Het verkrijgen van hoge kwaliteit-RNA van Single celpopulaties in Human postmortaal hersenweefsel

Deze procedure begint met het snijden van weefselblokken, die zijn ingevroren in vloeibare stikstofdamp, in coupes van 8 µm met een cryostaat ingesteld op -17 °C op onbehandelde, ongechargeerde glazen objectglazen. Vervolgens worden de coupes gekleurd met de histo gene staining kit. Na het identificeren van de piramidale neuronen worden ongeveer 500 cellen via laser-capture microscopy overgebracht naar de HS capture cap.

De dop met cellen wordt ondersteboven geplaatst in een microcentrifugebuis met 50 µL extractiebuffer, die vervolgens in een Falcon-buis wordt geplaatst die vooraf in ijs is gezet, en daarna in een waterbad bij 42 °C. Na een korte centrifugatiestap wordt de dop verwijderd. De resterende oplossing is vervolgens klaar voor RNA-isolatie.

Hoi, ik ben Charmaine Peterson van het laboratorium van Wilson Wu van de afdeling Structurele en Moleculaire Neurowetenschappen van het McLean Hospital. Vandaag laten we u een procedure zien voor laser capturing van parametaal-neuronen uit postmortem humaan hersenweefsel. Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om differentiële genexpressie in de gyrus cinguli superior en inferior van proefpersonen met schizofrenie te bestuderen met behulp van microarray-technologie.

Laten we beginnen. Hersenweefsels werden verkregen van het Harvard Brain Tissue Resource Center als in stikstofdamp bevroren blokken voorafgaand aan het maken van weefselcoupes. Om RNA-contaminatie te verminderen is het belangrijk dat alle oppervlakken, inclusief het werkgebied, het snijmes en de objectglazen, worden behandeld met een RNA-decontaminatieoplossing, zoals RNA SAP, en worden afgeveegd met 100% ethanol.

Deze procedure begint met het doorsnijden van in vloeibare stikstofdamp bevroren weefselblokken op een cryostaat die is ingesteld op -17 °C, waarbij de coupes op onbehandelde, ongelaagde glasplaatjes worden geplaatst. De weefselcoupes zijn nu gereed voor de identificatie van piramidale neuronen met behulp van de Histo Gene quick staining kit. Bereid de ethanol-dehydratieserie voor door 25 milliliter van de juiste ethanolconcentraties en RNA-vrij water in de kleurpotten te gieten die bij de Histo Gene kit zijn geleverd.

Plaats alle potten in een ijsemmer, behalve één pot met 75%ethanol. Plaats die pot met 75%ethanol in de vriezer bij -20 °C. Bereid vervolgens de kleuringsoplossing voor door één µL RNAse-inhibitor per 100 µL kleuringsoplossing toe te voegen.

Aangezien we vier weefselcoupes op twee objectglazen zullen kleuren, wordt 4 µL RNA-inhibitor toegevoegd aan 400 µL van de kleuringsoplossing in een microcentrifugebuisje. Bewaar de kleuringsoplossing op ijs. Werk in een zuurkast.

Voeg moleculaire zeven toe aan de xyleenpot om overtollig water te verwijderen, wat de weefseldetachering zou kunnen beïnvloeden. Zet het waterbad aan met de temperatuur ingesteld op 42 °C en plaats een Falcon-buis van 50 mL, ondersteund door een rek, in het waterbad. Haal twee objectglazen uit de vriezer van -80 °C en ontdooi deze op een Kim wipe.

Fixeer het weefsel gedurende ongeveer 30 seconden, of net totdat de hoeken van de coupes beginnen te ontdooien, kortstondig in 75% ethanol gedurende 30 seconden in de vriezer op -20 °C. Verplaats de coupes vervolgens met RNA-vrije pincetten naar nucleasevrij water voor een tweede wasbeurt. Omtrek de secties na het wassen met een PAP-barrièrepen om de kleuringsoplossing op de sectie te concentreren en kleur de vier secties gedurende 20 seconden met de histo gene kleuringsoplossing. Dehydrateer de secties met 97 µL van de kleurstof/RNAse-inhibitor per sectie in de eerder bereide ethanol op ijs gedurende 30 seconden per stap.

De laatste stap met 100% ethanol moet worden verlengd tot drie minuten om voldoende dehydratatie te bereiken voor een adequate weefseluplift. Dompel de slides vervolgens vijf minuten onder in xyleen en laat de slides volledig aan de lucht drogen voordat men overgaat tot laser capture microdissectie; de piramidale neuronen moeten onmiddellijk na de kleuring worden verwijderd voor de procedure voor single cell laser capture MICRODISSECTION of LCM, waarvoor een waterbad van 42 °C is vereist met daarin een Falcon-buis van 50 ml die door een houder wordt ondersteund, welke eerder is klaargezet.

Single-cell LCM wordt uitgevoerd met het ARCTURUS XT laser capturing-systeem en de bijbehorende software. Om deze procedure te starten, worden de slides en dopjes in het ARCTURUS XT-apparaat geplaatst. Gebruik de capture HS-dopjes, maar houd de programmainstelling op macro.

Klik op het vak 'load with overview' om een overzichtsfoto van elke slide te verkrijgen. Pas de helderheid en focus bij een vergroting van twee x aan om het optimale gedeelte voor laser capture te bepalen. Vermijd weefselsecties met overmatige plooien en kies secties die intact, glad en gekleurd zijn.

Plaats een dop over het algemene gebied dat u wilt vastleggen, waarbij u er zeker van bent dat het te vastleggen gebied in ons geval, laag drie van de cortex, is inbegrepen. Zorg ervoor dat de geleiders van de dop niet op plooien rusten, omdat dit de dop zal doen kantelen, wat resulteert in variabele vlekgroottes.

Bevestig vervolgens handmatig de locatie van de IR-laser spot bij een 40 x vergroting. Het blauwe kruis moet in het midden van de IR-laser spot staan. Indien dit niet het geval is, pas dan de locatie aan door met de rechtermuisknop op de spot te klikken en 'located IR spot' te selecteren.

Identificeer bij een 40x vergroting piramidale neuronen aan de hand van de volgende criteria: één, de cellen zijn piramidaal van vorm en twee, het proximale gedeelte van de apicale en/of basale dendrieten is identificeerbaar. Sla de positie van de cap op door op het plusteken bij de positiefunctie te klikken. Op deze manier keert de cap, indien verplaatst, altijd precies terug naar de plek waarvoor u de spotgrootte heeft ingesteld.

Voer deze waarden in het controlevenster in: 70 bij power en 16 bij duration. Aangezien deze parameters specifiek zijn voor ons weefsel, raden we aan dat u deze variabelen test en aanpast aan uw specifieke weefselmonster voordat u begint. Deselecteer bij de laser-capturing van enkelvoudige cellen de optie auto move stage en zorg ervoor dat het juiste grootte-symbool overeenkomt met het symbool op het paneel aan de rechterkant.

Selecteer de cirkeloptie rechtsonder om een neuron te selecteren waarvan u de capture wilt testen. Nadat u het blauwe kruis op de cirkel heeft uitgelijnd, activeert u de laser door op 'test IR spot' te klikken. De door de laser gemaakte spot moet in eerste instantie een scherpe donkere ring rond het gevangen object vertonen.

Zorg ervoor dat de ring groot genoeg is om de cel te omvatten, maar klein genoeg zodat ongewenst weefsel of andere cellen niet worden meegenomen. Als deze ring te licht is, is de cel niet gevangen. Als er een donkere plek in het midden van de donkere ring staat, dan is de lasersterkte of -duur te groot.

Herhaal dit proces op verschillende delen van het weefsel binnen de laag die u wilt vastleggen. Pas de instellingen indien nodig aan om te controleren of de vlekgrootte niet varieert afhankelijk van de locatie. Identificeer ongeveer 500 piramidale neuronen voor opname.

Druk op de knop voor laser capture om de cellen te vangen. Verplaats de cap naar het QC-station. Controleer of er minstens 90% van de neuronen is verwijderd.

Indien dit niet het geval is, vang dan meer cellen op in het gebied waar de meeste cellen zijn gevangen. Plaats de dop in een microcentrifugebuis van 0,5 milliliter met 50 microliters extractiebuffer. De dop is zo ontworpen dat deze perfect sluit om lekkage van de buffer te voorkomen.

Keer de assemblage om, waarbij u ervoor zorgt dat de extractiebuffer de gehele dop bedekt, en plaats deze onderin de 50 milliliter Falcon-buis in het waterbad dat is ingesteld op 42 °C. Incubeer de neuronen gedurende 30 minuten om het weefsel van de dop te verwijderen; centrifugeer na de incubatie de buis en de dopassemblage gedurende twee minuten bij 800 ×g. Verwijder na de centrifugatie de dop.

Indien de RNA-isolatie pas op een later tijdstip zal worden uitgevoerd, dient het resterende celextract bij min 80 graden Celsius te worden bewaard. Ga anders verder met het isoleren van RNA uit het celextract zoals beschreven in de volgende sectie; de RNA-isolatie wordt uitgevoerd met de PICO pure isolation kit, die is ontworpen voor het isoleren van kleine aantallen cellen uit LCM-monsters en het behouden van mRNA met een lage abundantie.

Om deze procedure te starten, voegt u de bij de kit geleverde 70% ethanol toe aan het celextract en centrifugeert u dit op een geconditioneerde zuiveringskolom. Om het RNA aan het kolomfilter te binden na het wassen, behandelt u het RNA met DNase om het risico op DNA-interferentie te elimineren. Deze stap is bijzonder belangrijk voor downstream-applicaties zoals real-time RT-PCR.

Voeg na de DNA-digestie 40 µL wasbuffer één toe en centrifugeer de zuiveringskolom gedurende 15 seconden bij 8.000 G. Voer daarna de wasstappen uit volgens het protocol van de kit, maar verleng de laatste wasstap met wasbuffer twee van twee naar tweeënhalve minuut om ervoor te zorgen dat er geen wasbuffer in de kolom achterblijft, aangezien dit de RNA-opbrengst kan verlagen. Verplaats de kolom naar een andere microcentrifugebuis. Voeg de elutiebuffer toe en laat deze één minuut incuberen op het filter in de kolom; centrifugeer de kolom vervolgens om het RNA te elueren.

Controleer ten slotte de kwaliteit van het geëxtraheerde RNA door een Experian High Sense lab-chip uit te voeren, die een virtuele gel en elektroferogram verschaft; pipetteer 1,3 µL van de monsteroplossing in een 0,5 mL buisje. Bevries voor de kwaliteitscontrole de rest van het monster bij -80 °C. Zodra de kwaliteit van het RNA is geverifieerd, kan het worden geamplificeerd, gelabeld en gehybridiseerd.

Voor de analyse van genexpressieprofilering worden twee ronden lineaire amplificatie uitgevoerd met de ribo amp HS plus kit, wat zou moeten resulteren in ongeveer 50 micrograms geamplificeerd RNA, wat voldoende is voor het uitvoeren van zowel microarray- als Q-R-T-P-C-R-experimenten. De turbo biotin labeling kit en labeling van molecular devices worden gebruikt om het geamplificeerde RNA te labelen. Ten slotte wordt genexpressieprofilering uitgevoerd met de human X drie P gene chip pro beret van atrix.

Het snijden van weefselcoupes moet resulteren in twee objectglaasjes met twee coupes per glaasje, in totaal vier coupes per casus. Elke coupe moet glad zijn met minimale scheuren, barsten of vouwen. De piramidecellen moeten donker gekleurd zijn, ongeveer 20 tot 25 µm groot, met een piramidale vorm en zichtbare apicale dendrieten.

Tijdens LCM, nadat de laser door de thermoplastische folie is gepulst, hechten de cellen zich aan de dop en bevinden ze zich daarom niet meer op de objectglas, waardoor het omliggende weefsel achterblijft. Bij gebruik van capture HS-doppen met macro-instellingen en een correcte afstelling van de laserkracht en -intensiteit, zouden ongeveer 85 tot 100% van de neuronen zich aan de dop moeten hechten. Voor elke sectie zou men ongeveer 500 tot 700 cellen per sectie moeten verkrijgen, wat resulteert in ten minste 500 picograms totaal RNA per casus.

Na de isolatie van totaal RNA wordt de RNA-kwaliteit geëvalueerd aan de hand van een elektroferogram en een virtuele gel via de BioRad Experian. In het elektroferogram zouden twee duidelijk onderscheidbare pieken zichtbaar moeten zijn die overeenkomen met de 18 s en 20 a s ribosomaal RNA-eenheden bij postmortem weefsel. Dit is echter niet altijd het geval, aangezien het weefsel gedegradeerd kan zijn door factoren voorafgaand aan het snijden.

Normaal gesproken ziet u een grote bult die duidt op degradatie, met een grote piek rond 18 s en een kleinere 28 s piek, zoals aangegeven door de rode pijlen. Daarentegen wordt RNA van slechte kwaliteit met te veel degradatie aangegeven door een elektroferogram met een groot oppervlak onder de curve. Naast een verschuiving naar beneden in de locatie van de spreiding om de kwaliteit van het mRNA na twee ronden lineaire amplificatie te testen, gebruiken we zowel de BioRad Experian standaard Sense lab chip als de NanoDrop spectrofotometer.

Traditionele Atrics microarray-technologie vereist dat de mRNA-transcripspread een lengte van ten minste 600 nucleotiden heeft om met dit protocol gedetecteerd te kunnen worden. De mRNA-spread bereikte het bereik van 1000 nucleotiden, zoals aangegeven door het electroferogram met grote pieken die langzaam afnamen als functie van de tijd. Dit resultaat wordt ook bevestigd door de virtuele gel.

Als de transcriptlengtes korter zijn dan 600 nucleotiden, mag het monster niet worden meegenomen voor hybridisatie. De NanoDrop-metingen gaven een gemiddelde 260/280-ratio of zuiverheid van 2,5 aan over de monsters. De gemiddelde concentratie was 1,7 µg/µL, wat resulteerde in ongeveer 50 µg mRNA per monster, wat voldoende is voor zowel microarray-analyse als de daaropvolgende validatie, waarvoor tussen de 15 en 20 µg mRNA nodig is, en de daaropvolgende validatie van de resultaten met QR-TPCR. Onze resultaten tonen aan dat met dit protocol zowel de kwantiteit als de kwaliteit van het verkregen RNA voldoende is om genexpressieverschillen te onderzoeken via de atrix human X3P-chip.

Na hybridisatie met de Atrics Human X three P-chip bereikten we een gemiddelde percentage calls van 26,6%, wat wijst op een adequate hybridisatie en sonde-intensiteiten. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe parametaal neuronen via laser capture kunnen worden geïsoleerd uit postmortem menselijk hersenweefsel om het uit deze cellen verkregen RNA te kunnen gebruiken. Bij het uitvoeren van deze procedure voor microarray-G-profileringsstudies is het van essentieel belang om alle stappen in een RNAse-vrije omgeving uit te voeren en de stappen tijdig te voltooien om de integriteit van het RNA te waarborgen.

Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.