Name: Methode voor het meten van virale Fusion Kinetics bij de Single Particle Level (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-07T16:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 59 s
Description: Leer een fluorescente methode om virale fusiekinetiek te visualiseren op enkeldeeltjesniveau met lipidebilagen. Deze techniek biedt inzicht in hemifusie en porievorming voor virologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het werk werd ondersteund door NIH subsidie ​​AI57159 (tot SCH) en AI72346 (tot AMvO). SCH is een Howard Hughes Medical Institute Investigator.

Glazen afdekplaat slip functionalisering De vlakke dubbellaag gebruikt in de fusion-test wordt ondersteund op een gehydrateerde film van dextran. Dextran fungeert als een spacer tussen de vlakke bilaag en glazen oppervlak. Dit voorkomt dat membraan componenten van steeds vast op het glas oppervlak en biedt ook ruimte aan waarin de inhoud van een virusdeeltje kan ontsnappen na fusie. Dekglaasjes worden gefunctionaliseerd door middel van een behandeling met een epoxy silaan, die ons in staat stelt om chemische binding dextran aan het glas (Elender, et al.. 1996). <ol><li> Schik 25 mm dekglaasjes in een keramische vlekken rack, en plaats het rek in een pot of beker. </li><li> Vul de container met een 10% oplossing van laboratorium kwaliteit glaswerk wasmiddel. Plaats de container in een ultrasone reiniger voor 30 minuten. </li><li> Spoel de container en dekglaasje rek met gedeïoniseerd water, en opnieuw vullen met 1M postassium hydroxide. Zet de container naar het bad ultrasoonapparaat nog 30 minuten. </li><li> Herhaal deze reiniging met behulp van aceton en ethanol. </li><li> Spoel de coverlips in het water en droog. </li><li> Ten slotte is het reinigen van de dekglaasjes met een zuurstof plasma stripper voor drie minuten. </li><li> De laatste reiniging stap oxideert het oppervlak, waardoor het glas gelijkmatig hydrofiele en reactief in de volgende silanisatie stappen. </li><li> Bereid een 0,2% oplossing van 3-glycidoxypropyltrimethoxy silaan in isopropanol. Dompel de dekglaasjes in deze oplossing gedurende vijf minuten. </li><li> Gooi de silaan-oplossing en spoel de dekglaasjes meerdere malen in isopropanol. </li><li> De dekglaasjes zijn nu bedekt met een laagje silaan, maar ze moeten worden genezen, zodat de silaan om covalent hechting aan het glas. Plaats de dekglaasjes in een oven op 80 graden Celsius gedurende een uur. </li><li> Terwijl de dekglaasjes worden genezen, wegen uit dextran 500 en bereiden een 30% w / v oplossing. Voorverwarming van het water zal helpen oplossen. Wij zullen ongeveer 1 ml van deze oplossing per dekglaasje aan. Zodra de dextran is opgelost, schuimdemper de oplossing in een vacuüm exsiccator. </li><li> Wanneer de gesilaniseerd dekglaasjes klaar genezen, verwijder ze uit de keramische rek en schik ze plat op de binnenkant van een plastic vriesvakje. Gebruik een 1 ml pipet op de bovenkant van elke dekglaasje met ~ 1 ml van de dextran oplossing te dekken. Sluit de diepvries doos en laat op een rustige plek voor 24-36 uur. </li><li> Pak de dekglaasjes met plastic pincet, giet het overtollige dextran en plaats ze in de keramische rack. Spoel de dekglaasjes meerdere malen in het water, en laat de dekglaasjes in water weken gedurende 48 uur. De pot kan voorzichtig worden geschud op een tafel-top rotator. </li><li> Droog de dekglaasjes in een oven op 80 graden Celsius en op te slaan in een vacuüm exsiccator. </li></ol> Liposoom Voorbereiding Ondersteund lipidendubbellagen worden gevormd door adsorberen liposomen om een ​​dextran gefunctionaliseerd dekglaasje aan. De geadsorbeerde liposomen fuseren met elkaar tot de membraan breuken en verspreidt zich vlak boven het oppervlak. <ol><li> Een typische liposoom formulering gebruikt in de test bestaat uit 1,2, dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DOPC), 1-oleoyl-2-palmitoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (POPC), cholesterol, runderen hersenen Disialoganglioside (GD 1a), en N-((6 - (biotinoyl) amino) hexanoyl) -1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine in een verhouding van 4:4:2:0.1:5 x10 -5. Alle onderdelen worden opgeslagen in chloroform of chloroform en methanol oplossingen. </li><li> Maak een mengsel dat twee micromol lipide door de overdracht van hoeveelheden van elke component in een glazen reageerbuis. Damp het oplosmiddel onder een stroom van argon of stikstof gas. Verwijder het resterende oplosmiddel door het verlaten van de reageerbuis in een vacuüm exsiccator gedurende twee uur. </li><li> Resuspendeer de gedroogde lipide film in 400 microliter van HNE buffer (5 mM HEPES, 145 mM NaCl, 0,1 mM EDTA). </li><li> Breng de suspensie met een plastic microcentrifugebuis. Bevriezen van de suspensie in een vloeibare stikstof bad en dooi in een warm waterbad. Herhaal deze vries / dooi cyclus vier keer. </li><li> Monteer een lipide extruder met een 100 nm polycarbonaat membraanfilter, en extrusie van de lipide suspensie 25 keer. De schorsing zou moeten verschijnen om een ​​meer transparante na extrusie. </li><li> Liposomen worden gebruikt op de dag dat ze zijn voorbereid. Ze kunnen worden bewaard bij kamertemperatuur tot gebruik. </li></ol> Microfluïdische stroom celpreparaat Een eenvoudige microfluïdische stroom cel is gemaakt door daartussen dubbele plakband tussen een kwarts-glijbaan en een gefunctionaliseerd dekglaasje aan. <ol><li> Verkrijgen van een 20x20x3 mm kwarts dia. Gebruik een diamant braam tot twee 1 mm gaatjes aan weerszijden boren. </li><li> Snij een 20 mm vierkant van een blad van een dubbele plakband, en het gebruik van een scheermesje, uitgesneden een 15 x 2 mm gedeelte van het centrum. </li><li> Trek een kant van de tape drager, en houden de tape op de kwartz glijbaan. Hechten aan de andere kant om een ​​gefunctionaliseerd dekglaasje aan. </li><li> Knip twee 20 cm lengte van polyethyleen buis en steek ze in de gaten in de kwarts dia. </li><li> Seal de stroom cel met 5 minuten epoxy lijm. </li><li> Als de lijm is uitgehard, prime de stroom cel en slang met buffer. </li><li> Een ondersteunde lipide dubbellaag gevormd kan worden op dit moment door het opstellen ongeveer 80 microliter van het liposoom schorsing in de kanalen. </li></ol> Virusdeeltje etikettering <ol><li> H3N2 influenza A (X-31) wordt doorgaans gebruikt voor de fusie-test, maar ook andere griep stammen en andere virussen zijn met succes gebruikt. </li><li> Virus is gelabeld met maximaal twee verschillende fluorescente kleurstoffen om detectie van hemifusion en porie-vorming mogelijk te maken. </li><li> Los sulforhodamine b (SRB) in HNE buffer tot een 20 mM oplossing. Combineer 20 microliter van de kleurstof oplossing met 10 microliter van de virale vering, en laat op kamertemperatuur gedurende 20 uur. Gedurende deze periode zal kleurstof langzaam ophopen in de virusdeeltjes. </li><li> Verwijder de overtollige kleurstof door het passeren van de ophanging het virus door middel van een PD-10 ontzouten kolom. Als er genoeg viraal materiaal wordt gebruikt, kan een gekleurde band te zien in de kolom. Deze band bevat het label virus en kan worden verzameld zoals het is geëlueerd. </li><li> Als er geen band zichtbaar is, het verzamelen van 200 microliter fracties en bepalen welke fracties bevatten, gelabeld virus door het meten van 565 nm absorptie op een spectrofotometer. Het virus moet elueren in een totaal volume van ongeveer 0,8 ml. </li><li> Label de virale envelop door het toevoegen van 13 microliter van een 2 mM dimethyl formamide (DMF) oplossing van octadecyl rhodamine 110 (Rh110C18) om de SRB label virus schorsing. </li><li> Roer de schorsing door het aanbrengen van de buis naar een laboratorium rotator en laat gedurende 3 uur. </li><li> Zuiveren het virus uit overtollig Rh110C18 met behulp van een PD-10 ontzouten column zoals eerder beschreven. </li></ol> Microscoop configuratie Het experiment wordt uitgevoerd op een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een hoge NA olie-immersie objectief geschikt voor totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie. De 488 en 568 nm lijnen van een argon / krypton gas laser worden gebruikt om de Rh110C18 en de SRB gelabeld virus te wekken. Gelijktijdige beeldvorming van elk etiket wordt bereikt door het splitsen van de groene en rode fluorescentie emissie met een dichroïde spiegel en onafhankelijk van elkaar het richten van de beelden op afzonderlijke helften van een elektron te vermenigvuldigen CCD camera. Het uitvoeren van de test Uitvoering van de fusie test omvat een stapsgewijze montage van de biochemische componenten in de stroom cel: de montage van de vlakke lipide dubbellaag, docking van gelabelde virusdeeltjes, het bekleden van het oppervlak met fluoresceïne, en initiatie van de reactie met een lage pH-buffer (figuur 1A) . <ol><li> Monteer de flow-cel op de microscoop podium, en bevestig de afvoer slang aan op een injectiepomp set te stromen met een snelheid van 40 microliter per minuut. </li><li> Schakel de stroom-kanalen van overtollig liposomen door stroomt in 300 microliter van HNE. </li><li> Focus van de microscoop en stel het laservermogen naar de oppervlakte te verlichten met 350 W / cm 2 van 488 nm licht en 70 W / cm 2 van 568 nm licht. Als u gebruik maakt van een 1,45 NA 60x olie-immersie objectief, stelt de laser intensiteiten 100 micro Watt en 20 Watt micro-, respectievelijk. </li><li> Pomp gelabeld virus (verdund 1 / 100) in een flow-cel. Omdat het virus verspreidt naar de onderkant van de stroom kanaal, zal deeltjes beginnen te houden aan de ganglioside opgenomen in de lipide bilaag. </li><li> Wanneer een geschikte dichtheid van gecoupeerd virusdeeltjes is bereikt (tot ongeveer 1000 deeltjes per gezichtsveld). Zet de inlaat slang aan op een oplossing met twee microgram per milliliter fluoresceïne gelabeld streptavidine. De gelabelde streptavidine zullen binden aan gekoppeld lipide moleculen biotine in de bilaag, en uiteindelijk een schemerige groene achtergrond zichtbaar. </li><li> Was de stroom kanaal met 300 microliter van HNE. </li><li> Kies een imaging gebied, de focus van de microscoop en de voorbereiding van de CCD-camera voor tijd verstreken beeldacquisitie. Stel de belichting tijd tot 100 ms en het verzamelen van beelden met een snelheid van 10 Hz. </li><li> Initieer fusie door stroomt in een zure buffer die 10 mM natriumcitraat en 140 mM NaCl. De pH van de buffer moet worden aangepast aan lager zijn dan de kritische pH van het virus worden getest. X-31 zekeringen bij pH 5,5&#39;s hieronder. </li></ol> Representatieve resultaten Figuur 1B toont foto&#39;s van bilaag aangemeerd virionen voor en tijdens de fusie. Elke diffractie beperkt plek is een individuele virus deeltje. Rode en groene fluorescentie zijn afzonderlijk belicht worden op de boven-en onderkant helften van een CCD-camera, waardoor gelijktijdige observatie van de virale envelop en de inhoud labels. Er zijn meestal twee keer zo veel plekken in de groene kanaal ten opzichte vande rode, en dit weerspiegelt de lagere efficiëntie van de etikettering door de inhoud kleurstof in vergelijking met de envelop label. De groene achtergrond fluorescentie uitgezonden van het oppervlak gebonden fluoresceïne verdwijnt bij aankomst van de citraatbuffer en maakt de bepaling van de starttijd van de fusiereactie. Hemifusion gebeurtenissen worden gedetecteerd als uitbarstingen van groene fluorescentie als de gedoofd Rh110C18 in de virale envelop diffundeert door de hemifusion steel en is verdund in het vlakke membraan. Een naar buiten uit te breiden tl-cloud kan gezien worden rond hemifused deeltjes, waaruit blijkt gratis verspreiding van de vet-acyl verbonden kleurstof in het vlakke membraan. Poriën formatie wordt waargenomen als het verval van de rode fluorescentie van SRB gevangen in het interieur van de virale deeltjes. De opening van een fusie porie kan de kleurstof om te ontsnappen in de waterige ruimte onder de vlakke bilaag en uit de observatie regio. Fluorescentie-intensiteit trajecten voor elk deeltje, dat wordt begrensd door de geïntegreerde intensiteit van individuele deeltjes, vergemakkelijken de bepaling van de opbrengst en tijden van hemifusion en poriën vorming (Fig. 1C). Hemifusion en porie vorming event tijden worden bepaald als het punt waarop de maximale helling van een Rh110C18 fluorescentie burst of SRB signaal verval optreedt. In een geslaagd experiment, ongeveer 50 procent van de deeltjes gelabeld met Rh110C18 opbrengst dequenching signalen, en 30 procent van de SRB gelabelde deeltjes geven bruikbaar signaal. Van de deeltjes gelabeld met beide kleurstoffen, ongeveer 10 procent zien zowel lipide mengen en poriën vorming van signalen. Fig. 2A-C toont de verdeling van hemifusion en poriën formatie lag tijden van een typisch experiment. Fig.2D-F toont evenement verdelingen van gebeurtenissen combinatie van vijf experimenten uitgevoerd onder dezelfde omstandigheden. Zelfs met een bescheiden aantal waarnemingen, de vorm van de histogrammen is duidelijk. Omdat elk experiment wordt gesynchroniseerd door detectie van de pH-daling de tijd, kunnen meerdere experimenten worden gecombineerd en gedetailleerde informatie over de snelheidsbepalende tussenliggende stappen kunnen worden verkregen. <img src="/files/ftp_upload/1484/1484fig1a.jpg" border="0" alt="figuur 1" /> <img src="/files/ftp_upload/1484/1484fig1b.jpg" border="0" alt="figuur 1" /> Figuur 1. Experimental design. A) Virus deeltjes zijn gelabeld met twee fluorescente kleurstoffen op de kinetiek van hemifusion en fusie poriën vorming van monitoren. Fluorescentie wordt verzameld door een hoge-NA microscoop doelstelling en afgebeeld op een CCD. B) Fluorescentie afbeeldingen voor (links) en tijdens de (rechts) de fusie van de individuele virale deeltjes. Boven-en onderste helft van elke afbeelding komen overeen met de rode en groene fluorescentie, respectievelijk, van hetzelfde ~ 50 x 100 mm 2-gebied van de ondersteunde bilaag. C) De fluorescentie-intensiteit van de rode SRB virale content tracer (bovenste spoor), de groene kleurstof Rh110C18 membraan (midden sporen), en de fluoresceïne pH-sensor (onderste spoor) geven de exacte tijden is verstreken tussen pH-daling, hemifusion, en fusie. Gelieve <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1484/1484fig1.jpg">Klik hier</a> voor een grotere versie van figuur 1 te zien. <img border="0" src="/files/ftp_upload/1484/1484fig2tmb.jpg" alt="figuur 2" /> Figuur 2. Fusion kinetiek van fluorescent gemerkte virus. Verdelingen van de tijd is verstreken tussen de pH-daling en hemifusion (A, D) en de poriën vorming (B, E). De opkomst en het verval van de distributies wijzen op de aanwezigheid van meerdere tussenliggende stappen. De overgang tussen hemifusion en de opening van een fusie-porie voor individuele deeltjes is exponentieel verdeeld, hetgeen duidt op een enkele snelheidsbeperkende stap. AC panelen tonen de resultaten van een experiment. DF-panelen zijn samengesteld uit vijf verschillende experimenten uitgevoerd onder dezelfde omstandigheden. Gelieve <a href="/files/ftp_upload/1484/1484fig2.jpg1484">Klik hier</a> voor een grotere versie van figuur 2 te zien.

<ol><li>Elender, G., Kuhner, M., Sackmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionalisation+of+Si%2FSiO2+and+glass+surfaces+with+ultrathin+dextran+films+and+deposition+of+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Functionalisation of Si/SiO2 and glass surfaces with ultrathin dextran films and deposition of lipid bilayers.</a> Biosens Bioelectron. 11, 565-577 (1996).</li>
<li>Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+kinetics+of+influenza+virus+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-particle kinetics of influenza virus membrane fusion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15382-15387 (2008).</li>
</ol>

De voorbereiding van vocht en continue ondersteund lipidendubbellagen kan een uitdaging zijn. Sporen van verontreinigende materiaal of oppervlak fouten zal voorkomen dat de verspreiding van dubbellagen. Zorgvuldige reiniging en afzetting van een uniforme laag van dextran zijn essentieel. Langdurig beeldvorming van virusdeeltjes kan het bleken van de fluorescente labels of ervoor zorgen dat ze worden geïnactiveerd. Foto-schade van deze soort is bekend in de bio-imaging en single molecule veld...

<table><tbody><tr><td>Corning dekglasvierkantjes, 25 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS286525</td><td></td></tr><tr><td>Gefuseerde silica dia's</td><td>Technical Glass</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kleurestatief</td><td>Thomas Scientific</td><td>8542E40</td><td></td></tr><tr><td>(3-glycidoxypropyl)trimethoxysilaan</td><td>Gelest Inc.</td><td>SIG5840.1</td><td></td></tr><tr><td>Dextran T-500</td><td>Pharmacosmos</td><td>5510 0500 4006</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glycero-3-fosfocholine (DOPC)</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>850375</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2oleoyl-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glycero-3-fosfocholine (POPC)</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>850457</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>700000</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-((6-(biotinoyl)amino)hexanoyl)-1,2-dihexadecanoyl-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glycero-3-fosf&amp;#8211;thanolamine, triethylammoniumzout (biotine-X DHPE)</td><td>Invitrogen</td><td>B1616</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidine, fluoresceïne-conjugaat</td><td>Invitrogen</td><td>S-869</td><td></td></tr><tr><td>Disialoganglioside GD&lt;sub&gt;1a&lt;/sub&gt; uit runderbrein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2392</td><td></td></tr><tr><td>Mini extruder</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>Polycarbonaat membraanfilters 0,1 micron</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>800309</td><td></td></tr><tr><td>Afvoerschijven van 10 mm (membraansteunen)</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>230300</td><td></td></tr><tr><td>Sulforhodamine b natriumzout</td><td></td><td>S1402</td><td></td></tr><tr><td>Octadecyl rhodamine 110 (Rh110C18)</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;Zie&lt;/em&gt; Floyd &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; 2008 voor syntheseprotocol</td></tr><tr><td>PD-10 ontzoutingskolommen</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>Nikon fluorescentiemicroscoop</td><td>Nikon Instruments</td><td>TE2000-U</td><td></td></tr><tr><td>Plan Apo TIRF 60x 1,45 NA objectief</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Innova 70C Spectrum Ar/Kr laser</td><td>Coherent Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spuitpomp</td><td>Harvard Apparatus</td><td>702213</td><td></td></tr></tbody></table>

methode voor het meten van virale fusion kinetics bij de single particle level

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Membraanfusie is een essentiële stap tijdens het invoeren van envelop-virussen in cellen. Conventionele fusie assays meestal over een groot aantal van fusie gebeurtenissen, waardoor het moeilijk kwantitatief te analyseren van de volgorde van de betrokken moleculaire stappen. Hebben we een in vitro, twee-kleuren fluorescentie assay om kinetiek van enkele virusdeeltjes fusing-monitor met een doel bilaag in hoofdzaak op vloeistof te ondersteunen. Influenza virusdeeltjes worden geïncubeerd met een groene lipofiel fluorofoor aan het membraan en een rode hydrofiele fluorofoor aan de virale interieur vlek vlek. We hebben een ganglioside-bevattende lipide bilaag afzetting op de dextran-functionilized glazen oppervlak van een flow cel, incubeer de virale deeltjes op de vlakke bilaag en het imago van de fluorescentie van een 100 x 100 micrometer 2-gebied, met daarin enkele honderden deeltjes, op een CCD camera. Door beeldvorming zowel de rode en groene fluorescentie, kunnen we tegelijkertijd toezien op het gedrag van het membraan kleurstof (groen) en de waterige inhoud (rood) van de deeltjes. Bij het verlagen van de pH op een waarde onder de fusie pH-waarde, zullen de deeltjes fuseren met het membraan. Hemifusion, de samenvoeging van de buitenste folder van de virale membraan met de buitenste folder van het doelwit membraan, wordt zichtbaar als een plotselinge verandering in de groene fluorescentie van een deeltje. Bij de daarop volgende fusie van de twee overgebleven distale folders een porie zal worden gevormd en de rode-emitterende fluorofoor in het virale deeltje zal worden vrijgegeven onder de doelgroep membraan. Dit evenement zal aanleiding geven tot een daling van de rode fluorescentie van individuele deeltjes. Ten slotte is de geïntegreerde fluorescentie van een pH-gevoelige fluorofoor dat is ingebed in het doel membraan rapporten over de exacte tijd van de pH-daling. Van de drie fluorescentie-tijd sporen, kunnen alle belangrijke gebeurtenissen (pH-daling, lipide mengen op hemifusion, content mixen op poriën vorming) nu worden gewonnen op een eenvoudige wijze en voor elk deeltje afzonderlijk. Door het verzamelen van de verstreken tijd voor de verschillende overgangen voor veel individuele deeltjes in histogrammen, kunnen we de levens van de bijbehorende tussenproducten. Zelfs verborgen tussenproducten die niet beschikken over een directe fluorescerende waarneembare kunnen direct worden gevisualiseerd uit deze histogrammen.

We presenteren een<em&gt; In vitro,</em&gt; Twee-kleuren fluorescentie assay om de fusie van enkele virusdeeltjes te visualiseren met een vloeistof doel bilaag. Door middel van etikettering virale deeltjes met fluoroforen dat differentieel vlekken op de virale membraan en het interieur, we zijn in staat om de kinetiek van hemifusion en poriën vorming van monitoren.

Methode voor het meten van virale Fusion Kinetics bij de Single Particle Level

Membraanfusie is een essentiële stap tijdens de enteratie van omhulde virussen in cellen. Conventionele fusie-assays rapporteren doorgaans over een groot aantal fusies ...

De dekglasjes die in deze assay worden gebruikt, zijn gefunctionaliseerd met dextrine en vervolgens geïntegreerd in microfluïdische stroomcellen. Vervolgens wordt elke stroomcel geïncubeerd met een suspensie van liposomen, die fuseren om een lipide dubbellaag te vormen bovenop de gehydrateerde dextrine. Onder de fluorescentiemicroscoop worden met fluoro four gelabelde virussen en met fluoresceïne gelabeld streptavidine toegevoegd, waarna de virussen zich aan de dubbellaag kunnen hechten.Een instroom van zure buffer initieert virale fusie met de dubbellaag en een digitale camera registreert de veranderingen in fluorescentie gedurende de assay. Hallo, ik ben Daniel Floyd en ik bevind me in het laboratorium van Anine Vanian in de afdeling Biological Chemistry and Molecular Pharmacology aan de Harvard University. Vandaag ga ik u een methode laten zien voor het visualiseren van virale fusiekinetiek op het niveau van individuele deeltjes.We gebruiken deze procedure in het laboratorium om te bestuderen hoe het virus de gastheercellen binnendringt. Laten we beginnen. Start dit protocol met het prepareren van de met dextrine gefunctionaliseerde dekglasjes.De eerste stap is het soniceren van de dekglasjes in oplossingen van 10% detergent, een molaire kaliumhydroxide-aceton en 100% ethanol; soniceer gedurende 30 minuten per oplossing. Spoel tussen de stappen door met gedeïoniseerd water. Spoel de dekglasjes na de laatste sonificatie af met water en droog ze vervolgens in de incubator op 80 °C.Plaats vervolgens de dekglasjes gedurende drie minuten in een zuurstofplasmastripper. Deze stap oxideert het oppervlak van de glaasjes, waardoor het glas uniform hydrofiel wordt en reactief is voor de volgende silaniseringsstappen. Dompel de dekglasjes vervolgens onder in een verse oplossing van 0,2% gly oxy propyl trimeth oxypro trim methoxy in isopropanol en incubeer dit gedurende vijf minuten.Spoel de dekglasjes vervolgens meerdere keren met isopropanol. Plaats de Slan-gecoate dekglasjes gedurende één uur bij 80 °C. Deze uithardingsstap zorgt ervoor dat Slan covalent aan het glas bindt.Plaats na het uitharden de dekglasjes plat op de bodem van een plastic vriesdoos. Bedek het bovenste oppervlak van elk dekglasje met ongeveer één milliliter van een dextrine-oplossing (30% gewicht per volume in water).Sluit de vrieskast en laat de dekglasjes gedurende 24 tot 36 uur op een rustige plaats staan. Giet de volgende dag het overtollige dextrine af, pak de dekglasjes vast met een plastic pincet en plaats ze terug in het keramische rek. Spoel ze meerdere keren met water en laat ze 48 uur in water weken.De container kan voorzichtig worden geschud op een tabletop-rotator; droog de dekglasjes in een oven die is ingesteld op 80 graden Celsius en bewaar ze in een vacuümdesiccator tot u klaar bent voor de volgende stap. Het coaten van de dekglasjes met een mengsel van liposomen om een planaire dubbellaag te vormen. De volgende stap is het voorbereiden van de liposomen om de lipide dubbellaag te vormen; combineer in de zuurkast alle in chloroform opgeloste lipiden in een glazen reageerbuis.De liposoomformulering bevat een dia-ganglia-zijde, die virusdeeltjes bindt, en een gebiotineerd lipide, dat bindt aan de met streptavidine geconjugeerde pH-indicator fluoresceïne. Verdamp vervolgens het oplosmiddel onder een stroom argon- of stikstofgas. Verwijder het resterende oplosmiddel door de reageerbuis gedurende twee uur in een vacuümdesiccator te plaatsen.Resuspendeer de gedroogde lipidefilm in 400 µL HNE-buffer. Draag de suspensie vervolgens over naar een plastic microcentrifugebuisje. Vries de suspensie in een bad van vloeibare stikstof en ontdooi deze in een warm waterbad.Herhaal deze vries-dooi-cyclus vier keer na de vries-dooi-cycli. Gebruik een lipidenextruder, voorzien van een membraanfilter van 100 nanometer, om de lipidensuspensie te extruderen. Na 25 keer extruderen moet de suspensie transparanter lijken.Bewaar de liposomen bij kamertemperatuur en gebruik ze op de dag van bereiding. Nu de lipiden klaar zijn, kan de microfluïdische flowcel worden voorbereid. Neem eerst een kwartsplaat van 20 bij 20 bij drie millimeter en boor met een diamantboor twee gaten van één millimeter aan tegenovergestelde zijden.Snijd met een scheermesje een vierkant van 20 millimeter uit een vel dubbelzijdige tape. Snijd uit het midden een sectie van 15 bij twee millimeter uit. Verwijder de beschermfolie van één zijde van de tape en plak de tape op de objectglas.Plak de andere zijde vast aan een gefunctionaliseerd dekglas; snijd nu polyethyleenbuisjes op lengtes van 20 centimeter en voeg deze in de openingen van de kwartsplaat in. Seel vervolgens de flowcel met vijf-minuten epoxylijm. Verdeel de lijm rond de zijkanten van de kwartsplaat om deze aan het dekglas te hechten.Gebruik twee extra druppels lijm om de verbinding tussen de buisjes en het kwartsglasplaatje af te dichten. Wanneer de lijm is uitgehard, wordt de flowcell en de buisjes geprimed met HNE-buffer. Trek vervolgens, om de ondersteunde lipide dubbellaag te creëren, ongeveer 80 µL van de geëxtrudeerde liposoomsuspensie in de kanalen op de dag voorafgaand aan het fusie-experiment.Begin met het labelen van de viruspartikels om het binnenste van het virus rood te kleuren. Combineer 20 µL vers bereide sulfur rumine- of SRB-oplossing met 10 µL van de virussuspensie en laat dit 20 uur bij kamertemperatuur staan. Verwijder de volgende dag de overtollige kleurstof door de virussuspensie door een PD 10 ontzoutingskolom te leiden en te verdunnen met 800 µL HNE-buffer.De kolom moet een duidelijk gekleurde band vertonen, waarin het gelabelde virus zich bevindt. Verzamel deze fractie vervolgens tijdens de elutie stap, label de virale envelop groen door 13 µL Octadecyl-rhodamine B (RH 10 C 18) toe te voegen aan de SRB-gelabelde virale suspensie. Meng de suspensie door de buis in een laboratoriumrotator te plaatsen en laat dit drie uur lang doorgaan.Verwijder vervolgens het overtollige RH one 10 C 18 met behulp van een PD 10 ontzoutingskolom. Zoals eerder beschreven is het virus nu klaar voor de fusie-assay. Voer de fusiekinetiek-assay uit met een fluorescentiemicroscoop die is uitgerust met een olie-immersie-objectief met een hoge numerieke apertuur.Een Argonne kryptonlaser exciteert de fluoroforen in het virale membraan en het interieur. Een dichroïsche spiegel splitst vervolgens de rode en groene fluorescentie-emissies en focust de beelden onafhankelijk op afzonderlijke helften van een electron multiplying CCD- of charge coupled device-camera. Monteer het dekglas op de microscooptafel en bevestig de uitlaatleiding aan een spuitpomp die is ingesteld op een flow van 100 µL per minuut.Spoel de stroomkanalen vrij van overtollige liposomen door 300 µL HNE door te laten stromen. Stel de microscoop scherp en pas het laservermogen aan om het oppervlak te belichten met 350 W/cm² licht van 488 nm om de rode fluorescente markers te exciteren, en 70 W/cm² licht van 568 nm om de groene fluorescente markers te exciteren. Nu de microscoop gereed is, kan het gelabelde virus, verdund 1:100, in de stroomcel worden gepompt.Terwijl het virus naar het bodemoppervlak van het stroomkanaal diffundeert, beginnen de deeltjes aan te hechten. Ze hechten aan de kant van de DIA-ganglia, geïncorporeerd in de dekglasplaat, planaire bilaag. Wanneer de dichtheid van de aangehechte deeltjes ongeveer enkele honderden deeltjes per gezichtsveld bereikt, begint men met het laten vloeien van een oplossing van 2 µg/mL.Fluoresceïne-gelabeld streptavidine, een pH-gevoelige fluorofoor, aangezien het gelabelde streptavidine bindt aan biotine-gekoppelde lipidemoleculen in de dubbellaag. Er verschijnt opnieuw een zwakke groene achtergrond; spoel het stromingskanaal met 300 µL HNE. Nu de virussen zijn aangemeerd en het oppervlak van de dubbellaag is gecoat met fluoresceïne, is het tijd om de assay te starten.Kies een beeldgevingsgebied, stel de microscoop scherp en bereid de CCD-camera voor op time-lapse beeldacquisitie. Stel de belichtingstijd in op 100 milliseconden en verzamel frames met een frequentie van 10 hertz. Initieer de fusie van het virusmembraan door een zure natriumcitraatbuffer in te stromen.Wanneer de pH daalt, neemt de fluorescentie van fluoresceïne af, waardoor het tijdstip van de verzuring nauwkeurig kan worden vastgesteld. De CCD-camera registreert de gegevens gedurende de gehele assay, die gebruikt kunnen worden om het tijdstip van hemifusie en porievorming te bepalen, zoals gedocumenteerd door de CCD-camera. Na de pH-daling treden er uitbarstingen van groene fluorescentie op wanneer de virale en planaire membranen fuseren, de lipiden mengen en de groene kleurstof in de virale envelop wordt verdund in het planaire membraan.In tegenstelling hiermee is er een afname van de rode fluorescentie na de pH-daling, aangezien de virale en lipidemembranen poriën vormen waardoor de rode kleurstof uit het virale interieur kan ontsnappen naar de waterige ruimte onder de planaire bilaag en buiten het gezichtsveld raakt; deze trends kunnen ook worden gevisualiseerd via fluorescentie-snapshots vóór en tijdens de fusie. Zet daarnaast de trajecten van de fluorescentie-intensiteit voor elk deeltje uit zoals in dit voorbeeld wordt getoond. Hemifusie wordt gedefinieerd als het punt waarop de helling van de groene fluorescentie-intensiteit het steilst is, en porievorming als het punt waarop de afname van de rode fluorescentie plaatsvindt. Combineer gegevens van meerdere experimenten om histogrammen van de vertragingstijden voor hemifusie en porievorming te genereren zoals hier getoond, waarbij het tijdstip van de pH-daling als t=0 wordt gebruikt om gegevens van verschillende experimenten te synchroniseren.Ik heb u zojuist een methode getoond om de kinetiek van virale fusie op enkelvoudig partikelniveau te meten. Let er bij het uitvoeren van deze procedure op dat u schone dekglasjes gebruikt, zodat u een homogene en vloeibare dubbellaag verkrijgt.Probeer daarnaast de hoeveelheid licht die u gebruikt tijdens fluorescentie-imaging te minimaliseren, zodat u fotobeschadiging kunt beperken. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

method-for-measurement-viral-fusion-kinetics-at-single-particle

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Single Virus Genomics (SVG) is een methode om te isoleren en versterken de genomen van enkele vironen. Virale suspensies van een gemengde assemblage worden naargelang het gebruik van flowcytometrie op een objectglaasje met discrete putjes die agarose, waardoor het vastleggen van het virion en het verminderen van het genoom afschuiving bij opwerking. Whole genome amplificatie wordt bereikt door verschillende verplaatsing amplificatie (MDA) resulterend in genomisch materiaal dat geschikt is voor...

Isolatie en Genoomanalyse van Single Virionen gebruik &#39;Single Virus Genomics&#39;

This video demonstrates an assay to evaluate antiviral agents that target specific steps of the viral entry into host cells and fusion with the endosome. The cells are incubated at a low temperature and then infected with HCV. The low temperature permits viral binding to host cells but inhibits internalization via endocytosis. The test antiviral compound is added, and the cells are incubated at physiological temperature. This shift to a higher temperature facilitates viral entry and allows...

An Assay to Evaluate the Effect of Test Compounds on Viral Entry and Fusion in Host Cells

De bevestiging van virionen aan een oppervlak is een vereiste voor enkelvoudige virion imaging door Super-resolution fluorescentie imaging of atomic force microscopie (AFM). Hier demonstreren we een monstervoorbereidingsmethode voor gecontroleerde hechting van virionen op glasoppervlakken die geschikt zijn voor gebruik in AFM- en superresolutiefluorescentiebeeldvorming.

Monstervoorbereiding voor single virion atomic force microscopie en superresolutie fluorescentie beeldvorming

We presenteren een protocol dat een semi-kwantitatief methode beschrijft voor het meten van zowel de aanhechting van influenza A-virus aan A549-cellen als de internalisatie van virusdeeltjes in de doelcellen door middel van flowcytometrie.

Meten Attachment en internalisering van influenza A-virus in A549 cellen door flowcytometrie

De eerste stap in de arenavirus levenscyclus is het hechten van virale deeltjes aan gasthercellen. We rapporteren een kwantitatief (q)RT-PCR-gebaseerde test voor ultragevoelige detectie en kwantificering van arenavirus-hechtingsgebeurtenissen.

Zeer gevoelige test voor het meten van arenavirus-cel Attachment

Virussen of extracellulaire blaasjes werden immunogevangen met 15 nm magnetische nanodeeltjes gekoppeld aan antilichamen die oppervlakte-antigenen herkennen. De gevangen virionen of blaasjes werden gelabeld met fluorescente antilichamen tegen andere oppervlakte-antigenen. De resulterende complexen werden gescheiden in een hoog magnetisch veld en geanalyseerd met conventionele flowcytometers die werden geactiveerd door fluorescentie.

Flow Virometry Analyseer antigene Spectra van Virions en extracellulaire blaasjes

We presenteren een open source hoog gehalte analyse (HCA) instrument gebruik te maken van geautomatiseerde fluorescentie lifetime imaging (FLIM) voor het testen van eiwit interacties met behulp van Förster resonance energy transfer (FRET) op basis van uitlezingen. Data-acquisitie voor deze openFLIM-HCA instrument wordt bestuurd door software geschreven in μManager en data-analyse wordt uitgevoerd in FLIMfit.

Open Source High Content Analysis Door gebruik te maken van de automaten Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Routine detectiemethoden gebruik te maken van de versterking van het virale genoom worden beperkt door hun onvermogen om te discrimineren besmettelijke uit niet-infectieuze deeltjes. Het doel van dit artikel is om gedetailleerde protocollen voor alternatieve methoden om hulp in discriminatie van besmettelijke norovirus deeltjes met behulp van aptamer-bindende, Dynamische lichtverstrooiing en transmissie-elektronenmicroscopie.

Alternatieve In Vitro methoden voor de bepaling van de structurele integriteit van virale Eiwitmantel

We beschrijven een cel-gebaseerde test om te melden aan de HIV-1 fusion via de uitdrukking van groen fluorescent proteïne aantoonbaar door stroom cytometry of fluorescentie microscopie. Het kan worden gebruikt voor het testen van remmers van virale toegang (specifiek aan de fusie stap) in cel-vrij en cel-naar-cel infectie systemen.

Een High-throughput Cre-Lox geactiveerd virale membraan Fusion Assay ter identificatie van de Inhibitors van HIV-1 virale membraan Fusion

In dit manuscript wordt een protocol gepresenteerd voor het uitvoeren van FACS-based meting van de transcriptionele activiteit van BK-polyomavirus door gebruik te maken van HEK293T cellen met een bidirectionele reporter plasmide die tdTomato en eGFP uitdrukt. Deze methode maakt het mogelijk om de invloed van nieuwe verbindingen op virale transcriptie kwantitatief te bepalen.

Meting van BK-polyomavirus niet-coderende controle regio gedreven transcriptionele activiteit via Flowcytometrie

Hier beschrijven we een nieuw ontwikkelde multiplex fluorescerende immunoassay die gebruikmaakt van een dual-reporter flowcytometrisch systeem om tegelijkertijd twee unieke spike-eiwitepitopen te detecteren op intacte virale deeltjes van het severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) die waren opgevangen door angiotensine-converterend enzym-2-gekoppelde magnetische microsferen.

Profilering van oppervlakte-eiwitepitopen op virale deeltjes door multiplex dual-reporter-strategie

Leer een fluorescente methode om virale fusiekinetiek te visualiseren op enkeldeeltjesniveau met lipidebilagen. Deze techniek biedt inzicht in hemifusie en porievorming voor virologisch onderzoek.

Methode voor het meten van virale Fusion Kinetics bij de Single Particle Level

Meer video's verkennen