Een kwantitatieve beoordeling van de gist Lipidome met behulp van electrospray ionisatie massaspectrometrie

Dit protocol stelt iemand in staat om snel de belangrijkste componenten van het lipidendo van gist te analyseren. Het begint met het oogsten en wassen van gistcellen. De gewassen cellen worden geplaatst in een mix van één tot twee chloroform en methanol, en gelyseerd met glazen kralen.

Door toevoeging van chloroform en water worden de twee fasen gescheiden. De organische fase wordt verzameld, gedroogd en het lipidenfilm wordt vervolgens opgelost in chloroform voor opslag vóór massaspectroscopie. De geëxtraheerde lipiden worden verdund in chloroform en methanol met ammoniumhydroxide en een mix van interne standaarden wordt toegevoegd.

De lipidenoplossing kan nu rechtstreeks in de massaspectrometer worden geïnjecteerd. Hallo, ik ben Simon Bork van het laboratorium van Vladimir Teco aan het Departement Biologie van de Concordia University. Vandaag ga ik je een methode laten zien voor het kwantificeren van gistlipiden met behulp van massaspectroscopie.

We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om veranderingen in gistlipiden onder verschillende groeiomstandigheden te bestuderen. Dus laten we beginnen. Om deze procedure te starten, moeten de eerder bereide bevroren gistpellen worden opgehangen in 1,6 milliliter ijs, koud gedistilleerd water, en 1,6 milliliter van de celsuspensie worden overgebracht naar sneldraaiende glazen centrifugeerbuisjes.

Merk op dat tijdens deze procedure alle manipulaties met geëxtraheerde lipiden worden gedaan met glazen pipetten of spuiten. Omdat kunststof een groot achtergrondsignaal zal creëren, als ze in contact komen met chloroform, start de lipidenextractie door zes milliliter van een chloroform-methanolmix in een een-op-twee-verhouding en 0,8 milliliter glazen kralen gemeten in een einorbuisje toe te voegen aan de celsuspensie. De exacte volumes zijn niet kritiek zolang de verhouding van één op twee op 0,8 voor chloroform, methanol en gist gesuspendeerd in water wordt aangehouden. Vortex.

De celsuspensie en glazen kralen worden twee keer gedurende één minuut elk gemengd, vervolgens door het toevoegen van twee milliliter chloroform en voorzichtig mengen, dan incuberen gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur met af en toe mengen. Na de vijf minuten incubatie, voeg twee milliliter gedistilleerd water toe en meng voorzichtig. Dan opnieuw incuberen gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur met af en toe mengen.

Ook hier is het belangrijker om de verhouding van twee tot twee tot 1,8 voor chloroform, methanol en water te handhaven in plaats van een specifiek volume. Wanneer de tweede incubatie voltooid is. Centrifugeer gedurende vijf minuten bij 3000 Gs bij kamertemperatuur, verzamel al het supernatant van deze eerste extractie in een nieuwe sneldraaiende glazen centrifugeerbuis en voeg 3,2 milliliter chloroform toe aan de resterende celpellen Voor een tweede lipidenextractie.

Vortex de celpellen met het toegevoegde chloroform twee keer gedurende één minuut elk. Dan centrifugeer gedurende vijf minuten bij 3000 Gs Bij kamertemperatuur, voeg het supernatant van deze tweede extractie toe aan het supernatant dat na de eerste extractie is verzameld. Centrifugeer vervolgens de verzamelde supernatanten gedurende vijf minuten.

Bij 3000 Gs bij kamertemperatuur zijn de geëxtraheerde lipiden nu opgelost in de lagere organische fase. Gooi de bovenste waterige fase weg en breng de lagere fase over in een nieuwe sneldraaiende glazen centrifugeerbuis. Om schonere spectra op de massaspectrometer te produceren, centrifugeer de organische fase gedurende vijf minuten bij 3000 Gs bij kamertemperatuur en breng het volledige supernatant over in een glazen vial.

Droog de opgeloste lipiden onder stikstof, los het gedroogde lipidenfilm op in 500 microliter chloroform en bewaar het bij min 20 graden Celsius totdat je klaar bent om de monsters te analyseren met massaspectrometrie. Begin met het voorbereiden van een standaardmix van de lipiden in chloroform zoals vermeld in tabel een in het bijgevoegde schriftelijke protocol. Elke lipide vertegenwoordigt een andere klasse.

Deze oplossing kan worden bewaard bij min 20 graden Celsius voor later gebruik vóór het injecteren van de geëxtraheerde lipiden in de massaspectrometer. Combineer 10 microliter van het monster met 10 microliter van de standaardmix van lipiden. Merk op dat de verhouding standaard tot monster naar behoefte kan worden gewijzigd.

Los het monster en de standaard lipidenmix op met behulp van een micro mass Q tot F twee massaspectrometer, uitgerust met een nano elektrospraybron die werkt met een stroomsnelheid van één microliter per minuut. De instellingen worden gedetailleerd beschreven in tabel twee van het bijgevoegde schriftelijke protocol. Hoewel het gebruik van de hoge resolutie van een Q tot F massaspectrometer voordelig is, is dit geen verplichte vereiste.

Exacte instrumentparameters zullen variëren tussen massaspectrometers. Na gegevensverwerving worden de massaspectra gladgestreken, de achtergrond afgetrokken en worden de pieken gecentreerd. Exporteer ten slotte de pieklijst naar excel.

Normaliseer vervolgens de pieken van elke lipideglas naar hun interne standaard. Afhankelijk van de toepassing kan het noodzakelijk zijn om verdere post-verwerking uit te voeren, zoals de isotope en deconvolutie. Deze methode maakt de snelle diepgaande bepaling van de belangrijkste componenten van het lipidendo van gist mogelijk.

Hier hebben we een lipide gemarkeerd, die is gedeisotopeerd, gedeconvolveerd en genormaliseerd naar zijn interne standaard. We hebben je net laten zien hoe je gistlipiden kunt isoleren en hoe je de gistlipiden kunt bepalen met behulp van elektrosprayionisatie massaspectroscopie. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden om het gebruik van plastic te vermijden en om je monster in het lineaire concentratiebereik te houden.

Deze methode is vrij flexibel en in veel van de volumes kan worden aangepast naar behoefte. Dit extractieprotocol is ook geschikt voor andere methoden van lipidenanalyse, zoals dunnelaagchromatografie en multidimensionele massaspectroscopie. Dus dat is het.

Bedankt voor het kijken en veel succes met je experimenten.