Global analyse van genexpressie met behulp van een zebravis oligonucleotide microarray platform
August 10th, 2009
Gen microarrays zijn krachtige tools in gen expressie profilering bij een genoom-brede niveau. Deze technologie heeft toepassing in een verscheidenheid van biologische disciplines, waaronder ontwikkelingsbiologie en toxicologie. In deze video, we detail een protocol voor de wereldwijde genexpressie analyse met behulp van een uitgebreid oligonucleotide microarray platform voor de zebravis.
Deze procedure begint met CDNA dat is gesynthetiseerd uit een sjabloon van hoogwaardig RNA. De CDNA wordt eerst gelabeld met de fluorescerende kleurstof SI drie. Na voltooiing van de labelreactie wordt de gelabelde CDNA gezuiverd, geïsoleerd en wordt de kwaliteit van de labelreactie beoordeeld.
De gelabelde CDNA wordt vervolgens gehybridiseerd op een microarray. Na hybridisatie worden de arrays geanalyseerd om relatieve niveaus van genexpressie in de monsters te bepalen. Hallo, mijn naam is Sam Peterson van het laboratorium van Dr. Jennifer Freeman in de School of Health Sciences aan Purdue University.
Eerder hebben we u laten zien hoe u RNA uit zebravis-embryo's kunt extraheren en dat RNA kunt omzetten in CDNA. Vandaag laten we u de procedure zien voor het labelen en hybridiseren van die CDNA op een zebravis, oligo nucleotide microarray platform om wereldwijde genexpressieprofielen te bestuderen. Meestal gebruiken we deze procedure om differentiële genexpressie te bestuderen als reactie op een blootstelling aan een toxine.
Dus laten we beginnen. Het microarray-experiment vereist een minimale lichtomgeving om fotodegradatie van de fluorescerende kleurstof SI drie te voorkomen die wordt gebruikt bij het labelen om te beginnen met het labelen van de CD NA met sci drie haw de volgende componenten van het Bio Prime Array CGH genomisch labelsysteem 2,5 x willekeurige primer buffer, 10 X-D-C-T-P mix en nuclease vrij water. Bovendien ontdooi de één millimolare voorraad van de SI drie gelabelde DCTP na ontdooien, centrifugeer kort of reagentia in een nul 0,6 milliliter dikwandige buis gecombineerd.
500 nanogram CDNA 40 microliter, 2,5 x willekeurige primer buffer en nuclease vrij water om een totaal volume van 86 microliter te bereiken. Meng goed en centrifugeer kort, bekijk vervolgens de reactie bij honderd graden Celsius in een thermocycler gedurende vijf minuten. Aan het einde van de incubatie, breng de reactie onmiddellijk over in een ijsbadslurry gedurende 10 minuten.
Vervolgens haalt u de exo DNA polymerase uit de vriezer en plaatst deze op ijs. Voeg vervolgens aan de reactiebuis toe, 10 microliter van de 10 X-D-C-T-P Mix twee microliter van de één millimolare SI 3D CTP en twee microliter van de XO cleanout DNA polymerase goed gemengd en kort gecentrifugeerd. Beëindig de reactie uiteindelijk bij 37 graden Celsius gedurende 16 uur in een thermocycler wanneer de labelreactie klaar is.
Ga door met het opruimen en precipiteren van de gelabelde CDNA. Om te beginnen met het schoonmaken van de gelabelde CDNA. Plaats een MicroCon-kolom in een 1,5 milliliter buis.
Voeg 300 microliters nul 0,1 XSSC toe aan de kolom en voeg vervolgens de labelreactie toe. Centrifugeer de kolom bij 16.100 G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Merk op dat de doorstroming lichtroze kan zijn.
Gooi de doorstroming weg en voeg nog eens 300 microliters van nul 0,1 XSSE toe aan de kolom. Herhaal vervolgens de centrifugatie bij 16.100 G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Gooi opnieuw de doorstroming weg en voeg een extra 300 microliters T 0,1 XSSC toe aan de kolom, centrifugeer nu bij 16.100 G gedurende 12 minuten bij vier graden Celsius na deze laatste wasbeurt.
De doorstroming moet helder zijn en de roze gelabelde CDNA is zichtbaar op de kolom. Gooi opnieuw de doorstroming weg van deze laatste wasbeurt om de gelabelde CD NA te elimineren. Voeg 100 microliter nuclease vrij water toe aan de kolom. Haal de kolom uit de microcentrifugebuis en draai hem om in een nieuwe buis.
Centrifugeer vervolgens de omgekeerde kolom bij 2.300 G gedurende twee minuten bij vier graden Celsius. De gelabelde CDNA is opgelost in het water op de bodem van de buis. Controleer de geïmpliceerde CDNA met behulp van een NanoDrop ND 1000 spectrofotometer volgens de instructies van de fabrikant.
Bereken de DNA-concentratie en evalueer de kleurstofopname zoals beschreven in het bijbehorende schriftelijke protocol. Als de CDNA voldoende is gelabeld, zet u zes microgram in een nieuwe buis om de gelabelde CD NA te precipiteren, meng in naut 0,1 x volume van drie molaire natriumacetaat bij pH 5,2 en een x volume. Isopropanol in het donker gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur incuberen.
Houd in gedachten dat alle stappen tot nu toe in een minimale lichtomgeving zijn uitgevoerd. Centrifugeer vervolgens het monster bij 16.100 G gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Na centrifugatie, gooi voorzichtig de SUP nataant zonder de DNA-pellet te verstoren, die roze is.
Was tenslotte door 500 microliter 70% ethanol toe te voegen en door voorzichtig inversie te centrifugeren gedurende vijf minuten bij 16.100 G. Verwijder bij kamertemperatuur de supinate, draai de buis om en laat de pellet vijf minuten drogen. De gelabelde CDNA is klaar voor hybridisatie.
Voordat u begint met de hybridisatie, zet u het Nimble Gen hybridisatiesysteem aan en laat u het gelijkwaardig worden bij 42 graden Celsius. Begin met het oplossen van de gelabelde CD NA pellet in vijf microliter nuclease vrij water tot de opgeloste pellet. Voeg hybridisatiecomponenten toe vanuit de Roche Nimble Gen Hybridisatiekit Hybridisatie buffer hybrid A en uitlijning oligo tot een totaal volume van 18 microliter zoals beschreven in het bijbehorende schriftelijke protocol.
Meng goed en draai de buis kort om de inhoud op de bodem te verzamelen. Denatureer vervolgens de gelabelde CDNA door de buis gedurende vijf minuten bij 95 graden Celsius te plaatsen. Breng de buis onmiddellijk over naar het Nimble Gen hybridisatiesysteem totdat de arrays klaar zijn.
Let op dat de microarrays zorgvuldig moeten worden behandeld en opgeslagen. Roche Nimble Gen arrays worden in het donker bewaard met droogmiddel bij kamertemperatuur. Laad de array in het Precision Mixer uitlijningsgereedschap.
Laad de PMA T in X een mixer op de PMA T en verwijder de kleefstrook met een pincet. Met de array en mixer geladen, sluit de PMA T veilig. Ontkoppel vervolgens de array en mixer van de PMA T door druk uit te oefenen op de mixer door het
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze video presenteert een protocol voor globale genexpressieanalyse met behulp van een uitgebreid oligonucleotide microarray platform voor zebravissen. Gen-microarrays zijn essentiële hulpmiddelen voor genexpressieprofilering in verschillende biologische disciplines.
Belangrijke onderdeel van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Genexpressieprofilering
- Ontwikkelingsbiologie
- Toxicologie
Achtergrond
- Gen-microarrays maken analyse op genoombreed niveau mogelijk.
- Ze zijn toepasbaar in meerdere biologische onderzoeksgebieden.
- Deze technologie vergroot het begrip van genfunctie.
- Zebravissen dienen als modelorganisme in ontwikkelingsstudies.
Doel van het onderzoek
- Om een protocol voor genexpressieanalyse te demonstreren.
- Om een microarray platform te gebruiken voor uitgebreide profilering.
- Om inzichten te bieden in genexpressie in zebravissen.
Gebruikte methoden
- Synthese van cDNA uit hoogwaardig RNA.
- Labeling van cDNA met fluorescerende kleurstof SI drie.
- Zuivering en kwaliteitsbeoordeling van gelabeld cDNA.
- Hybridisatie van gelabeld cDNA op een microarray.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle labeling en zuivering van cDNA.
- Effectieve hybridisatie op microarrays.
- Analyse van genexpressieniveaus in monsters.
- Inzichten in globale genexpressiepatronen.
Conclusies
- Het protocol maakt uitgebreide genexpressieanalyse mogelijk.
- Microarray technologie is waardevol in verschillende biologische studies.
- Bevindingen dragen bij aan het begrip van genfuncties in zebravissen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Global gene expression analysis using zebrafish oligonucleotide microarrays enables mechanistic de-risking in early discovery by providing genome-wide transcript profiling. This approach supports target validation and phenotypic screening in toxicology and developmental biology applications. The platform delivers quantitative, reproducible data that informs predictive confidence for lead identification and portfolio triage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses through genome-wide expression profiling to clarify pathway involvement and biological mechanisms.
- Operational Value: Enables functional target validation by identifying differentially expressed genes in response to toxicant exposure or disease models.
- Predictive Value: Supports predictive confidence and portfolio triage by revealing mechanistic insights that de-risk target selection.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing baseline expression profiles in zebrafish models.
- Operational Value: Delivers standardized, quantitative outputs with high reproducibility due to robust probe design and normalization controls.
- Screening Readiness: Enables reliable compound evaluation through scalable, platform-reusable workflows compatible with automated hybridization and scanning systems.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery findings to preclinical validation by maintaining disease-relevant expression patterns across model systems.
- Biomarker Alignment: Supports translational biomarker discovery through consistent transcriptomic readouts that correlate with phenotypic outcomes.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by providing expression-based safety and efficacy signals early in the pipeline.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, enabling iterative refinement of biological understanding.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by detecting expression changes across the entire transcriptome in response to perturbations.
- Screening: Ensures assay readiness through standardized labeling, hybridization, and scanning protocols that yield reproducible intensity values.
- Analytics: Generates normalized count data and intensity values that allow statistical comparison of conditions and identification of differentially expressed features.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by preserving zebrafish-specific transcriptomic signatures relevant to human disease pathways.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability across projects due to standardized array design, labeling chemistry, and scanning parameters.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence through mechanistic de-risking and reduction of biological ambiguity in target selection.
- Operational Value: Ensures standardization, reproducibility, and scalability via validated labeling, hybridization, and quality control steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions, capital efficiency, and reduces late-stage biological risk by delivering early expression-based insights.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on genome-wide expression profiles and differential analysis.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology, nucleic acid labeling, and microarray handling to ensure data integrity.
- Depends on specialized instrumentation including thermocylers, microarray hybridization systems, and laser scanners for signal detection.
- Necessitates cross-team standardization of labeling efficiency thresholds, wash protocols, and PMT gain settings for consistent results.
- Involves adaptation considerations when applying the platform to different zebrafish strains, developmental stages, or exposure conditions.
- Includes practical limitations such as light sensitivity of fluorescent dyes and the need for optimized cDNA input and dye incorporation ratios.
