Name: In vivo beeldvorming van Deep Corticale lagen met behulp van een microprisma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-27T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Leer diepe beeldvorming van de muisneocortex met microprisma's voor neurobiologisch onderzoek. Deze techniek maakt gelijktijdige visualisatie van alle zes corticale lagen mogelijk met hoge resolutie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Anthony J. Koleske, PhD voor het verstrekken van YFP muizen.

Deel 1: microprisma Optiek en Microscoop Setup <ol><li> De microprisma die we gebruiken zijn 1-mm, rechts-angle prisma&#39;s gemaakt van BK7 glas gekocht bij de Optosigma Corporation (figuur 1). Microprisma worden afgehandeld met behulp van een tang waar mogelijk. </li><li> De schuine zijde van de microprisma is bedekt met verbeterde zilver tot een reflectie van meer dan 97% leveren 400 tot 2000 nm. Dit zorgt voor interne reflectie van zowel de laser-excitatie licht en de uitgezonden fluorescentie. </li><li> Microprisma worden altijd afgehandeld met behulp van een tang waar mogelijk. Handschoenen worden gedragen te allen tijde te houden het prisma schoon te maken. </li><li> We maken gebruik van een custom-built twee-foton microscoop die kleine dieren beeldvorming. Het dier, verbonden aan de stereotactische apparaat is geplaatst op een 3-assige gemotoriseerde podium. </li><li> De microscoop wordt aangesloten op een Windows-pc waarop scanimage software. Scanimage is beeldacquisitie software geschreven in Matlab door Pologruto et al. 1. </li><li> Voor microprisma imaging, verzamelen we beelden met een resolutie van 1024 x 1024 of 512 x 512 pixels. Daarnaast hebben we meestal te scannen op 2 ms / lijn of 4 ms / lijn. </li><li> Twee soorten doelstellingen worden gebruikt in de experimenten: <ul><li> Een lagere numerieke apertuur (NA) lucht doelstelling voor breed veld-of-view beeldvorming (zie tabel van de reagentia en apparatuur). </li><li> Een hogere NA lucht doelstelling met een glas correctie halsband staat het minimaliseren sferische aberraties veroorzaakt door 0 - 2 mm van glas (zie tabel van de reagentia en apparatuur). </li></ul></li><li> Als het dier klaar is voor beeldvorming onder een lage vergroting doelstelling af te stemmen op het plein raster scan patroon van de laser met de bovenkant van de microprisma. Dit zal helpen oriënteren het beeld en maken efficiënt gebruik van het laservermogen. </li><li> Met behulp van een hogere NA objectief met een glas correctie halsband, stelt de correctie halsband om te corrigeren voor ongeveer 1 mm van glas. Zodra een tl-beeld tijdens het experiment, kan men voorzichtig te bereiken binnen de microscoop om de correctie kraag te optimaliseren om de beeldvorming resolutie te maximaliseren. </li></ol> Deel 2: Niet-overleving Animal Chirurgie en microprisma Insertion <ol><li> De gehele procedure lengte, vanaf de eerste incisie tot de voltooiing van de beeldvorming, hangt af van de doelstellingen van het experiment. Echter, de niet-overleving chirurgische ingreep en microprisma plaatsing naar verwachting ongeveer 30 nemen - 40 minuten in beslag. </li><li> Muizen (P30-P60) worden gewogen en verdoofd juiste gebruik van een IP-injectie van ketamine (100 mg / kg) en xylazine (10 mg / kg) om een ​​vliegtuig geschikt is voor chirurgische ingrepen. </li><li> Gedurende het hele experiment, moet het dier worden gecontroleerd elke 15-20 minuten tot het niveau van anesthesie te beoordelen. Als het dier reageert op een stevige teen-snuifje, een aanvullende dosis van ketamine / xylazine is vereist. Typisch een aanvullende dosis is een derde van de eerste dosis en kan van tevoren worden bereid in een spuit voor onmiddellijke IP-injectie indien nodig. </li><li> Zodra de muis is goed verdoofd, is het merendeel van de haren op het hoofd van het dier geschoren uitschakelen met behulp van een trimmer met een # 40 mes. </li><li> Nair ® wordt toegepast op de resterende haren op het hoofd om te helpen creëren van een oppervlak vrij is van haren die in de weg van de microprisma tijdens de beeldvorming. Na 5 minuten wordt het Nair ® schoongemaakt met behulp van een wattenstaafje. </li><li> De verdoofde dier goed is geplaatst in een muis stereotactische apparaat. Tijdens de chirurgische procedures en imaging-sessies het dier wordt gehouden op een met water gevulde verwarming pad ingesteld op 36 graden Celsius. </li><li> Met het hoofd van het dier correct is bevestigd op zijn plaats, is een schoon incisie gemaakt met behulp van een scalpel beneden de mediale lijn van de schedel om de huid te scheiden. </li><li> Een kleine hoeveelheid van 3% waterstof peroxide is geplaatst op een wattenstaafje en toegepast op de schedel op te ruimen membranen tussen de schedel en de huid. </li><li> De waterstof peroxide helpt ook te onthullen bregma, een belangrijke mijlpaal in het weten waar de craniotomie uit te voeren en steek de microprisma. </li><li> Voordat de craniotomie wordt gestart, zijn het oor bars en bijten bar goed is afgesteld om de blootgestelde schedel, zodanig dat het in principe ter hoogte van de tafel kantelen. Dit zorgt voor een beter platform voor de craniotomie. Daarnaast, dit maakt de bovenkant van het prisma loodrecht met het binnenkomende excitatie licht. Dit zal helpen minimaliseren optische aberraties terwijl de beeldvorming. </li><li> Een kleine tandheelkundige braam (~ 0.8 mm grootte van het hoofd) is verbonden met een Dremel ® gereedschap met een flexibele extensie arm. Voor craniotomies, stellen we de snelheid op ongeveer 7.000 tot 10.000 rpm. </li><li> De tandheelkundige braam wordt afgeroomd langs de schedelbasis uit elkaar totdat een vierkante groef is gevestigd in het bot. De zijkanten van het plein zijn ongeveer 2-3 mm in de lengte en het midden 1,5 mm staart en 1 mm lateraal van bregma. </li><li> Voortzetting van dunner het bot tot een kleine opening wordt gemaakt door de schedel. Een paar pincetten can lift het bot flap weg van de schedel. </li><li> De dura moet worden verwijderd voordat de microprisma kan worden ingevoegd in de cortex. Bloeden is best gecontroleerd door het bloed te laten stollen op het oppervlak gedurende enkele minuten. Daarna is het gestold bloed verwijderd met behulp van een chirurgische spons voordat u de microprisma. </li><li> Om u te helpen te helpen de uitlijning van het prisma met de cortex, de verticale gezicht van de microprisma rij parallel aan de handgrepen van de tang. </li><li> Met de prisma goed gehouden, is de hele microprisma ingebracht tot aan de top van het prisma is gelijk met de neocorticale oppervlak. </li><li> Bij het correct is geplaatst, moet de microprisma blijven in de juiste positie. Het bloeden dat de resultaten minimaal is en kan worden geabsorbeerd met een kleine chirurgische spons. Zodra het prisma op zijn plaats is het dier klaar is voor de beeldvorming. </li><li> Na een microprisma is gebruikt in een dier, kan het worden hergebruikt meerdere malen. Dit betekent echter moeten goed worden gereinigd om alle resterende biologisch materiaal te verwijderen. Dit kan worden bereikt door het dompelen van de prisma in een klein volume HCl zuur, gevolgd door een duik in methanol. De gereinigde microprisma kan vervolgens worden verpakt in lens papier tot toekomstig gebruik. </li></ol> Deel 3: representatieve resultaten <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1: Beelden van de rechter hoek microprisma. Prisma&#39;s gebruikt in dit experiment zijn een millimeter, BK7 glazen prisma&#39;s met een grotere zilveren coating op de hypotenusa tot interne reflectie van de excitatie en emissie licht mogelijk te maken. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig2.jpg" alt="Figuur 2" /> Figuur 2: Afbeelding van laag V YFP piramidale neuronen. Breed veld-of-view beeldvorming met de microprisma onthult een grote populatie van piramidaal cellichamen ~ 800 tot 900 micrometer diep uit de corticale oppervlak. Daarnaast, apicale dendrieten omhoog naar laag te breiden Ik kan ook worden opgelost. Schaalbalk = 200 micrometer. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig3.jpg" alt="Figuur 3" /> Figuur 3: Een hogere numerieke apertuur objectief gebruikt in combinatie met de microprisma biedt ruimtelijke resolutie voldoende om dendritische stekels op de apicale dendrieten op laag V piramidale neuronen op te lossen. Schaalbalk = 10 micrometer. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig4.jpg" alt="Figuur 4" /> Figuur 4: Een beeld verkregen met behulp van de microprisma en een staart-ader injectie van fluorescente kleurstof. Het beeld toont de verticale, groot kaliber schepen dat zich uitstrekt van diepe hersenstimulatie gebieden en kleinere haarvaten af ​​door middel van de corticale volume vertakking. Schaalbalk = 200 micrometer. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig5.jpg" alt="Figuur 5" /> Figuur 5: Het gebruik van een hogere numerieke apertuur doelstelling, kan het netwerk van haarvaatjes in de neocortex worden afgebeeld met meer detail. Schaalbalk = 50 pm. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig6.jpg" alt="Figuur 6" /> Figuur 6: microprisma maakt het ook mogelijk voor het afbeelden van rode bloedcellen (RBC&#39;s) die door schepen. RBC niet absorberen de fluorescente kleurstof en dus worden gezien als donkere strepen over het schip. Door line-scanning in het vat, kan men verkrijgen metingen van RBC flux en snelheid. Schaalbalk = 10 micrometer (horizontale balk in boven-en onderste afbeelding) en 250 ms (verticale balk in het onderste afbeelding).

<ol><li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScanImage%3A+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Eng+Online%22%5BJournal%5D)">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomed Eng Online. 2, 13-13 (2003).</li>
<li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-41 (2000).</li>
<li>Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuations+and+stimulus-induced+changes+in+blood+flow+observed+in+individual+capillaries+in+layers+2+through+4+of+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15741-15741 (1998).</li>
</ol>

Experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door IACUC Yale University&#39;s in te stellen.

Met behulp van een microprisma in een imaging experiment is betrekkelijk eenvoudig en biedt vele voordelen voor in vivo studies over de neocortex. Representatieve voorbeelden met behulp van deze techniek zijn foto&#39;s genomen van transgene muizen die geel fluorescerend eiwit in laag V corticale neuronen. Met behulp van microprisma ziet men een verzameling van grote piramidale cellichamen in laag V, bijna 1 mm onder het corticale oppervlak. Ook gezien zijn de apicale dendrieten, dat door alle oppervlakkige lagen verlen...

<table><tbody><tr><td>Met verbeterde zilveren reflecterende coating-(R77)</td><td>OptoSigma Corp. (Santa Ana, CA)</td><td>055-0010</td><td>Met verbeterde zilveren reflecterende coating-(R77)</td></tr><tr><td>Fluoresceïne-dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD70</td><td>70 kDa </td></tr><tr><td>0.28 NA, 4x luchtobjectief</td><td>Olympus Corporation</td><td>XLFLUOR 4x/340</td><td></td></tr><tr><td>0.60 NA, 40x luchtobjectief</td><td>Olympus Corporation</td><td>LUCPLFLN</td><td>Met 0-2 mm dekglascorrectie</td></tr></tbody></table>

in vivo beeldvorming van deep corticale lagen met behulp van een microprisma

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

We presenteren een protocol voor in vivo beeldvorming van corticale weefsel met behulp van een deep-brain imaging sonde in de vorm van een microprisma. Microprisma zijn 1-mm groot en hebben een reflecterende coating op de hypotenusa tot interne reflectie van de excitatie en emissie licht mogelijk te maken. De microprisma sonde tegelijkertijd beelden meerdere corticale lagen met een perspectief meestal alleen gezien in slice preparaten. Beelden worden verzameld met een groot veld-of-view (~ 900 um). Daarnaast geven we informatie over de niet-chirurgische ingreep te overleven en de microscoop setup. Representatieve resultaten bevatten afbeeldingen van laag V piramidale neuronen van Thy-1 YFP-H muizen tonen hun apicale dendrieten zich uitstrekt door de oppervlakkige corticale laag en zich uitstrekt tot in bosjes. Resolutie was voldoende om de afbeelding dendritische spines de buurt van de soma van laag V neuronen. Een staart-veneuze injectie van fluorescente kleurstof onthult de ingewikkelde netwerk van bloedvaten in de cortex. Line-scanning van de rode bloedcellen (RBC&#39;s) die door de haarvaten onthult RBC snelheid en de flux tarieven kunnen worden verkregen. Deze roman microprisma probe is een elegant, maar krachtige nieuwe manier van visualiseren van diepe cellulaire structuren en corticale functie in vivo.

Haakse microprisma ingebracht in de muis neocortex maakt diepe beeldvorming van meerdere corticale lagen met een standpunt typisch gevonden in slice. One-millimeter microprisma bieden een breed veld-of-view (~ 900 um) en ruimtelijke resoluties voldoende om dendritische spines op te lossen. We demonstreren laag V neuronale beeldvorming en neocorticale vasculaire beeldvorming met behulp van microprisma.

In vivo beeldvorming van Deep Corticale lagen met behulp van een microprisma

Wij presenteren een protocol voor in vivo beeldvorming van corticaal weefsel met behulp van een deep-brain beeldvormingsprobe in de vorm van een microprisma. Microprisma's hebben een grootte van 1 mm ...

Fluorescentiemicroscopie-technieken hebben een beperkte capaciteit om structuren diep in weefsel in beeld te brengen, vooral in materialen met een hoge lichtverstrooiing zoals hersenweefsel. Zelfs bij tweefotonmicroscopie kan het zeer moeilijk zijn om in vivo beelden van hoge kwaliteit te verkrijgen van neurale structuren die zich dieper dan 500 microns onder het neocorticale oppervlak bevinden. Hier geeft de groene lijn een diepte van 500 microns aan.Over het algemeen bevinden de neocorticale lagen vier, vijf en zes zich op een afstand van meer dan 500 microns van het oppervlak. We zullen laten zien hoe een glazen microprisma van één millimeter dat in de neocortex wordt ingebracht, licht naar de oppervlakkige en diepe corticale lagen kan leiden en daaruit kan terugsturen. Door deze techniek bij een muis toe te passen, is het mogelijk om een gezichtsveld van één millimeter te hebben en alle zes de corticale lagen gelijktijdig te visualiseren vanuit een beeldperspectief dat gewoonlijk alleen bij gesneden hersenweefsel wordt aangetroffen.Microprisma's bieden een breed gezichtsveld waarmee de cellichamen van parametale cellen in laag vijf, met hun lange apicale dendrieten, en het comp

in-vivo-imaging-of-deep-cortical-layers-using-a-microprism

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Om te begrijpen netwerk dynamiek van microcircuits in de neocortex, is het essentieel om tegelijkertijd op te nemen van de activiteit van een groot aantal neuronen. In-vivo twee-foton calcium beeldvorming is de enige methode die het mogelijk maakt een op te nemen van de activiteit van een dichte neuronale populatie met single-cell resolutie.

In vivo 2-Photon Imaging Calcium in Layer 2 / 3 van Muizen

In deze video en aanvullende materialen, tonen we een protocol voor...

Chronische Imaging van de muis visuele cortex met behulp van een verdunde-schedel Voorbereiding

Ervaring-afhankelijke moleculaire veranderingen in neuronen zijn essentieel voor het vermogen van de hersenen aan te passen als reactie op gedrags-uitdagingen.

In vivo twee-foton beeldvorming van ervaring-afhankelijke moleculaire veranderingen in corticale neuronen

Time-lapse beeldvorming in het levende dier levert waardevolle informatie over structurele reorganisatie in de intacte hersenen. Hier introduceren we een voorbereiding met een verdunde schedel die transcraniële beeldvorming mogelijk maakt van fluorescent gelabelde synaptische structuren in de levende muizencortex door middel van twee-foton microscopie.

Twee-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging van vertakte stekels in de Mouse Cortex met een uitgedunde schedel Voorbereiding

Hier presenteren we een procedure voor het uitvoeren van grootschalig Ca 2+ beeldvorming met cellulaire resolutie over meerdere corticale lagen in vrij bewegende muizen. Honderden actieve cellen kunnen tegelijkertijd worden waargenomen met behulp van een miniatuur kop microscoop gekoppeld met een geïmplanteerde prisma sonde.

Multi-layer Cortical Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Beeldvorming in vrij bewegende muizen met prisma sonde en geminiaturiseerde fluorescentiemicroscopie

Hier beschrijven we een procedure voor het weefsel wissen, fluorescerende benoemen, en grootschalige beeldvorming van muis hersenweefsel, waardoor, zodat, visualisatie van de driedimensionale organisatie van celtypes in de neocortex.

Grootschalige driedimensionale beeldvorming van cellulaire organisatie in de Neocortex muis

We presenteren een in vivo twee-foton imaging protocol voor beeldvorming van de hersenschors van neonatale muizen. Deze methode is geschikt voor het analyseren van de ontwikkelingstoxiciteit dynamiek van corticale neuronen, de moleculaire mechanismen waarmee de neuronale dynamiek, en de veranderingen in de dynamiek van de neuronale in ziekte modellen.

In Vivo Twee-foton beeldvorming van corticale neuronen in neonatale muizen

Dit artikel beschrijft een methode voor chronische in vivo observatie van de rustende microglia in de hippocampus CA1 van de muis met behulp van nauwkeurig gecontroleerde chirurgie en twee-fotonenmicroscopie.

In Vivo Chronische twee-foton beeldvorming van microglia in de hippocampus van de muis

Wanneer geïntegreerd met een kopplaat en een optisch ontwerp dat compatibel is met zowel enkelvoudige als twee-fotonmicroscopen, biedt de microprismalens een aanzienlijk voordeel bij het meten van neurale reacties in een verticale kolom onder verschillende omstandigheden, waaronder goed gecontroleerde experimenten in hoofdvaste toestanden of natuurlijke gedragstaken bij vrij bewegende dieren.

Langetermijnbeeldvorming van geïdentificeerde neurale populaties met behulp van microprisma's in vrij bewegende en met het hoofd gefixeerde dieren

Dit protocol bevat een grondige beschrijving van een stapsgewijze aanpak voor een chronisch craniaal venster- en microvasculaire emboliemodel van een muismodel, geoptimaliseerd voor in vivo tweefotonmicroscopie met fluorescerende polystyreenmicrosferen.

Microvasculaire embolisme Muizenmodel voor in vivo tweefotonmicroscopie met fluorescerende polystyreenmicrosferen

Dit protocol beschrijft in vivo calciumbeeldvorming van hypothalamische neuronen met behulp van een miniaturiseerde microscoop (miniscoop) bij vrij handelende muizen tijdens sociale toestandmanipulatie (sociale isolatie en sociale hereniging). Deze methode maakt beeldvorming mogelijk met enkelneuronresolutie van de hypothalamische activiteit die sociale behoefte en sociale verzadiging vertegenwoordigt, waardoor mechanistische studies van sociale homeostase mogelijk zijn.

In Vivo Calciumbeeldvorming met een miniaturiseerde microscoop in de hypothalamus om sociale gedragingen bij muizen te begrijpen

Leer diepe beeldvorming van de muisneocortex met microprisma's voor neurobiologisch onderzoek. Deze techniek maakt gelijktijdige visualisatie van alle zes corticale lagen mogelijk met hoge resolutie.

In vivo beeldvorming van Deep Corticale lagen met behulp van een microprisma

Meer video's verkennen