledig te bedekken. Breng nu de eiwitmonsters aan in de monstercups door te pipetteren onder het oppervlak van de dekvloeistof.Het volume van het cupje is 100 µL. Zodra alle eiwitmonsters zijn aangebracht, worden alle leads aangesloten. Sluit de multi four unit aan op de stroomvoorziening en voer isoelektrische focussering uit gedurende 11,1 kV uren in gradiusmodus; na de IEF worden de IPG-strips met de gelzijde naar boven in een tray geplaatst en ondergaan ze reductie en alkylering tijdens de equilibratie.Gebruik voor de reductie 2,5 milliliters van 1% DTT-equilibratie-oplossing per strip. Schud daarna 15 minuten en vervang vervolgens de DTT-oplossing volledig om de strips te alkyleren in 2,5% iodoacetamide-equilibratie-oplossing onder schudden gedurende nog eens 15 minuten. Spoel de geëquilibreerde strips één keer in een met water gevulde beker en dep ze op filterpapier om overtollige equilibratiebuffer te verwijderen.Breng vervolgens de strips over naar één XSDS-runbuffer. De eiwitten in de strips zijn nu klaar voor de tweede dimensie van de 2D-gelelektroforese. De tweede dimensie wordt uitgevoerd middels SDS-PAGE op een verticaal elektroforesesysteem.Een 적vaardig aantal 12% acrylamidegels met een dikte van één millimeter wordt één dag voor gebruik gegoten en afgedekt met nat papier bewaard. Bij kamertemperatuur worden de geëquilibreerde IPG-strips bovenop de scheidingsgels geplaatst en vastgezet met warme agarose-oplossing. De eiwitten worden gedurende 2,5 uur gescheiden, beginnend bij 80 volt gedurende 15 minuten, gevolgd door 120 volt totdat het kleurfront de onderkant van de gelcassette bereikt.Terwijl de eiwitten worden gescheiden via SDS-PAGE, bereidt u de oplossingen voor de collïdaal kumasi-kleuring van de gel voor. Bij het maken van de kleuringsoplossing is het zeer belangrijk om de componenten in de volgende volgorde sequentieel toe te voegen. Los eerst 100 gram aluminiumsulfaat op in ongeveer 1,5 liter Milli-Q-water in een bekerglas en roer dit door. Nadat het aluminiumsulfaat is opgelost, mengt u 200 milliliter ethanol erdoorheen en voegt u 0,4 gram CBG two 50 toe aan de oplossing.Zodra de CBB G two 50 volledig is opgelost, voegt u 47 milliliters orthofosforzuur toe. Deze stap stelt de kamasi-moleculen in staat om te aggregeren tot hun colloïdale toestand. Voeg tot slot milli Q water toe tot een eindvolume van twee liters.De uiteindelijke rustoplossing zal zwevende deeltjes bevatten. Filtreer deze oplossing niet. De kleuringsoplossing kan ook vooraf worden bereid en in het donker worden bewaard tot gebruik.Wanneer de SDS-gel klaar is, wordt de gel voorzichtig van de glasplaten verwijderd en overgebracht naar een kleurbak gevuld met Milli Q water. Plaats de bak met de gel op een horizontale schudmachine en schud gedurende 10 minuten.Herhaal de wasbeurt nog twee keer gedurende ongeveer vijf tot 10 minuten. Gebruik hiervoor vers milli-Q-water; het is belangrijk om de gel grondig te wassen, omdat resterend SDS op de gel de binding van de kleurstof aan het eiwit kan verstoren en kan leiden tot een geringe gevoeligheid. Giet na de derde wasbeurt het water uit het bakje.De gel is nu klaar om gekleurd te worden. Schud eerst de Kumasi-oplossing om de colloïdale deeltjes gelijkmatig te verspreiden. Voeg vervolgens voldoende oplossing toe om de gel volledig te bedekken.Plaats de schaal met de Coomassie-oplossing afgedekt. Zet de gel op een schudmachine en schud gedurende twee tot 12 uur. Na 10 minuten zullen de eerste eiwitvlekken verschijnen.Tussen de 80 en honderd procent van de kleuring kan worden bereikt binnen twee uur incubatie. We raden echter een incubatie overnacht aan om een kleuring van bijna 100% te bereiken. Wanneer de kleuring voltooid is, wordt de Kamasi-oplossing verwijderd en de gel twee keer gespoeld met Milli Q-water.Spoel de gel na en verwijder kleurende kleurstofdeeltjes uit de kleurbak met een pluisvrije papieren handdoek. Voeg ontkleuringsoplossing toe aan de gel en ontkleur gedurende 10 tot 60 minuten op de schudmachine. Spoel de gel tot slot twee keer na met Milli Q water.De gel zal zijn oorspronkelijke dikte herstellen en de kleurintensiteit van de kumasi-kleuring zal eveneens toenemen. Wanneer u dit protocol volgt, moet uw 2D-gel duidelijk opgelost zijn en goed gekleurd zijn met donkerblauwe eiwitspots. Het resultaat van onze kumasi-kleuring van 2D-gels is vergelijkbaar met dat van zilverkleuring.Volgens het protocol van Chef Chenko et al, waarvan is gerapporteerd dat het een hoge gevoeligheid heeft en compatibel is met massaspectrometrie. Aan de hand van het voorbeeld van tweedimensionale gelelektroforese hebben we zojuist aangetoond hoe snel, eenvoudig en gevoelig kangs cooma-kleuring is. Om eiwitten in po-acrylamidegelen te detecteren, kan de kleuring binnen twee uur worden voltooid.De procedure zelf vereist weinig arbeid. En tot slot kan het zijn dat u hoeveelheden tot een nanogram proteïne kunt detecteren. Dit protocol is dus zeker een goed alternatief voor de labelvrije methoden van gel-gebaseerde proteomics.Bij het gebruik van deze procedure is het belangrijk om chemicaliën van analytische zuiverheid en water van de hoogste zuiverheid te gebruiken. Bovendien is de opeenvolgende toevoeging van de componenten aan de kleuringsoplossing een kritische stap bij de bereiding. Vergeet tot slot niet om het resterende SDS efficiënt uit de gels te wassen na de elektroforetische scheiding.Anders ziet u niets op uw gels. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

fast-sensitive-colloidal-coomassie-g-250-staining-for-proteins

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Na de scheiding door elektroforetische methoden, kunnen eiwitten in een gel worden gedetecteerd door verschillende kleuren methoden. Kleuring van eiwitten met Coomassie Blauw, Zilver kleuring, SYPRO Orange, SYPRO Ruby worden gedemonstreerd in deze video.

Kleuring Eiwitten in Gels

Een kort protocol voor eiwitkleuring met Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels wordt beschreven zonder gebruik te maken van organische oplosmiddelen of azijnzuur als in de klassieke kleuren procedures met CBB.

Kleuring van eiwitten in Gels met Coomassie G-250 zonder organisch oplosmiddel en azijnzuur

In deze video, beschrijven we de karakterisering van multiprotein complexen (MPL), door blauwe inheemse polyacrylamide gel elektroforese (BN-PAGE). In een eerste dimensie, worden gedialyseerd cellulaire lysaten gescheiden door BN-PAGE om individuele Mediterrane partnerlanden te identificeren. In een tweede dimensie SDS-PAGE, zijn mediterrane partnerlanden van belang verder onderverdeeld naar hun kiezers te analyseren door immunoblotting.

Blauwe Inheemse polyacrylamidegelelektroforese (BN-PAGE) voor de Analyse van multiprotein complexen van Cellular Lysaten

In this video, we demonstrate a silver staining method of polyacrylamide gels for the visualization of total protein by using fluorogenic probes.

Fluorescent Silver Staining: A Technique to Visualize Total Protein in Polyacrylamide Gels

This video demonstrates a denaturing polyacrylamide-based separation technique for proteins. This technique helps in the preliminary identification of proteins based on their molecular weights.

Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis for Protein Analysis: A Technique to Separate and Visualize Proteins Based on Molecular Weight

In this video, we demonstrate a two-dimensional gel electrophoresis method that separates individual proteins from a complex protein mixture obtained from tumor tissues of human nonfunctional pituitary adenoma (NFPA). The proteins are separated based on their electric charge in the first dimension and further separated based on molecular weights in the second dimension.

Two-Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis: A Separation Technique for Analysis of Proteins in Complex Protein Mixture Based on Charge and Molecular Weight

Hier presenteren we een twee-dimensionale gelelektroforese (2DE) dat is gekoppeld aan massaspectrometrie (MS) te scheiden en te identificeren menselijke hypofyse adenoom weefsel Proteoom, waarin een goede en reproduceerbare 2DE patroon. Veel eiwitten worden bij elke 2DE plek waargenomen bij het analyseren van complexe kanker Proteoom met het gebruik van hoog-gevoeligheids MS.

Twee-dimensionale gelelektroforese gekoppeld aan massaspectrometrie methoden voor een analyse van menselijke hypofyse adenoom weefsel Proteoom

Wij rapporteren hier een eenvoudige en goedkope silver kleuring protocol dat vereist slechts drie reagentia en 7 min van verwerking, en is geschikt voor snelle generatie voor kwalitatief hoogwaardige SSR data in de genetische analyse.

Een snel zilver kleuring Protocol inschakelen eenvoudig en efficiënte detectie van SSR markeringen met behulp van een niet-denaturering Polyacrylamide-Gel

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol waarin een nieuwe TL kleuring techniek voor de detectie van de totale proteïne in polyacrylamide gels. Het protocol maakt gebruik van een zilveren ion-specifieke fluorescentie turn-on sonde, die Ag+detecteert-eiwitcomplexen, en elimineert bepaalde beperkingen van traditionele chromogenic zilveren vlekken.

Fluorescerende zilveren kleuring van eiwitten in Polyacrylamide Gels

Om de beperkingen van klassieke site-directed mutagenese te overwinnen, werden proline analogen met specifieke modificaties opgenomen in verschillende fluorescerende eiwitten. We laten zien hoe de vervanging van waterstof door fluor of van de enkele door dubbele bindingen in prolineresiduen ("moleculaire chirurgie") fundamentele eiwiteigenschappen beïnvloedt, inclusief hun vouwing en interactie met licht.

Residu-specifieke uitwisseling van Proline door Proline-analogen in fluorescerende eiwitten: hoe "moleculaire chirurgie" van de ruggengraat de vouwing en stabiliteit beïnvloedt

Dit protocol beschrijft een techniek voor de analyse van respiratoire supercomplexen wanneer slechts kleine hoeveelheden monsters beschikbaar zijn.

Isolatie van mitochondriën voor mitochondriale supercomplexanalyse uit kleine weefsel- en celcultuurmonsters 

Leer een gemodificeerde colloïdale Coomassie G-250 kleuringsmethode voor snelle detectie van nanogram hoeveelheden eiwitten in polyacrylamidegels. Deze efficiënte protocol verbetert de workflow in gel-gebaseerde proteomics.

Snelle en gevoelige colloïdaal Coomassie G-250 Kleuring voor Eiwitten in polyacrylamidegels

Meer video's verkennen