Global analyse van genexpressie met behulp van een zebravis oligonucleotide microarray platform

Deze procedure begint met cDNA dat is gesynthetiseerd uit een template van hoogwaardig RNA. Het cDNA wordt eerst gelabeld met de fluorescerende kleurstof Cy3. Na voltooiing van de labelingsreactie wordt het gelabelde cDNA gezuiverd, geïsoleerd en wordt de kwaliteit van de labelingsreactie beoordeeld.

Het gelabelde cDNA wordt vervolgens gehybridiseerd op een microarray. Na de hybridisatie worden de arrays geanalyseerd om de relatieve niveaus van genexpressie in de monsters te bepalen. Hallo, mijn naam is Sam Peterson van het laboratorium van Dr. Jennifer Freeman aan de School of Health Sciences van Purdue University.

Voorheen hebben we u laten zien hoe u RNA uit zebravisembryo's extraheert en dit RNA omzet in cDNA. Vandaag laten we u de procedure zien voor het labelen en hybridiseren van dat cDNA op een oligonucleotide-microarrayplatform voor zebravis om globale genexpressieprofielen te bestuderen. Gewoonlijk gebruiken we deze procedure om differentiële genexpressie als reactie op blootstelling aan een toxine te bestuderen.

Laten we beginnen. Het microarray-experiment vereist een omgeving met minimale lichtinval om fotodegradatie van de fluorescerende kleurstof Cy3, die wordt gebruikt bij de labeling, te voorkomen. Om de cDNA te labelen met Cy3, worden de volgende componenten van het BioPrime Array CGH Genomic Labeling System gebruikt: 2,5x random primer buffer, 10X dNTP-mix en nucleasevrij water. Ontdooi daarnaast de 1 millimolaire stock van de Cy3-gelabelde dCTP. Centrefugeer de reagentia na het ontdooien kortstondig in een 0,6 milliliter dikwandige buis.

500 nanogram cDNA in 40 µL, 2,5 x random primer buffer en nucleasevrij water om een totaalvolume van 86 µL te bereiken. Meng goed en centrifugeer kort, en incubeer de reactie vervolgens gedurende vijf minuten bij 100 °C in een thermocycler. Breng de reactie aan het einde van de incubatie onmiddellijk 10 minuten over in een ijsbad.

Haal vervolgens de exo DNA-polymerase uit de vriezer en plaats deze op ijs. Voeg daarna aan de reactiebuis 10 µL van de 10 X-D-C-T-P Mix, 2 µL van de 1 mM SI 3D CTP en 2 µL van de XO cleanout DNA-polymerase toe, meng goed en centrifugeer kort. Incubeer de reactie tenslotte gedurende 16 uur bij 37 °C in een thermocycler wanneer de markering is voltooid.

Ga verder met het zuiveren en neerslaan van het gelabelde cDNA. Om te beginnen met het zuiveren van het gelabelde cDNA, plaatst u een MicroCon-kolom in een buisje van 1,5 milliliter.

Voeg 300 µL 0,1 X SSC toe aan de kolom en voeg vervolgens de labelingsreactie toe. Centrifugeer de kolom bij 16.100 ×g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Let erop dat de doorstroom lichtroze kan zijn.

Gooi het doorstroomvolume weg en voeg nog eens 300 µL 0.1 XSSE toe aan de kolom. Herhaal vervolgens de centrifugatie bij 16.100 G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Gooi opnieuw het doorstroomvolume weg en voeg nogmaals 300 µL 0.1 XSSC toe aan de kolom; centrifugeer na deze laatste wasstap bij 16.100 G gedurende 12 minuten bij vier graden Celsius.

De doorloopvloeistof moet helder zijn en het roze gelabelde CDNA moet zichtbaar zijn op de kolom. Gooi de doorloopvloeistof van deze laatste wasstap opnieuw weg om het gelabelde CD NA te elueren. Voeg 100 µL nucleasevrij water toe aan de kolom. Haal de kolom uit de microcentrifugebuis en plaats deze omgekeerd in een nieuwe buis.

Centrifugeer daarna de omgekeerde kolom 2 minuten bij 2.300 G bij vier graden Celsius. Het gelabelde cDNA is opgelost in het water onderin de buis. Controleer het verkregen cDNA met een NanoDrop ND 1000 spectrofotometer volgens de instructies van de fabrikant.

Bereken de DNA-concentratie en evalueer de kleurstofincorporatie zoals beschreven in het bijbehorende schriftelijke protocol. Als het cDNA voldoende gelabeld is, breng dan zes microgram over naar een nieuwe buis om het gelabelde cDNA-mengsel te precipiteren in 0,1 x volume van drie molar natriumacetaat bij pH 5,2 en één x volume isopropanol, waarbij het mengsel 30 minuten in het donker bij kamertemperatuur wordt geïncubeerd.

Houd er rekening mee dat alle stappen tot dit punt in een omgeving met minimale verlichting zijn uitgevoerd. Centrifugeer vervolgens het monster bij 16.100 G gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder na centrifugatie voorzichtig het supernatant zonder de DNA-pellet, die roze is, te verstoren.

Ten slotte gewassen door 500 µL 70% ethanol toe te voegen en te mengen door voorzichtig om te keren, gevolgd door centrifugeren bij 16.100 G gedurende vijf minuten. Verwijder bij kamertemperatuur het supernatant, keer de buis om en laat het pellet vijf minuten drogen. Het gelabelde cDNA is nu klaar voor hybridisatie.

Schakel vóór aanvang van de hybridisatie het nimble gen hybridisatiesysteem in en laat het equilibreren tot 42 °C. Begin met het oplossen van het gelabelde CD NA-pellet in vijf µL nucleasevrij water tot het pellet volledig is opgelost. Voeg de hybridisatiecomponenten van de Roche Nimble Gen Hybridization kit (hybridisatiebuffer hybrid A en alignment-oligo) toe tot een totaalvolume van 18 µL, zoals beschreven in het bijbehorende schriftelijke protocol.

Meng goed en centrifugeer de buis kort om de inhoud onderin te verzamelen. Denatureer vervolgens het gelabelde cDNA door de buis vijf minuten op 95 °C te plaatsen. Plaats de buis onmiddellijk in het NimbleGen-hybridisatiesysteem totdat de arrays gereed zijn.

Let op dat de microarrays zorgvuldige hantering en opslag vereisen. Roche nimble gen arrays worden donker bewaard met een droogmiddel bij kamertemperatuur. Plaats de array in het uitlijningsinstrument van de precisiemixer.

Laad de PMA T in X één mixer op de PMA T en verwijder de plakstrip met een pincet. Sluit de PMA T stevig nadat het array en de mixer zijn geladen. Koppel vervolgens het array en de mixer los van de PMA T door druk uit te oefenen op de mixer via het gat in de PMA t.

Gebruik ten slotte een handroller om druk uit te oefenen rond de buitenkant van de mixer om er zeker van te zijn dat de array is afgesloten en om eventuele luchtbellen te verwijderen. Plaats vervolgens het array-mixercomplex op het hybridisatiesysteem om op te warmen, zodat het cDNA-monster op de array kan worden geladen. Gebruik de verplaatsingspomp langzaam en met een gelijkmatige druk.

Voeg 15 µL van het gelabelde monster toe aan de vulpoort in het midden van de mixer. Veeg eventueel overtollig monster van de poortopeningen en sluit deze af met plakstrips. Sluit vervolgens de vergrendeling.

Start nu met het mengen van de hybridisatie-oplossing met programma B op het NimbleGen-hybridisatiesysteem. Laat de microarray 16 tot 20 uur hybridiseren. Na de hybridisatie zal de microarray worden gewassen en gescand wanneer de hybridisatie bijna voltooid is. Bereid het scannen voor door de GenePix 4000B array-scanner in te schakelen en deze ongeveer 15 minuten voor te verwarmen.

Bereid vervolgens wasbuffers één A, één B, twee en drie voor zoals beschreven in het bijbehorende schriftelijke protocol. Verwarm wasbuffer één A voor tot 42 °C, maar laat de overige buffers op kamertemperatuur. Zodra wasbuffer één A is opgewarmd, wordt deze in een schaal gegoten.

Dompel een objectglasrek onder in wasbuffer één B. Verwijder nu het array-mixcomplex uit het NimbleGen-hybridisatiesysteem en schuif het in de mal. Start het wassen door de assemblage onder te dompelen in de voorverwarmde wasbuffer één A en verwijder voorzichtig de mixer door deze van het objectglas af te pellen. Verwijder vervolgens de array uit de mal en agiteer deze 15 seconden in wasbuffer één A. Breng de array snel over naar een objectglasrek dat is ondergedompeld in wasbuffer één B en agiteer het objectglasrek krachtig gedurende twee minuten.

Breng vervolgens het objectglasrek over naar wasbuffer twee en agiteer gedurende één minuut. Ten slotte brengt u het objectglasrek over naar wasbuffer drie en agiteert u gedurende 15 seconden. Voltooi de wasstappen door de array naar de centrifuge voor het drogen van objectglazen over te brengen en deze na centrifugatie twee minuten te spinnen.

Scan de array onmiddellijk aangezien de D gevoelig is voor licht en ozon. Start het scannen door de array met de barcode naar beneden in de gene picks 4, 000 B array-scanner te laden. Stel in het dialoogvenster voor hardware-instellingen de 532 nanometer laser in op een PMT-waarde van 500, zet het vermogen op 100%, de pixelgrootte op vijf microns, het aantal gemiddelde lijnen op één en de focuspositie op nul microns. Wanneer de configuratie voltooid is, maak dan een voorbeeld van de array.

Kies een gebied om te scannen en scan dit vervolgens. Controleer na voltooiing van het scannen het beeldhistogram. Idealiter moet één E min vijf genormaliseerde counts op de verzadigingslimiet van 65.000 liggen, wat betekent dat ongeveer 1 tot 2% van de kenmerken verzadigd is.

Als de genormaliseerde tellingen minder zijn dan 1 E-5, verhoog dan de PMT-versterking en scan de slide opnieuw. Als de genormaliseerde tellingen groter zijn dan 1 E-5, verlaag dan de PMT-versterking en scan de slide opnieuw, sla het beeld op en gebruik een data-analyseprogramma voor datanormalisatie en het berekenen van de intensiteitswaarden. De labelingsreactie levert routinematig ten minste 10 µg gelabeld cDNA op.

De kleurstofincorporatie kan worden berekend met een eenvoudige basiskleurstofratio, waarbij de ratio nucleotide ten opzichte van SI 3 gelijk is aan de ratio A 260 ten opzichte van A 550 vermenigvuldigd met 23,15. Een goede reactie resulteert in een waarde tussen 50 en 80. Bij een acceptabele hybridisatie zullen 1 tot 2% van de kenmerken verzadigd zijn.

Eén E min vijf genormaliseerde counts bij de verzadigingslimiet van 65.000. Wanneer de PMT-waarde is ingesteld, nabij 500, kan de hybridisatiekwaliteit ook kwalitatief worden beoordeeld door het gescande beeld van de microarray te bekijken en de intensiteit van de uitgelijnde oligos te vergelijken met andere kenmerken op de array. Het gescanne beeld moet daarnaast worden gecontroleerd op eventuele specifieke vlekken of stofdeeltjes binnen het array-gebied.

In een daaropvolgende analyse kan een scatterplot worden gebruikt om de geanalyseerde gegevens in beeld te brengen, om de relatieve niveaus van genexpressie in de monsters te bepalen en om genen te identificeren die differentieel tot expressie komen. Genen die differentieel tot expressie komen, zullen significant afwijken van de best-fit-lijn. In een aanvullende procedure hebben we laten zien hoe RNA uit zebravisembryo's kan worden geëxtraheerd om cDNA te synthetiseren. Hier hebben we laten zien hoe cDNA kan worden gelabeld en gehybrideerd op een oligonucleotide microarray-platform om globale genexpressieprofielen te bestuderen.

Denk bij het uitvoeren van deze procedure altijd aan het gebruik van hoogwaardige CD NA en voorkom dat de site three dye wordt blootgesteld aan direct licht. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.