Name: Schaalbare fluïde Injector-arrays voor Virale Targeting van Intact 3-D Brain Circuits (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-21T00:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: Leer hoe je een parallelle injectie-array bouwt voor efficiënte virale levering aan meerdere hersengebieden tegelijk. Deze methode maakt optische manipulatie van neurale circuits in vivo mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ESB erkent financiering door New Innovator Award van de NIH directeur (DP2 OD002002-01), NIH Challenge Grant 1RC1MH088182-01, NIH Grote kansen Grant 1RC2DE020919-01, NIH 1R01NS067199-01, NSF (0,835,878 en 0,848,804), het McGovern Institute Neurotechnologie Award Programma , het ministerie van Defensie, NARSAD, de Alfred P. Sloan Foundation, Jerry en Marge Burnett, de SFN Research Award for Innovation in Neuroscience, het MIT Media Lab, de Benesse Foundation, en de Wallace H. Coulter Foundation.

1. Constructing stereotaxische Clamp <ol><li> De stereotaxische klem wordt gebruikt voor het bevestigen van de injector array om de stereotax, zodat de injectoren zijn parallel aan de stereotaxische arm. </li><li> Elk lab heeft slechts een klem, tenzij verwacht wordt dat meer dan een operatie kan gelijktijdig plaatsvinden. In dit geval voor hetzelfde aantal als het verwachte maximale aantal gelijktijdige operaties. Het zou ook aan te raden om een ​​extra te maken, in geval van schade aan de eerste. </li><li> Om de stereotaxische klem, in de eerste plaats is een 1,5 mm buitendiameter (OD) stalen canule gesneden om twee centimeter lang, en een van de uiteinden is Dremeled naar beneden tot vlak. </li><li> Vervolgens wordt een klein stukje (ongeveer 0,5 x 0,5 cm) snijden van PCB proto-board, om te worden gebruikt als een spacer. </li><li> Met behulp van een laser cutter om te waarborgen dat de gedane eventuele bezuinigingen loodrecht op het oppervlak van het materiaal, zijn twee identieke rechthoeken (1 / 2 &quot;x 3 / 8&quot;), gesneden uit 1 / 8 &quot;acryl platen, elke rechthoek met twee ronde gaten in tegenoverliggende hoeken van de rechthoek. De eerste hole heeft een diameter van 1,5 mm, en is net groot genoeg om de metalen canule stevig vast te houden. De tweede gat heeft een diameter van 1 / 16 &quot;(Figuur 1C). </li><li> De metalen canule is ingebracht in de 1,5 mm gat van een rechthoek, vervolgens door de 1,5 mm gat van de tweede. De onderkant van de canule is uitgelijnd met de onderkant gezicht van de onderste rechthoek, die de vorm van een hockeystick. </li><li> Terwijl de spacer strak gehouden tussen de twee rechthoeken, is deze structuur bij elkaar gecementeerd met behulp van hete lijm rond de canule en 1,5 mm gaten, en let om te voorkomen dat het lijmen van de spacer aan de rechthoeken. Boetseerklei kan nuttig zijn om bij elkaar te houden dingen tijdens dit proces. </li><li> Nadat de lijm is gedroogd, wordt een 1-72 schroef ingebracht in de 1 / 16 gat vanaf de bovenkant van de rechthoeken. Dan is een 1-72 zeskantmoer is geschroefd op het einde van de 1-72 schroef, en aangescherpt. De schroef en moer dienen om de klem bij elkaar te houden. </li><li> U bevestigt de moer aan de onderkant gezicht van de onderste rechthoek, kleine hoeveelheden van de 5-minuten epoxy worden gedropt aan de rand van de moer, zonder dat de epoxy te krijgen in de schroefdraad van de moer of schroef. Elke boetseerklei wordt verwijderd, en het is bevestigd dat de spacer kan worden gehouden stevig op zijn plaats door het aandraaien van de schroef. </li></ol> 2. De voorbereiding van de voor de aangepaste injector array: Hamilton pomp en stereotax <ol><li> De injector array systeem kan worden aangepast aan vrijwel elke set van coördinaten in de hersenen. </li><li> De gebruiker eerst lokaliseert coördinaten van de gewenste injectieplaats in een muis (of andere soorten) de hersenen atlas, het omzetten naar de juiste coördinaten gebruikt door de stereotax (hier, X-, Y-en Z-coördinaten). Het aantal injectieplaatsen (drie in de figuren 1A en 1B) zullen hierna te noemen k. </li><li> k het aantal van 10 pl Hamilton spuiten worden geplaatst in een injectie / terugtrekking spuit pomp zoals deze van Harvard apparatuur. </li><li> Vervolgens drie meter lange stukken van polyethyleen buizen zijn aangesloten op de naald van elke Hamilton spuit. </li><li> Voor elk stuk van polyethyleen buizen, een F-252 buizen mouw van Upchurch Scientific is gleed over het open einde en bevestigd aan een P-627 buis adapter met de bijgeleverde moer en ring, ook van Upchurch Scientific. </li></ol> 3. De bouw van de op maat Injector Array <ol><li> Elke injector array wordt aangepast aan de set van de coördinaten die de gebruiker kiest. Echter, voor sets coördinaten die verschillen alleen door een vertaal-en / of rotatie, kan dezelfde injector array worden gebruikt. </li><li> Gezien alleen de relatieve X-en Y-coördinaten van de injectieplaatsen, zijn k gaten geboord in een PCB proto-board met een dikte van 1 / 32 &quot;, met dezelfde relatieve afstand. Deze gaten zijn geboord met behulp van een Modela mini-molen en een 0.011&quot; diameter boor van de McMaster-Carr. Zorg ervoor dat u een lage snelheid van het boren (Z-speed) gebruiken om te voorkomen breken of het dragen van de boor. Voor het verwijderen van de raad van bestuur van de molen, is een rechthoek geboord om de kleine gaatjes, met behulp van een grotere boor met een diameter 1 / 32 &quot;, om te voorkomen dat het dragen van de kleinere een Code voor de mini-molen kan worden gegenereerd met behulp van MATLAB gemakkelijk;. Monster code wordt in de volgende bestanden. <ol class="lroman"><li> generate.m - MATLAB-code voor het genereren van Modela code van de gewenste coördinaten </li><li> holes_ex.rml - Modela code voor het boren van belpatroon (acht holes) in de Proto-board </li><li> outline_ex.rml - Modela code voor het boren van gaten rechthoek rond </li></ol></li><li> 245 micrometer OD/100 um binnendiameter (ID) fused silica capillaire buis, verkrijgbaar bij Polymicro Technologies, wordt gesneden in het aantal k van 3 inch stukken. Deze omvatten de afzonderlijke injectoren. Een wegwerp stuk van de capillaire buis is gestoken doorelk van de gaten, op te ruimen puin, zonder verstopping van de werkelijke injectoren. De injectoren zijn nu halverwege vervolgens ingebracht in elk gat, zodat ze stevig en evenwijdig aan elkaar. De injectoren zijn geëpoxeerd aan het bestuur, de vorming van de structuur van de injector array. Het enige dat overblijft is voor de injectoren trimmen op de juiste lengte. </li><li> De injector array is verbonden met de stereotaxische klem door het plaatsen van een hoek van het proto-board tussen de acryl rechthoeken, en vervolgens door het aandraaien van de schroef van de stereotaxische klem. Vervolgens wordt de metalen canule van de klem aan de stereotax, met behulp van de bevestiging mechanisme van de stereotax. </li><li> Alle volgende wordt gedaan onder een microscoop. Voor een van de buitenste injectoren (dat wil zeggen, een die kan van de kant worden benaderd met een rechte rand, zonder stoten in een van de andere injectoren), wordt de tip verder reiken dan de onderkant van de proto-board knippen met een schaar. Voor de corticale injecties, is het aangewezen om de injector hebben de uitbreiding van ongeveer 5 mm boven het oppervlak van het proto-board. Voor diepere injecties, kan dit aantal worden verhoogd met de overeenkomstige toename in de diepte. De tip is afgeplat met een Dremel gereedschap. Injector tips kunnen ook de grond in een hoek als een extra voorzorgsmaatregel tegen verstopping, als precisie in de diepte is minder belangrijk. </li><li> Vervolgens wordt een stabiel referentiepunt gekozen binnen het bereik van de stereotaxische arm, en de injector array is zo ontroerd dat de platte uiteinde van de buitenste injector, is op dit referentiepunt. </li><li> Een tweede injector wordt gekozen, samen met de bijbehorende coördinaten. Overwogen, is het relatieve verschil in hoogte (z-richting) tussen de eerste en tweede injector coördinaten. De injector array wordt bewogen langs de Z-as door deze relatieve afstand. De tweede injector is bijgesneden en Dremeled op de juiste lengte, zodat het uiteinde van de tweede injector nu plat is en op de hoogte van het referentiepunt. De injector array kan worden verplaatst in de X-en Y-richting de vergelijking van de injector tip te vergemakkelijken met het referentiepunt. </li><li> Dit proces van trimmen wordt herhaald voor de overige injectoren. </li></ol> 4. Monteren van het gehele systeem <ol><li> De stereotaxische klem en op maat gemaakte injector array, beide reeds gebouwd, nodig zijn voor dit deel. </li><li> De achterkant einde van elke injector (het einde dat niet is getrimd) wordt ingebracht in een blauwe F-240 buizen mouw en, met behulp van een P-235 moer en P-200 ring van Upchurch Scientific, is bevestigd aan de schroefdraad adapter reeds aangesloten aan de pomp door Hamilton polyethyleen buis. Instructies van de fabrikant kan worden geraadpleegd voor meer informatie. </li><li> Met behulp van een 27-gauge naald, is siliconenolie geïnjecteerd in de achterkant van de Hamilton spuiten, zodat het hele systeem is gevuld vanuit de Hamilton spuit aan de injector tip, met geen luchtbellen helemaal. </li><li> Omdat de Hamilton spuiten opnieuw worden geplaatst in de Hamilton pomp, is de grootst mogelijke hoeveelheid siliconenolie gehandhaafd in de spuiten. </li><li> Als het experiment meer nodig spuiten dan de pomp is ontworpen voor (twee in dit geval), kan het spuiten worden gespreid met kleine stukjes plastic (bijv.-, naald-caps) om ze parallel aan elkaar, en ervoor te zorgen dat alle stukken zijn geduwd door de pomp in dezelfde mate. Of kan een multi-rack upgrade kit gekocht van Harvard Apparatus tot maximaal 10 spuiten in een keer. </li></ol> 5. Injecties / operatie <ol><li> Het proces van het injecteren met een parallelle injector is zeer vergelijkbaar met die van het injecteren met een pipet. </li><li> Het is essentieel om langzaam bijvullen gebruiken / tarieven trekken tijdens dit proces, omdat de pompen snel mogelijk nadruk te leggen op de verbinding tussen grote en kleine slangen. Aanbevolen max. snelheid: 2 pl / min voor het laden virus, en 0,1 pl / min voor infusie virus. </li><li> Een verdoofde muis wordt geplaatst in de stereotax, en blijft onder narcose gedurende het experiment. </li><li> Bereid de muis als dat nodig is. Bijvoorbeeld met een scalpel, is een enkele snede gemaakt naar de middellijn van de huid, van tussen de ogen tussen de oren. De huid is teruggetrokken naar de schedel bloot te leggen, en de fascia is schoongemaakt. Een getrokken glazen pipet is bevestigd aan de stereotax. De posities van het oor bars zijn aangepast totdat bregma en lambda zijn afgestemd op dezelfde hoogte, en zo dat de lijn die hen is evenwijdig met de Y-as van de stereotax. De assen van de stereotax zijn gericht volgens het coördinatensysteem waarin de injectie coördinaten zijn berekend. De stereotaxische is op nul gezet met de punt van de glazen pipet op bregma, en dan is de tip is gepositioneerd iets boven de schedel op de X-en Y-coördinaten van een van de injectieplaats. </li><li> Met behulp van een tandartsboor, is de schedel onder de tip voorzichtig weg vergeleken tot er nog een uiterst dun laagje van het bot. De glazen pipet kan lagered en getogen om te controleren of het gat wordt geboord is gecentreerd op de juiste positie. Met behulp van een 30-gauge naald, een klein stukje van de laag wordt voorzichtig geplukt, op de juiste X-en Y-coördinaten, zodat de dura mater is blootgesteld. Dit gat moet net groot genoeg om een ​​van de injectoren (0,25 mm breed) te passen. Zie figuur 1D voor diagram. Op deze manier, zijn klein, 0,25 mm brede gaten in de schedel, op de X-en Y-coördinaten die overeenkomen met elke injectie. </li><li> De glazen pipet is weggegooid in een naaldencontainer, en de aangepaste injector array is bevestigd aan de stereotax met behulp van de stereotaxische klem. </li><li> Om correct de hoek van de injector-array set, zijn twee buitenste injectoren gekozen worden gekalibreerd op een gegeven referentiepunt, als volgt. Na een van de injectoren is gekoppeld aan het referentiepunt, rekening houden met de relatieve X-en Y-afstanden tussen de injectieplaatsen met betrekking tot deze injector en een ander. De assen van de stereotax worden aangepast, zodat hele injector array is verplaatst in de X-en Y-richting door deze relatieve afstanden. Als de tweede injector is nu niet in lijn met het referentiepunt, is de metalen canule losgemaakt en gedraaid. Dit proces is iteratief herhaald tot de injector array is goed gehoekt. </li><li> Voor het vullen van de injectoren met het virus, zijn de injectoren gevuld met siliconen olie totdat de spuiten zijn op de 2 ul punt (of meer). Dit zorgt voor een bufferzone, zodat eventuele luchtbellen of verstopping in de punt kan gemakkelijk verwijderd worden door op olie uit het gebruik van de Hamilton pomp, zonder bij te vullen het hele systeem met siliconen olie uit de achterkant van het spuiten, zoals eerder beschreven. </li><li> Een steriele stuk Parafilm is geplaatst op de schedel, en de injectoren zijn voorzichtig zakken op de Parafilm. Voor de coördinaten met sterk wisselende dieptes, een op maat gefreesd deel (bijvoorbeeld een trap-vormig object) zou kunnen vergemakkelijken het laden. </li><li> De volgende onderdelen gaan ervan uit dat een ui van het virus is om te worden geladen op elke locatie (de volgende hoeveelheden moeten worden verlaagd als kleinere hoeveelheden zijn gewenst). Om te garanderen dat&gt; een ui van het virus wordt geïnjecteerd op elke locatie, is 1,5 ul van het virus gepipetteerd op de Parafilm of trap aan het uiteinde van elke injector. </li><li> Met het vullen tarief van de Hamilton pomp ingesteld op 1 pl / min, is 1,2 pi van het virus gevuld in elke injector. </li><li> De tip van de langste injector is op nul gesteld op bregma, en vervolgens de injector array is verschoven naar de X-en Y-coördinaten van die injector. Als verstopping is een probleem, zeggen als er veel diepe doelstellingen zijn betrokken: nog voor het plaatsen van de injector tips in de hersenen, is het soms aan te raden om de pomp infunderen te starten, totdat virus kan worden gezien die uit alle injector tips. Dit verwijdert eventuele luchtbellen in de injector tips, en zorgt er ook voor dat er geen verstopping. In het geval van verstopping, is het Hamilton pomp ingesteld op een korte puls dien met een hogere snelheid van 2 pl / min, zachtjes ruimen verstopping. </li><li> De injector array wordt dan verlaagd, door de kleine gaten gemaakt met de 30-gauge naalden, op de juiste Z-diepte. </li><li> 1 pi van het virus wordt geïnjecteerd door iedere injector, bij 0,1 pl / min. </li><li> De injecties worden met rust gelaten gedurende 30 minuten. </li><li> Nadat de injector array is langzaam uit de hersenen, is het Hamilton pomp ingesteld infusie met dezelfde snelheid van 0,1 pl / min, om te controleren op verstopping in elke injector. </li><li> Dan is de injectoren worden gereinigd te hervullen en infunderen van 1,5 ul van ethanol in 2 pl / min. </li><li> Tot slot worden de injectoren gevuld met siliconen olie om de 2 pl bufferzone in elk Hamilton spuit te houden. </li><li> Alle apparatuur moet worden gesteriliseerd voor en na de procedure, op basis van uw instelling bioveiligheid en gebruik van dieren protocollen. </li></ol> 6. Representatieve resultaten De parallelle injector reeks snelheden tot een operatie ongeveer met een factor gelijk aan het aantal van de injectoren, niet meegerekend setup en hersteltijd, hoewel individuele keer zal afhangen van de vaardigheid van de beoefenaar. Voor een 1 microliter injectie, we meestal zagen lentivirus uitdrukking in een sfeer van ongeveer een diameter van 1 mm (fig. 1E). De precisie van de injectie was zodanig dat de variabiliteit in tip positionering, van studie tot studie, was ongeveer 45 micron (standaard afwijking van de afstand tussen het uiteinde positie naar de beoogde top positie). <img src="/files/ftp_upload/1489/1489fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1. Design, implementatie en het gebruik van een parallelle virus injector array. A, schema van het parallelle injector array systeem, met een triple injector configuratie, voor drie gelijktijdige injecties. B, foto van een triple parallel injector reeks zoals schematisch in A . <stRong&gt; C, stereotaxische klem, weergegeven in hoofdlijnen uit de top D, illustratie van de techniek voor een efficiënte, schade-minimaliseren, de opening van gaten in de schedel voor de injector inbrengen in de hersenen:. met een tandartsboor, dun de schedel tot ~ 50 micron dik, gebruik dan de punt van een scherpe naald een kleine craniotomie te openen. E, fluorescentie plaatje channelrhodopsin-2 (ChR2)-GFP-gelabelde cellen in drie muizen corticale gebieden, zoals het doelwit van de drievoudige injector reeks getoond in B.

<ol><li>Chow, B., Han, X., Qian, X., Boyden, E. S. High-performance halorhodopsin variants for improved genetically-targetable optical neural silencing. Frontiers in Systems Neuroscience. 2009 Feburary 26, Slat Lake City, Utah, , Computational and systems neuroscience. (2009).</li>
<li>Bi, A., Cui, J., Ma, Y. P., Olshevskaya, E., Pu, M., Dizhoor, A. M., Pan, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+expression+of+a+microbial-type+rhodopsin+restores+visual+responses+in+mice+with+photoreceptor+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Ectopic expression of a microbial-type rhodopsin restores visual responses in mice with photoreceptor degeneration.</a> Neuron. 50, 23-33 (2006).</li>
<li>Han, X., Qian, X., Bernstein, J., Zhou, H., Franzesi, G., Stern, P., Bronson, R., Graybiel, A., Desimone, R., Boyden, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-Timescale+Optical+Control+of+Neural+Dynamics+in+the+Nonhuman+Primate+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Millisecond-Timescale Optical Control of Neural Dynamics in the Nonhuman Primate Brain.</a> Neuron. 62 (2), 191-198 (2009).</li>
<li>Zhang, F., Wang, L. P., Brauner, M., Liewald, J. F., Kay, K., Watzke, N., Wood, P. G., Bamberg, E., Nagel, G., Gottschalk, A., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+fast+optical+interrogation+of+neural+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry.</a> Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li>
<li>Han, X., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple-color+optical+activation%2C+silencing%2C+and+desynchronization+of+neural+activity%2C+with+single-spike+temporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity, with single-spike temporal resolution.</a> PLoS ONE. 2, e299-e299 (2007).</li>
<li>Szobota, S., Gorostiza, P., Del Bene, F., Wyart, C., Fortin, D. L., Kolstad, K. D., Tulyathan, O., Volgraf, M., Numano, R., Aaron, H. L., Scott, E. K., Kramer, R. H., Flannery, J., Baier, H., Trauner, D., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+control+of+neuronal+activity+with+a+light-gated+glutamate+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Remote control of neuronal activity with a light-gated glutamate receptor.</a> Neuron. 54 (4), 535-545 (2007).</li>
<li>Lima, S. Q., Miesenbock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+control+of+behavior+through+genetically+targeted+photostimulation+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons.</a> Cell. 121 (1), 141-152 (2005).</li>
<li>Zhang, F., Wang, L. P., Boyden, E. S., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2+and+optical+control+of+excitable+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2 and optical control of excitable cells.</a> Nat. Methods. 3, 785-792 (2006).</li>
<li>Ishizuka, T., Kakuda, M., Araki, R., Yawo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+evaluation+of+photosensitivity+in+genetically+engineered+neurons+expressing+green+algae+light-gated+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Kinetic evaluation of photosensitivity in genetically engineered neurons expressing green algae light-gated channels.</a> Neurosci Res. 54 (2), 85-94 (2006).</li>
<li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of neural circuits.</a> Neuron. 57 (5), 634-660 (2008).</li>
</ol>

Alle procedures zijn in overeenstemming met de NIH Gids voor Proefdieren en goedgekeurd door het MIT Dierverzorging en Gebruik en bioveiligheid comites.

In de afgelopen jaren hebben een aantal van genetisch gecodeerde optische sensitizers mogelijk neuronen worden geactiveerd en zwijgen in vivo in een tijdelijk-nauwkeurige wijze, in reactie op korte pulsen van licht (bijv. 1,4,5,6,7,8 , 11). Een van de belangrijkste methode waarmee neuronen zijn gevoelig voor licht in de hersenen van zoogdieren, is via virussen zoals lentivirussen en adeno-geassocieerde virussen (AAV), die kunnen leveren genen die coderen voor opsins aan hersenen van dieren, variërend van muizen tot apen, in een een veilige en duurzame wijze (bijv. 2,9,10). Virussen laten een snellere doorlooptijd doen dan genetische manipulatie, met name voor organismen die geen genetisch model organismen, zoals ratten en apen, en voor opsins in staat kan stellen hoge expressie niveaus die niet mogelijk zijn in transgene scenario&#39;s. Hier laten we zien een parallel injector reeks in staat om, in een snelle tijdschaal &quot;circuit-level genetische manipulatie, &#39;waardoor gehele 3-dimensionale hersenstructuren te viraal worden gericht met een gen, in een enkele chirurgische stap. De injector reeks omvat een of meer verdringerpompen dat elk station een set van spuiten, die elk feeds in een polyimide / fused-silica capillaire via een hoge-druk-tolerant connector. De haarvaten zijn grootte, en vervolgens ingebracht in, de gewenste locaties die door de op maat frezen een stereotactische plaatsing bord, waardoor virussen of andere reagentia te leveren om de gewenste set van hersengebieden. Voor het gebruik van het apparaat, vult de chirurg eerst de vloeibare subsysteem volledig met olie, backfills de haarvaten met het virus, voegt het apparaat in de hersenen, en blaast reagentia langzaam (&lt;0,1 pL / min). Deze technologie zal zorgen voor een breed scala van nieuwe soorten experimenten, zoals de milliseconde-tijdschaal afsluiten van complexe,-vormige structuren (zoals de hippocampus) op precieze momenten in het gedrag, in tijd nauwkeurige inactivatie van bilaterale structuren die redundant kunnen optreden (zoals de linker en rechter amygdala) en de verstoring van meerdere discrete hersengebieden (bijvoorbeeld autorijden twee verbonden gebieden in fase om te bestuderen hoe cross-regio synchroon hangt af van activiteiten in elke regio, of het stimuleren van input voor een regio, terwijl zwijgen een subset van de doelstellingen om te begrijpen welke van de verschillende doelstellingen zijn van cruciaal belang voor het mediëren van de effecten van die ingangen). Voor grote hersenen, zoals die in de primaat, waarin we hebben onlangs aangetoond optische cel-type specifieke neurale activatie 3, storende activiteit in een gedragsmatig-relevante gebied kunnen virale etikettering van grote, complexe structuren nodig hebben. Wij merken op dat parallel injector arrays kunnen worden gebruikt voor bijna elke lading injecteren - drugs, neuromodulatoren, neurotransmitters, of zelfs cellen - in complexe 3-D patronen in de hersenen, in een tijdelijk-nauwkeurig. Tot slot, uit een translatie-standpunt, is het mogelijk dat een snelle, patiënt-customized gentherapie of drug delivery apparaten kunnen snel worden op maat ontworpen en gefabriceerd om individuele hersenen geometrieën overeenkomen, het ondersteunen van nieuwe behandelingen voor een verscheidenheid aan aandoeningen, mogelijk door het gebruik van optische controle moleculen. De injector arrays zijn ontworpen om precies te zijn, zowel ruimtelijk als volumetrisch. In de X-en Y-richting, wordt dit bereikt door het boren van heel nauwkeurig geplaatste gaten met behulp van een goedkope mini-molen, met de gaten net groot genoeg om de injectoren, zodat de injectoren parallel worden gehouden aan elkaar passen, en in een nauwkeurige locatie. In de Z-richting, zijn de injectoren bijgesneden met behulp van een stereotaxische apparaat, waardoor een niveau van precisie gelijk aan die van de stereotaxische operatie zelf. De volumetrische precisie komt voort uit de precisie van de Hamilton pomp, evenals de bijna-zero dead volume-connectors, aangepast van de hoge-druk vloeistofchromatografie (HPLC) veld. De injectoren zijn gemaakt van fused silica capillaire buis, die is sterk en stijf genoeg dat het precieze vorm en de afstand onder druk houdt, zonder dat de grotere wanddikte van alternatieven, zoals staal canules. Kleine wijzigingen kunnen gemakkelijk worden gemaakt om de parallelle injector reeks aan te passen aan een verscheidenheid van experimenten. Bijvoorbeeld, als een kleiner volume van het virus of fijner afstand nodig is, kunnen kleinere capillaire buizen worden gebruikt, samen met een bijbehorende kleinere boor. Toekomstige apparaten kunnen gebruik maken van microfluïdische kanalen en pompen, om het aantal parallelle injectoren te verhogen, om de grootte te minimaliseren (misschien waardoor dergelijke toestellen te worden gemonteerd op de hoofden van vrij bewegende dieren).

<table><tbody><tr><td>Dremel-tool</td><td>Tool</td><td>Dremel</td><td>3956-02</td><td></td></tr><tr><td>Lasersnijder</td><td>Tool</td><td>Universal Laser Systems</td><td>VLS2.30</td><td></td></tr><tr><td>Lijmpistool</td><td>Tool</td><td>Stanley Bostitch</td><td>GR20</td><td></td></tr><tr><td>Injectie-/withdrawalespuitpomp (Hamilton-pomp)</td><td>Tool</td><td>Harvard Apparatus</td><td>702001</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;mu;l Hamilton-spuiten</td><td>Tool</td><td>Hamilton Co</td><td>701N</td><td>Eén nodig per injectieplaats</td></tr><tr><td>Muizenstereotax</td><td>Tool</td><td>Stoelting Co.</td><td>51725D</td><td></td></tr><tr><td>Modela mini-freesmachine</td><td>Tool</td><td>Roland</td><td>MDX-15</td><td></td></tr><tr><td>Boor voor mini-freesmachine met diameter 0,011&quot;</td><td>Tool</td><td>McMaster-Carr</td><td>8915A12</td><td></td></tr><tr><td>Boor voor mini-freesmachine met diameter 1/32&quot;</td><td>Tool</td><td>McMaster-Carr</td><td>8848A35</td><td></td></tr><tr><td>Sneldraaiende tandheelkundige boor</td><td>Tool</td><td>Lynx</td><td>333</td><td></td></tr><tr><td>Accessoires voor tandheelkundige boor</td><td>Tool</td><td>Pearson Assessments</td><td>F 35-08-25 F 35-07-10 P 86-02-38</td><td></td></tr><tr><td> </td><td> </td><td></td><td></td><td> </td></tr><tr><td>Roestvrijstalen canule met buiten diameter (OD) van 1,5 mm</td><td>Materiaal</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>HTX-15R</td><td></td></tr><tr><td>1-72 verbindingssleufkopvijs</td><td>Materiaal</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>MX-0172B</td><td></td></tr><tr><td>1-72 zeskantmoer</td><td>Materiaal</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>HNX-0172</td><td></td></tr><tr><td>PCB proto-board, 1/32&quot; dik</td><td>Materiaal</td><td>Digi-Key</td><td>PC57-T-ND</td><td></td></tr><tr><td>Acrylplaat, 1/8&quot; dik</td><td>Materiaal</td><td>McMaster-Carr</td><td>8560K239</td><td></td></tr><tr><td>HPLC-connectoren</td><td>Materiaal</td><td>Upchurch Scientific</td><td>F-252, P-627, P-200, P-235, F-240 (sommige hiervan kunnen in 10-packs worden gekocht; voeg simpelweg een &amp;#8216;x&amp;rsquo; toe aan het einde van het onderdeelnummer)</td><td>Eén nodig per injectie per locatie, behalve F-252, P-627 en P-235, die kunnen worden hergebruikt</td></tr><tr><td>Gefuseerde silica capillaire buis, OD: 245 &amp;mu;m, ID: 100 &amp;mu;m</td><td>Materiaal</td><td>Polymicro Technologies</td><td>2000022-10M</td><td></td></tr><tr><td>5-minuten universele epoxy</td><td>Materiaal</td><td>Permatex</td><td>84101</td><td>5-minuten universele epoxy</td></tr><tr><td>Polyethyleen buis .066 x .095 inch</td><td>Materiaal</td><td>VWR international</td><td>63018-827</td><td></td></tr></tbody></table>

schaalbare fluïde injector-arrays voor virale targeting van intact 3-d brain circuits

Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

Ons begrip van neurale circuits - zou sterk worden vergemakkelijkt door een technologie voor het snel richten genen om complexe 3 - hoe ze de berekeningen die gebaat gevoel, gedachte, emotie, en actie, en hoe ze zijn beschadigd bij neurologische en psychiatrische stoornissen bemiddelen - dimensionale neurale circuits, waardoor een snelle creatie van &quot;circuit-level transgenen.&quot; We hebben recent ontwikkelde methoden, waarin virussen die coderen voor lichtgevoelige eiwitten kunnen specifieke celtypen gevoelig te milliseconde-tijdschaal activering en silencing in de intacte hersenen. We hier presenteren het ontwerp en de implementatie van een injector reeks staat het leveren van virussen (of andere vloeistoffen) om tientallen gedefinieerde punten in de 3-dimensionale structuur van de hersenen (<strong&gt; Afbeelding. 1A, 1B</strong&gt;). De injector reeks omvat een of meer verdringerpompen dat elk station een set van spuiten, die elk feeds in een polyimide / fused-silica capillaire via een hoge-druk-tolerant connector. De haarvaten zijn grootte, en vervolgens ingebracht in, de gewenste locaties die door de op maat frezen een stereotactische plaatsing bord, waardoor virussen of andere reagentia te leveren om de gewenste set van hersengebieden. Voor het gebruik van het apparaat, vult de chirurg eerst de vloeibare subsysteem volledig met olie, backfills de haarvaten met het virus, voegt het apparaat in de hersenen, en blaast reagentia langzaam (&lt;0,1 microliter / min). De parallelle karakter van de injector-array maakt een snelle, nauwkeurige en robuuste etikettering van volledige neurale circuits met virale ladingen zoals optische sensibilisatoren om licht-activatie en zwijgen van de gedefinieerde hersenen circuits. Samen met andere technologieën, zoals glasvezel-arrays voor het licht leveren om de gewenste sets van hersengebieden, hopen we een toolbox die de systematische indringende van causale neurale functies in de intacte hersenen mogelijk maakt. Deze technologie kan niet alleen open te stellen zulke systematische benaderingen van circuit gerichte neurowetenschappen bij zoogdieren, en vergemakkelijken de etikettering van de hersenen regio&#39;s in grote dieren, zoals niet-menselijke primaten, maar kan ook het openen van een klinisch pad voor translationeel cel-specifieke optische controle protheses , kan die precisie tot een betere behandeling van hardnekkige hersenaandoeningen. Tot slot kunnen dergelijke apparaten zoals hier beschreven te vergemakkelijken precies getimede vloeibare levering van andere payloads, zoals stamcellen en farmacologische stoffen, om drie-dimensionale structuren, in een gemakkelijk te gebruiker aan te passen mode.

Controleren en analyseren van neurale circuits<em&gt; In vivo</em&gt; Zou worden vergemakkelijkt door een technologie voor de levering van virussen en andere reagentia tot de gewenste drie-dimensionale sets van hersengebieden. Tonen we aan op maat vloeibare injector reeks fabricage en levering van viraal-gecodeerde optische sensitizers, waardoor optische manipulatie van complexe hersenen circuits.

Schaalbare fluïde Injector-arrays voor Virale Targeting van Intact 3-D Brain Circuits

Ons begrip van neurale circuits—hoe zij de berekeningen bemiddelen die ten grond liggen aan gewaarwording, gedachte, emotie en actie, en hoe zij worden aangetast ...

Twee rechthoekige stukken acryl worden met een laser gesneden en vervolgens geassembleerd om de stereotactische klem te vormen, die dient om de injectorarray stevig vast te zetten ten opzichte van de stereotactische hulpmiddelen. Een spuitenpomp wordt geladen met spuiten die via polyethyleenslangen zijn verbonden voor een gewenst hersencircuit. Er wordt een freesmachine gebruikt om gaten te boren waardoor gesmolten siliciumdioxide-tubing wordt ingebracht, waardoor de injectoren worden gevormd.De injectoren zijn reversibel gemonteerd in de klem en worden vervolgens getrimd om de gewenste hersencircuits te targeten. Elke injector is verbonden met een enkel polyethyleenkanaal. De voorbereiding van het systeem voor gebruik omvat het vullen van het systeem via de spuiten met siliconenolie en het vervolgens laden van vloeibare reagentia in de injectoren.De parallelinjector wordt vervolgens in de doelgebieden van de hersenen geplaatst en de reagentia worden geïnfuseerd. Hallo, ik ben Stephanie Chan van de Synthetic Neurobiology Group aan MIT. Tot nu toe vereiste het tot expressie brengen van genen in ruimtelijk complexe hersencircuits ofwel de langzame en kostbare creatie van transgene dieren, of het moeizame proces van virale injecties, die één zijde per keer moeten worden uitgevoerd.Vandaag gaan we laten zien hoe u een parallelle injectie-array bouwt en gebruikt die vloeistoffen kan afleveren in complexe driedimensionale patronen in de hersenen. We gebruiken deze array om snel circuitspecifieke transgene muizen te maken door virussen parallel via de set injectoren af te leveren, om zo alle doelen tegelijkertijd te bereiken. Onze injector kan worden gebruikt om elk vloeibaar reagens af te leveren in een complexe distributie van locaties in de hersenen.Ons doel vandaag is om virussen af te leveren die coderen voor lichtgevoelige eiwitten, zodat we specifieke celtypen in specifieke circuits op een temporeel nauwkeurige manier aan en uit kunnen schakelen. In ons laboratorium gebruiken we deze technologie in combinatie met arrays van optische vezels die licht op een circuitspecifieke manier afleveren. Laten we beginnen.Eerst maken we een stereotaxische klem die de injectorenarray vasthoudt en op de stereotax kan worden gemonteerd. Voor het maken van de klem zijn de volgende items nodig: een stalen canule van twee inch met een buitendiameter (OD) van 1,5 millimeter waarvan één uiteinde is platgedrukt, een klein stukje PCB Protoboard van ongeveer 0,5 bij 0,5 centimeter en twee identieke rechthoeken.Voor elk van de twee acrylrechthoeken wordt een stuk van een halve bij drie achtste inch gesneden uit acrylplaat van een achtste inch dik. Snijd twee ronde gaten in tegenovergestelde hoeken. Het eerste gat moet een diameter van 1,5 millimeter hebben en net groot genoeg zijn om de metalen canule stevig vast te houden.Het tweede gat moet een diameter hebben van 1/16 inch. Voer de metalen canule in het gat van 1,5 millimeter van het ene rechthoekje in, vervolgens door het gat van 1,5 millimeter van het tweede rechthoekje; richt het onderste uiteinde van de canule uit met het onderste vlak van het onderste rechthoekje om de vorm van een hockeystick te creëren, en plaats de spacer tussen de twee rechthoekjes. Boetseerklei is handig om de onderdelen tijdens dit proces bij elkaar te houden, terwijl de spacer stevig tussen de twee rechthoekjes wordt geklemd.Bevestig deze structuur door heette lijm rond de canule en de gaten van 1,5 millimeter aan te brengen. Zorg ervoor dat de spacer niet aan de rechthoeken vastplakt nadat de lijm in het midden is gedroogd. Plaats een 1-72 zeskantmoer over het gat van 1/16 inch en draai vervolgens een 1-72 schroef vanaf de tegenovergestelde zijde van de rechthoeken vast.Breng kleine hoeveelheden vijfminuten-epoxy aan rond de randen van de moer om deze aan de rechthoek te bevestigen. Zorg ervoor dat de epoxy niet in de schroefdraad van de moer of de schroef terechtkomt. Zodra de epoxy is uitgehard, plaatst u een 1 72 schroef in het gat van 1/16 inch aan de bovenzijde van de rechthoeken en draait u deze vast in de moer.Verwijder de boetserklei en bevestig dat de afstandhouder stevig op zijn plaats kan worden gehouden door de schroef aan te draaien. Het injectiesysteem kan worden aangepast aan vrijwel elke set coördinaten in de hersenen. Lokaliseer eerst de coördinaten van de gewenste injectieplaatsen in een hersenatlas van de betreffende soort en reken deze om naar de juiste coördinaten die door de stereotaxische apparatuur worden gebruikt.In deze demonstratie gebruiken we een muis en zullen er drie injectieplaatsen zijn, en dus zullen er drie buisjes voor injectoren zijn. De X-, y- en Z-coördinaten zullen overeenkomen met de mediaal-laterale, anterieure, posterieure en/of ventrale coördinaten van een muizenbreinatlas. Plaats vervolgens drie Hamilton-spuiten van 10 µL in een injectie- en onttrekkingsspuitenpomp, zoals deze van Harvard Apparatus; bevestig stevig stukken polyethyleenbuis van drie voet aan de naald van elke Hamilton-spuit voor elk stuk polyethyleenbuis.Schuif een F 2 52 buisomhuls over het open uiteinde en bevestig deze aan een P 6 27 buisadapter met de P 2 35 moer en P 200 fal. Gebruik voor de constructie van de aangepaste injectie-array een modela mini mill en een boor met een diameter van 0,011 inch om drie gaten te boren in een PCB-protoboard met een dikte van 1/32 inch. Boor de drie gaten volgens de relatieve X- en Y-coördinaten van de injectieplaatsen en boor, voordat de plaat uit de freesmachine wordt gehaald, een rechthoek rond de kleine gaten met een boor met een diameter van 1/32 inch.Vervolgens worden de individuele injectoren tot halverwege in elk gat gestoken, zodat ze stevig vastzitten en parallel aan elkaar staan. Fixeer ze met epoxy aan de plaat om de injectorarray te vormen. Bevestig vervolgens de injectorarray aan de stereotaxische klem.Plaats één hoek van de protoboard tussen de acrylrechthoeken en draai de schroef van de stereotaxische klem vast. Bevestig daarna de metalen canule van de klem aan de stereotax door gebruik te maken van het bevestigingsmechanisme van de stereotax. De volgende stappen worden onder een microscoop uitgevoerd voor een van de buitenste injectoren die vanaf de zijkant met een rechte rand kan worden bereikt zonder de andere injectoren te raken.Knip het deel af dat onder de onderkant van de protoboard uitsteekt. Maak de punt vlak met een Dremel-tool. Kies vervolgens een stabiel referentiepunt binnen het bereik van de stereotaxische arm en verplaats de injectorarray zodat de afgeplatte punt van de buitenste injector zich op dit referentiepunt bevindt.Kies een tweede injector samen met de bijbehorende coördinaten. Verplaats de injectorarray langs de Z-as met het relatieve verschil in hoogte of Z-richting tussen de coördinaten van de eerste en tweede injector. Trim deze tweede injector zodat de punt zich nu op de hoogte van het referentiepunt bevindt en vlak deze af met een Dremel-gereedschap.De injectorarray kan in de X- en Y-richting worden verplaatst om de vergelijking van de injectorpunt met het referentiepunt te vergemakkelijken. Nadat dit trimproces voor de resterende injectoren is herhaald, is de injectorarray klaar voor assemblage in het volledige systeem. Voor de assemblage van het volledige systeem zijn de eerder geconstrueerde stereotactische klem en de aangepaste injectorarray vereist.Nadat de injectorarray is gesteriliseerd, schuift u het uiteinde van elke injector dat niet is afgeknipt, in een blauwe F two 40 buisestut. Bevestig met een P 2 35 moer en P 200 ferrule het achterste uiteinde van de injector aan de geschroefde adapter die reeds via polyethyleenbuisjes met de Hamilton-pomp is verbonden. Injecteer met een naald van 27 gauge steriele siliconenolie in de achterzijde van de Hamilton-spuiten, zodat het gehele systeem van de Hamilton-spuiten tot aan de injectortips is gevuld.Zorg ervoor dat er absoluut geen luchtbellen ontstaan, anders zal het geïnjecteerde virusvolume onjuist zijn of kan het virus helemaal niet worden geïnjecteerd. Bij het plaatsen van de Hamilton-spuiten in de Hamilton-pomp wordt het maximaal mogelijke volume siliconenolie in de spuiten behouden. Indien het experiment meer dan twee spuiten vereist, kunnen er afstandshouders in de Hamilton-pomp worden geplaatst, zoals wij hier hebben gedaan.Als alternatief kan een multi-rack upgradekit worden gekocht bij Harvard Apparatus om tot 10 spuiten tegelijkertijd vast te houden. Om het virus in de hersenen van de muis te injecteren, begint u met het toedienen van pijnstillers volgens uw dierenprotocol. Plaats de geanestheseerde muis in het stereotactische frame en bevestig via een knijptest bij de teen of het dier voldoende geanestheseerd is.Maak vervolgens een enkele incisie langs de middellijn van de huid, van tussen de ogen tot tussen de oren. Trek de huid terug om de schedel bloot te leggen en verwijder het fascia. Bevestig een getrokken glazen pipet aan het stereomicroscoop.Pas de posities van de oorstaven aan totdat bgma en lambda op dezelfde hoogte zijn uitgelijnd en de lijn die hen verbindt parallel loopt aan de Y-as van het stereotaxisch frame. Zet het stereotaxisch frame op nul met de punt van de glazen pipet op bgma, en positioneer vervolgens de punt iets boven de schedel op de x- en Y-coördinaten van een van de injectieplaatsen. Boor met een tandartsboor voorzichtig door de schedel onder de punt tot er een extreem dunne botlaag overblijft; verwijder met een naald van 30 gauge vervolgens voorzichtig een klein stukje van deze laag op de juiste x- en y-coördinaten om de dura mater bloot te leggen.Dit gat moet net groot genoeg zijn om een van de injectoren op deze manier te passen. Kleine gaten van 0,25 millimeter breed worden in de schedel gemaakt op de x- en y-coördinaten die overeenkomen met elke injectieplaats. Na voltooiing van het boren wordt de glazen uitlijningspipet weggegooid en wordt de aangepaste injectorarray met de stereotaxische klem aan de stereotax bevestigd.Om de hoek van de injectorarray correct in te stellen, kiest u twee buitenste injectoren die gekalibreerd moeten worden ten opzichte van een bepaald referentiepunt. Nadat één van de injectoren met het referentiepunt is gelijkgesteld, worden de relatieve X- en Y-afstanden tussen de injectieplaatsen van deze injector en elkaar bepaald. Verplaats de injectorarray in de x- en y-richting over deze relatieve afstanden. Als de tweede injector niet is uitgelijnd met het referentiepunt, wordt de metalen canule losgemaakt en gedraaid.Herhaal dit proces iteratief totdat de injectorenarray correct is geplaatst. Stel de vulsnelheid van de Hamilton-pomp in op 1 µL per minuut en vul de injectoren bij met siliconenolie totdat de spuiten het punt van 2 µL of meer hebben bereikt. Dit biedt een buffervoegsel aan olie, zodat eventuele luchtbellen of verstoppingen in de tip eenvoudig kunnen worden verwijderd door olie vooruit te duwen met de Hamilton-pomp, zonder dat het volledige systeem opnieuw met siliconenolie vanaf de achterzijde van de spuiten gevuld hoeft te worden zoals eerder beschreven.Plaats een schoon stuk parafilm op de schedel en laat de injectoren voorzichtig op de parafilm zakken. Indien er één microliter virus per locatie moet worden toegediend, pipetteer dan 1,5 microliter virus op de parafilm voor elke locatie, met dezelfde vullingssnelheid van één microliter per minuut. Vul 1,2 microliters van het virus in elke injector.Stel de punt van de langste injector af op nul bij bgma en verschuif vervolgens de injectorarray naar de x- en Y-coördinaten van die injector. Laat de injectorarray door de kleine gaatjes die met de 30 gauge naalden zijn gemaakt, zakken om de Z-diepte te corrigeren. Injecteer één microliter virus via elke injector met een snelheid van 0,1 microliter per minuut of langzamer.Laat de injecties 30 minuten ongemoeid zodat deze kunnen diffunderen. Trek na 30 minuten de injector-array langzaam uit de hersenen. Stel vervolgens de Hamilton-pomp in om te infuseren met dezelfde snelheid van 0,1 µL per minuut om elke injector op verstoppingen te controleren.Reinig daarna de injectoren door twee µL ethanol in te vullen en te infuseren met een snelheid van twee µL per minuut. Vul de injectoren tot slot opnieuw met siliconenolie om de bufferzone van twee µL in elke Hamilton-spuit te behouden. Deze figuur toont het resultaat van het gebruik van de zojuist getoonde injectorenarray met drie canulemakers om virale reagentia af te leveren in verspreide delen van het muizenbrein.In dit geval bevat de genetische payload van het virus het fluorescerende molecuul GFP, wat resulteert in drie fluorescerende volumes gelabelde cellen die in één stap zijn gelabeld. In principe kan een willekeurig aantal canules worden gebruikt om een virusinjectie-array op te bouwen. Hier is bijvoorbeeld een injectie-array die geschikt is voor bilaterale targeting van ca 1 van de hippocampus met 16 injectoren.Met behulp van het protocol dat we u vandaag hebben laten zien, kunt u een virus in een driedimensionaal patroon in de hersenen afleveren, waardoor u effectief transgenetica op circuitniveau creëert. Daarnaast kan de parallelle injectorarray worden gebruikt om elk vloeibaar reagens in de hersenen af te leveren, wat bijvoorbeeld mogelijk maakt dat dopaminerge agonisten in een patroon worden toegediend aan specifieke neurale circuits in een gefixeerd, behandelde proefdier. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

scalable-fluidic-injector-arrays-for-viral-targeting-intact-3-d-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

In dit artikel tonen we een methode om glazen capillaire naalden te maken met een 50-um lumen. Deze techniek vermindert de schade aan de hersenen, minimaliseert passieve diffusie van geneesmiddelen en maakt een nauwkeurige targeting naar de knaagdieren hersenen.

Targeting van Deep Brain Structuren met micro-injecties voor de levering van drugs, virale vectoren, of Cell Transplantaties

Hier presenteren we de intracraniële injectie van AAV-vectoren voor TL-etikettering van neuronen en glia in de visuele cortex.

Intracraniële Injectie van adeno-geassocieerde virale vectoren

Source: Pereira, M. et. al., In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates stereotaxic injection of an adeno-associated virus into the cerebral cortex of a transgenic mouse to deliver Cre-dependent neuronal reprogramming and fluorescent reporter genes into glial cells.

Stereotaxic Injection of Viral Vectors for Glial Cell Reprogramming in a Mouse Model

Hier demonstreren we een techniek voor wijdverspreide neuronale transductie door intraventriculaire injectie van adeno-geassocieerd virus in de neonatale muisbrein. Deze methode biedt een snelle en eenvoudige manier om levenslange expressie van vireel aangeboden transgenen te bereiken.

Intracerebroventriculaire Viral Injectie van de Neonatale Mouse Brain voor persistent en wijdverbreide Neuronale Transduction

De hersenen is een unieke site met eigenschappen die niet goed weergegeven door in vitro of ectopische analyses. Orthotopische muismodellen met reproduceerbare ligging en groei-eigenschappen op betrouwbare wijze kan worden gemaakt met intracraniële injecties met een stereotaxisch fixatie instrument en een lage druk spuit pomp.

Creëren Anatomisch nauwkeurige en reproduceerbare Intracranial Xenograften van Human hersentumoren

De CRISPR / Cas9 systeem biedt de mogelijkheid om gerichte genoom bewerken toegankelijk en betaalbaar voor de wetenschappelijke gemeenschap. Dit protocol is bedoeld om te demonstreren hoe virussen die een gen van belang met behulp van de CRISPR / Cas9 systeem zal knock-out, en dan injecteren ze stereotaxically in de volwassen hersenen van muizen te creëren.

Ontwerpen, Verpakkingen en Levering van hoge titer CRISPR Retro en Lentivirussen via Stereotaxische Injection

Hier demonstreren we magnetische resonantie (MR)-geleide convectie verbeterde levering (CED) van virale vectoren in de cortex als een efficiënte en vereenvoudigde aanpak voor het bereiken van optogenetische expressie in grote corticale gebieden in de makaak hersenen.

Convectie verbeterde levering van Optogenetische adeno-geassocieerde virale vector aan de cortex van rhesus macaque onder begeleiding van online MRI-beelden

Hier wordt een stereotactische procedure beschreven die zich kan richten op uitdagende en moeilijk bereikbare hersengebieden (vanwege ruimtelijke beperkingen) met behulp van een schuine coronale benadering. Dit protocol is aanpasbaar aan zowel muis- als rattenmodellen en kan worden toegepast op diverse neurowetenschappelijke toepassingen, waaronder canule-implantatie en micro-injecties van virale constructies.

Aanpasbare schuine stereotactische benadering voor veelzijdige neurowetenschappelijke technieken

Dit protocol toont het gebruik van een robotplatform voor micro-injectie in enkele neurale stamcellen en neuronen in hersenschijfjes. Deze techniek is veelzijdig en biedt een methode om cellen te volgen in weefsel met een hoge ruimtelijke resolutie.

Manipulatie van enkele neurale stamcellen en neuronen in hersenschijfjes met behulp van roboticamicroïsjectie

Zoals momenteel geïmplementeerd, vereist optogenetica bij niet-menselijke primaten injectie van virale vectoren in de hersenen. Een optimale injectiemethode moet betrouwbaar zijn en, voor veel toepassingen, in staat zijn om individuele locaties van willekeurige diepte te targeten die gemakkelijk en ondubbelzinnig worden geïdentificeerd in de postmortale histologie. Een injectiemethode met deze eigenschappen wordt gepresenteerd.

Injecties van AAV-vectoren voor optogenetica in verdoofde en wakkere zich gedragende niet-menselijke primatenhersenen

Miniscope in vivo calcium imaging is een krachtige techniek om neuronale dynamica en microcircuits te bestuderen in vrij gedragende muizen. Dit protocol beschrijft het uitvoeren van hersenoperaties om goede in vivo calciumbeeldvorming te bereiken met behulp van een miniscoop.

Stereotaxische virale injectie en gradiënt-index lensimplantatie voor diepe hersenen in vivo calciumbeeldvorming

Leer hoe je een parallelle injectie-array bouwt voor efficiënte virale levering aan meerdere hersengebieden tegelijk. Deze methode maakt optische manipulatie van neurale circuits in vivo mogelijk.

Schaalbare fluïde Injector-arrays voor Virale Targeting van Intact 3-D Brain Circuits

Meer video's verkennen