Name: Voorbereiding en Cultuur van Rat Lens Epitheliale Explantaten voor het bestuderen van terminale differentiatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 2 s
Description: Leer een methode voor het kweken van lens-epitheelexplantaat van pasgeboren ratten om terminale differentiatie te bestuderen met FGF-2. Deze techniek maakt analyse van genexpressie en signaaltransductie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De voorbereiding van lens epitheel explanten is een aangepaste versie van methoden zijn oorsprong in het laboratorium van dr. John McAvoy 9. Dit werk wordt gefinancierd door het National Eye Institute, Intramurale Research Program Z01-EY000238-22

Deel 1: Het verwijderen van lenzen Materialen en reagentia: <ol><li> Micro-ontleden schaar, gebogen, stompe uiteinden, (zoals as.RS-5983, Roboz Surgical Instrument Co, Inc, Gaithersburg, MD), micro-pincet ontleden, gebogen tip (zoals Roboz # RS5137). </li><li> Vering medium: Medium 199 met 0,1% bovine serum albumine, 100 eenheden / ml penicilline, streptomycine 100μg/ml, 2,5 ug / ml amfotericine B. Reagentia zijn verkrijgbaar bij Invitrogen, Carlsbad, CA. </li></ol> Procedure: <ol><li> Euthanaseren pasgeboren ratten (leeftijd 2-4 dagen) in overeenstemming met de richtlijnen die door de National Institutes of Health, Bethesda, MD. </li><li> Verwijder de oogleden met chirurgische schaar. Druk zachtjes met gebogen pincet aan weerszijden van de oogkas aan het oog naar buiten kracht bobbel. Maak een kleine incisie aan de achterzijde van het oog met de schaar. Door te drukken met een pincet tegen de zijkant van het oog tegenover de incisie, kan de lens en een kleine hoeveelheid aangesloten glasachtig lichaam dan gedwongen worden uit door de breuk, waardoor de lens te worden opgehaald met gebogen pincet. Zorg ervoor dat u niet aan de lenskapsel te breken. </li><li> Gebruik de gebogen pincet om de lenzen te dragen aan een 60mm plastic weefselkweek schotel met 5 ml warm, steriele suspensie medium. </li></ol> Deel 2: Microdissection van explanten Materialen en reagentia: <ol><li> Micro ontleden pincet, 0,1 mm tips, (zoals Roboz RS-4976). We maken gebruik van Dumostar legering vanwege de flexibiliteit van de tip, maar ook andere staal legeringen zijn ook aanvaardbaar. Pincet met tips dunner dan 0,1 mm worden niet aanbevolen, omdat ze de neiging te breken of buigen tijdens deze procedure. </li><li> Vering medium (zie deel 1) </li><li> Unsupplemented Ham&#39;s F12 medium of Medium 199 (Invitrogen, Carlsburg, CA) </li></ol> Procedure: <ol><li> De volgende stappen dienen te worden uitgevoerd in een schone, tochtvrije omgeving met steriele ontleden tools en steriel medium. </li><li> Met behulp van een stereo-dissectiemicroscoop, het reinigen van de lenzen van een hechtende weefsel met de 0,1 mm tip pincet en overbrengen naar een tweede 60mm cultuur schotel met 5 ml steriele suspensie medium (deze stap helpt om de verontreiniging te verminderen). Met de pincet, de overdracht het gewenste aantal lenzen met een 35mm cultuur schotel met 5 ml steriel, unsupplemented medium. (We maken vaak gebruik van Ham&#39;s F12 (Invitrogen) voor deze stap, omdat de lagere kleurstof concentratie maakt dissectie makkelijker, maar Medium 199 is ook aanvaardbaar geen antibiotica of andere toevoegingen zijn nodig tijdens deze stap..) Maar liefst 12 explanten kan worden gemaakt in het midden van een schotel deze omvang. Er moet echter een 35 mm schaal worden gebruikt, zelfs als er minder explanten moeten worden gemaakt, omdat het ontleden tools kunnen niet gemakkelijk worden gemanipuleerd in een kleinere schaal. Breng het gerecht met de rest van lenzen voor een weefselkweek incubator bij 37 ° C tot ze nodig zijn. </li><li> Identificeer de achterzijde van de lens. Er zijn vele manieren om dit te herkennen: 1) De achterste is ronder dan de voorste, die enigszins is afgevlakt, 2) De pasgeboren rat lenzen vorm koud staar als ze afkoelen tot kamertemperatuur gedurende de dissectie. Als de koude cataract is niet volledig gevuld de lens, de achterste is de kant die het verst van de ondoorzichtige regio. Als de dekking is de lens gevuld, opwarming van de schotel naar 37 ° C voor een paar minuten zal keren. De achterzijde kan worden geïdentificeerd als de cataract hervormingen bij afkoeling. 3) Sporen van de tunica vasculosa lentis kan zichtbaar zijn op de achterzijde. 4) De achterste hechting kan zichtbaar zijn op de achterzijde. Het identificeren van de achterzijde juist essentieel is, omdat dit is waar de capsule zal worden geopend. Het openen van de lens op de voorste zijde zal scheuren het epitheel. </li><li> Zodra de achterzijde is geïdentificeerd, omhoog draaien en pak de lens in de linker pincet (voor een rechtshandige werknemer). Dan knijpen de achterste kapsel met de juiste pincet om een ​​kleine vouw te produceren. </li><li> Terwijl u de achterste kapsel met de juiste pincet, pak de plooi van de linker-capsule met pincet en trek de twee paren van een pincet in tegengestelde richtingen om een ​​kleine scheur in de capsule te maken. </li><li> Pak de rand van het intrekken capsule met het pincet, trek hem naar beneden, eerst aan de ene kant, dan aan de andere kant en druk het in het plastic van de schaal met de pincet. Herhaal dit een paar keer, het verplaatsen van alle rond de evenaar van de lens, totdat de capsule is stevig aan de plaat op vele punten. Houd de capsule op zijn plaats met de linker pincet, schud de vezel massa met het recht pincet om de hechting tussen de vezels cellen en epitheelcellen in de lens evenaar te breken. Vervolgens weg te duwen van de vezel massa, te rollen uit de capsule / epitheel, die nog steeds aan de onderkant van deschotel. Herhaal dit proces met alle lenzen in de schotel. Verwijder de vezel massa&#39;s (of sla ze op bevroren als een bron van lens eiwitten voor andere studies). </li></ol> Deel 3: Microdissection en de cultuur van de centrale explanten Materialen en reagentia: <ol><li> Steriele scalpel, # 15 blade, (Cincinnati chirurgische Co Cincinnati, OH) </li><li> Steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing met calcium en magnesium (Invitrogen, Carlsbad, CA) </li><li> Kweekmedium: Schorsing medium met 100ng/ml FGF-2 (Sigma-Aldrich, Inc St Louis, MO). </li></ol> Procedure: <ol><li> Met behulp van een steriel scalpel, trim weg van de perifere epitheel (PE), die cellen bevat in de vroege stadia van differentiatie (figuur 1A), waardoor er een centraal plein van ongeveer 2,0 mm op een zijkant, die bestaat uit de centrale epitheliale cellen alleen (CE) (figuur 1B). </li><li> Overdracht het schaaltje met de centrale explantaten om een ​​bioveiligheid kast. Was drie keer met steriele PBS dat calcium en magnesium en een keer met 1 ml van de verse, in evenwicht gebracht (37 ° C, 5% CO 2) ophanging medium. Deze wast sterk verminderen de kans op besmetting. </li><li> Voeg 2 ml van de cultuur medium tot differentiatie 1 induceren, en de explantaten in een vochtige, weefselkweek incubator plaats bij 37 ° C, 5% CO 2. Cultuur periodes kan zo kort als een paar uur of uit te breiden zo lang als twee tot drie weken, afhankelijk van de parameter die wordt bestudeerd. Medium moet worden gewijzigd om de twee tot drie dagen. </li></ol> Deel 4: Het oogsten van explantaten voor de analyse van incidenten die verband hielden met de differentiatie 1. Oogsten explantaten voor de analyse van eiwit-of RNA Materialen: <ol><li> Microdissecting pincet </li><li> SDS Lysis Buffer of RNA-later </li></ol> Procedure: <ol><li> Aan het einde van de incubatieperiode, verwijder het kweekmedium. </li><li> Met behulp van de stereo-microscoop ontleden, voorzichtig los van de randen van elke explantatie. </li><li> Til elk explant met de pincet en overbrengen naar een buis die over 100μl SDS lysis buffer (voor eiwit analyse) of RNA-later (voor RNA-analyse). Schud het uiteinde van het pincet in de oplossing om ervoor te zorgen dat de explantatie niet houden aan de pincet. </li></ol> 2. Oogsten explantaten voor immunofluorescentie Materialen en reagentia: <ol><li> Fosfaat gebufferde zoutoplossing met calcium en magnesium (Invitrogen, Carlsbad, CA) </li><li> Fosfaat gebufferde zoutoplossing (zonder calcium en magnesium) (Invitrogen, Carlsbad, CA) </li><li> 4% paraformaldehyde (Boston Bioproducts, Worcester, MA) </li><li> Microdissecting pincet </li><li> Hydrofobe markering pen </li><li> Glazen objectglaasjes </li><li> 0,25% Triton X-100 in fosfaat gebufferde zoutoplossing. </li></ol> Procedure: <ol><li> Spoel kort explantaten in PBS met calcium en magnesium. </li><li> Fix weefsels door het toevoegen van 4% paraformaldehyde gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder het fixatief en te vervangen door fosfaat gebufferde zoutoplossing. Vaste explantaten geworden wat stijf, waardoor ze worden opgeheven en overgebracht naar glazen dia&#39;s voor immunokleuring. </li><li> Plaats een kleine druppel PBS (zonder calcium en magnesium) op de dia om de positie van de weefsels helpen voorkomen en curling. Met behulp van microdissecting pincet, til de explantatie en plaats deze in de druppel op de dia. Zonder het explantatie, verwijder voorzichtig de vloeistof met een papieren lont aan de explantatie op het glas plat en laat het weefsel drogen in lucht bij kamertemperatuur gedurende 3 tot 5 minuten. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1519/fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1 A. De perifere epitheel tot uitdrukking differentiatie-specifieke eiwitten. De getoonde explant was immunostained voor N-cadherine onmiddellijk na microdissectie. Expressie wordt gezien in een band van cellen in het perifere epitheel, wat aangeeft dat de cellen in deze regio zijn begonnen met elkaar te onderscheiden. B. De perifere epitheel weg kan worden bijgesneden om cellen te verwijderen die uitdrukken N-cadherine en andere differentiatie-specifieke eiwitten. De rode ring staat voor de locatie van de cellen die uitdrukken N-cadherine, terwijl de kleine vierkante beschreven in het grijs het kwadrant van het epitheel getoond in paneel 1A vertegenwoordigt. De perifere epitheel kan worden verwijderd door vier scalpel snijdt, waardoor er een centraal plein dat alleen cellen die nog niet zijn begonnen om onderscheid te maken bevat.

<ol><li>McAvoy, J. W., Chamberlain, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+%28FGF%29+induces+different+responses+in+lens+epithelial+cells+depending+on+its+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor (FGF) induces different responses in lens epithelial cells depending on its concentration.</a> Development. 107 (2), 221-228 (1989).</li>
<li>Campbell, M. T., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Onset+of+fibre+differentiation+in+cultured+rat+lens+epithelium+under+the+influence+of+neural+retina-conditioned+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Onset of fibre differentiation in cultured rat lens epithelium under the influence of neural retina-conditioned medium.</a> Exp Eye Res. 39 (1), 83-94 (1984).</li>
<li>Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+lens+epithelial+explants+induced+to+differentiate+into+fibres+by+fibroblast+growth+factor+%28FGF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of lens epithelial explants induced to differentiate into fibres by fibroblast growth factor (FGF).</a> Exp Eye Res. 49 (3), 479-494 (1989).</li>
<li>Golestaneh, N., Fan, J., Fariss, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lens+major+intrinsic+protein+%28MIP%29%2Faquaporin+0+expression+in+rat+lens+epithelia+explants+requires+fibroblast+growth+factor-induced+ERK+and+JNK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Lens major intrinsic protein (MIP)/aquaporin 0 expression in rat lens epithelia explants requires fibroblast growth factor-induced ERK and JNK signaling.</a> J Biol Chem. 279 (30), 31813-31822 (2004).</li>
<li>Saravanamuthu, S. S., Gao, C. Y., Zelenka, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+is+required+for+lateral+induction+of+Jagged1+during+FGF-induced+lens+fiber+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Notch signaling is required for lateral induction of Jagged1 during FGF-induced lens fiber differentiation.</a> Dev Biol. 332 (1), 166-176 (2009).</li>
<li>Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF-induced+lens+cell+proliferation+and+differentiation+is+dependent+on+MAPK+%28ERK1%2F2%29+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGF-induced lens cell proliferation and differentiation is dependent on MAPK (ERK1/2) signalling.</a> Development. 128 (24), 5075-5084 (2001).</li>
<li>Dirks, R. P., Kraft, H. J., Van Genesen, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cooperation+between+two+silencers+creates+an+enhancer+element+that+controls+both+the+lens-preferred+and+the+differentiation+stage-specific+expression+of+the+rat+beta+B2-crystallin+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">The cooperation between two silencers creates an enhancer element that controls both the lens-preferred and the differentiation stage-specific expression of the rat beta B2-crystallin gene.</a> Eur J Biochem. 239 (1), 23-32 (1996).</li>
<li>Yang, Y., Stopka, T., Golestaneh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+alphaA-crystallin+via+Pax6%2C+c-Maf%2C+CREB+and+a+broad+domain+of+lens-specific+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Regulation of alphaA-crystallin via Pax6, c-Maf, CREB and a broad domain of lens-specific chromatin.</a> The EMBO journal. 25 (10), 2107-2118 (2006).</li>
<li>McAvoy, J. W., T, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+retinas+promote+cell+division+and+fibre+differentiation+in+lens+epithelial+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Neural retinas promote cell division and fibre differentiation in lens epithelial explants.</a> Curr Eye Res. 3 (6), 827-834 (1984).</li>
</ol>

De rat lens explantatie systeem is met succes gebruikt door een aantal laboratoria om terminale differentiatie van lens epitheel cellen te bestuderen om lensvezels 21,3,4,5. Wanneer ze worden blootgesteld aan FGF-2 op 100ng/ml de explantaten zal beginnen op veranderingen in de signalering binnen enkele minuten 6 laten zien, met veranderingen in morfologie en genexpressie verschijnen opeenvolgend over meerdere dagen 3,4,5. De culturen blijven haalbaar is voor 2-3 weken als zorg is genomen om besmetting te voorkomen. De centrale explantaten beschreven in dit protocol zijn vooral handig voor het bestuderen van de volgorde van de gebeurtenissen verbonden aan differentiatie, want ze bevatten weinig of geen cellen die differentiatie markers voor de FGF-2 te drukken is toegevoegd 1,5. De cellen vervolgens synchroon differentiëren, als een cohort, die het mogelijk maakt om het tijdsverloop van de signalering en transcriptionele afspraken verbonden aan differentiatie te volgen. Het kweken van explantaten voor verschillende lengtes van de tijd geeft dus nauwkeurige temporele informatie over de reeks gebeurtenissen. Specifieke remmers kunnen worden toegevoegd aan het kweekmedium om relevante signaalwegen te identificeren. Explanten kan worden gebruikt om eiwitexpressie analyseren door SDS-gel elektroforese en immunoblotting of expressie van specifieke mRNA&#39;s door RT-PCR te analyseren. Eiwit levert range 20 tot 50 ug / Explantatie-en RNA-opbrengst ligt op ongeveer 200 tot 600 ng / explantatie, afhankelijk van de lengte van de cultuur periode. Wij vinden dat over het algemeen 5-6 explantaten per gerecht voldoende eiwitten of RNA te bieden voor verschillende assays. RNA van explanten kan ook gebruikt worden om cDNA voor te bereiden op het beoordelen van genexpressie door middel van microarray analyse, die kan identificeren nieuwe genen die cruciaal belang kan zijn voor differentiatie. Explanten kan ook worden getransfecteerd. Hoewel de transfectie-efficiëntie is over het algemeen laag is, is het voldoende voor het testen van reportergenen 4, 7, 8. Immunofluorescentie microscopie van de explantaten biedt een nuttige aanvulling op biochemische methoden door het bepalen van de subcellulaire locatie van eiwitten van belang. Zo, de voorbereiding en de cultuur van de rat lens explanten biedt een krachtig systeem voor het bestuderen van terminale lens differentiatie in zoogdieren, die kunnen aanvullen in vivo technieken, zoals het genereren van transgene en knock-out muizen.

voorbereiding en cultuur van rat lens epitheliale explantaten voor het bestuderen van terminale differentiatie

Preparation and Culture of Rat Lens Epithelial Explants for Studying Terminal Differentiation

De voorste oppervlak van de ooglens is bedekt met een monolaag van epitheliale cellen, die prolifereren in een ringvormige zone ten grondslag liggen aan het corpus ciliare. Volgende indeling, deze cellen migreren naar achteren, waar FGF verspreiden van het netvlies leidt hen om te differentiëren in een achterste reeks van langwerpige lens vezels cellen, die het grootste deel van de lens samen te stellen. Differentiatie van lens epitheel cellen die in de lens van vezels kan worden geïnduceerd in vitro door het kweken van explantaten van de centrale regio van de voorste epitheel in de aanwezigheid van FGF-2. Explantaten zijn bereid uit lenzen van de neonatale ratten door het verwijderen van de lens van het oog en grijpen de lenskapsel aan de achterzijde met het ontleden van een pincet. De achterste kapsel is dan voorzichtig opengereten en drukte beneden in de plastic bodem van een weefselkweek schotel. De perifere regio&#39;s van de explantatie worden verwijderd met een scalpel en het centrale gebied wordt vervolgens gekweekt in de aanwezigheid van 100ng/ml FGF-2 voor zo lang als 2-3 weken, afhankelijk van de te onderzoeken parameters. Sinds epitheliale cellen in gekweekte explantaten onderscheiden bij benadering synchroon gedurende een periode van dagen tot weken, kan het tijdsverloop van signalering en genexpressie worden bepaald met behulp van moleculaire, biochemische en farmacologische technieken. Immunofluorescentie microscopie is een krachtige aanvulling op deze methoden aangezien het aantoont de subcellulaire lokalisatie van eiwitten van belang en kan onthullen de fysiologische gevolgen van de experimentele manipulaties van signaalwegen.

Explantaten van de centrale regio van de rat lens epitheel synchroon te onderscheiden wanneer gekweekt in de aanwezigheid van FGF-2. Immunofluorescentie microscopie van dergelijke culturen kan verschaft nieuwe informatie over de genexpressie en signalering afspraken verbonden aan terminale differentiatie.

Voorbereiding en Cultuur van Rat Lens Epitheliale Explantaten voor het bestuderen van terminale differentiatie

Het anterieure oppervlak van de ooglens wordt bedekt door een monolaag epitheelcellen, die prolifereren in een ringvormige zone onder het ciliaire lichaam.

Deze procedure begint met het verwijderen van de lenzen uit ratten van twee tot vier dagen oud en het schoonmaken ervan om eventueel aanhecht weefsel te verwijderen. De achterzijde van de lens wordt geïdentificeerd en er wordt een kleine scheur in het kapsel gemaakt. Het kapsel wordt vervolgens naar beneden afgepeld en tegen de bodem van de schaal gedrukt.Dit proces wordt herhaald rondom de gehele lens. De lensvezelmassa wordt verwijderd door deze zijwaarts heen en weer te bewegen. Het perifere epitheel wordt weggesneden, waarna deze vervolgens worden gecultiveerd.Ten slotte worden ze overgebracht naar een reageerbuis voor biochemische analyse of op een objectglas voor microscopie. Hallo, ik ben Peggy Lanka in het laboratorium voor Moleculaire en Ontwikkelingsbiologie in het National Eye Institute bij de NIH. Hallo, ik ben Al Tu, ook van het laboratorium voor Moleculaire en Ontwikkelingsbiologie in het National Eye Institute.Ik ben Chung Ga, ook werkzaam in hetzelfde laboratorium bij het NEI. Vandaag laten we u een procedure zien voor het explanteren en kweken van lensepitheel van pasgeboren ratten. We laten u zien hoe u de perifere regio van het epitheel verwijdert, waarin cellen in de vroege stadia van differentiatie zich bevinden.Vervolgens laten we zien hoe u de resterende centrale lens-epitheelcellen kunt induceren om te differentiëren tot lensvezels door ze bloot te stellen aan FGF. Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de timing van gebeurtenissen die betrokken zijn bij de terminale differentiatie te bestuderen. We oogsten het EXPLAN op verschillende tijdstippen na het toevoegen van FGF aan het kweekmedium.Vervolgens analyseren we de eiwitexpressie via western blotting, de RNA-expressie via R-T-P-C-R of micro-arrays, en voeren we een immunokleuring van de lens uit om de subcellulaire lokalisatie van de eiwitten van belang te bepalen. Laten we beginnen met het verwijderen van de lenzen uit pasgeboren ratten. Gebruik hiervoor microdissectiescharen om de lenzen te verwijderen uit de ogen van geëuthanaseerde ratten van twee tot vier dagen oud door een kleine posterieure incisie te maken en op de tegenovergestelde zijde te drukken.Verplaats de lenzen met een pincet met een punt van 0,1 millimeter naar een plastic weefselkweekschaal van 60 millimeter die vijf milliliter warm steriel suspensiemedium bevat. Verwijder eventueel aanhechtend weefsel van de lenzen en breng ze over naar een tweede kweekschaal van 60 millimeter met vijf milliliter steriel suspensiemedium. Dit helpt om contaminatie via de pincet te verminderen.Breng het gewenste aantal lenzen over naar een kweekschaal van 35 millimeter die twee milliliters steriel, niet-gesuppleerd medium bevat. In het centrum van een schaal van deze afmeting kunnen tot 12 x explan worden gemaakt. Eventuele extra lenzen kunnen worden bewaard in de tweede schaal van 60 millimeter uit de vorige stap en in een weefselkweekincubator bij 37 graden Celsius worden geplaatst tot maximaal één uur voordat ze worden gebruikt om X explan te maken.Identificeer nu de posterieure zijde van de lens. Ik kan zien dat deze twee met hun anterieure zijde naar boven liggen. Ik ga ze op hun zijkant zetten zodat u erin kunt kijken en de koudcataract kunt zien, wat een ondoorzichtig gebied in het centrum is.De zijde die het verst verwijderd is van het ondoorzichtige centrum is de posterieure zijde. Daarom draai ik het om naar de posterieure zijde. Aan de posterieure zijde zijn ook deze striaties te zien, welke de overblijfselen zijn van deze tenale vasculitis.Het is een bloedvatpatroon rond de periferie van de lens dat ook de posterieure zijde markeert. Correct. Identificatie is cruciaal, aangezien dit de plek is waar de capsule zal worden geopend. Het openen van de lens aan de anterieure zijde zal het epitheel scheuren.Er zijn verschillende manieren om de posterieure zijde te identificeren. Ten eerste is deze ronder dan de anterieure zijde, die enigszins afgeplat is. Ten tweede vormen de lenzen van pasgeboren ratten koudecataracten wanneer ze tijdens de dissectie afkoelen tot kamertemperatuur.Als de koude cataract de lens nog niet volledig heeft gevuld, is de posterieure zijde de zijde die het verst van het ondoorzichtige gebied afligt. Indien de ondoorzichtigheid de lens volledig heeft gevuld, kan dit worden teruggedraaid door het schaaltje enkele minuten op 37 °C te verwarmen. De posterieure zijde kan worden geïdentificeerd zodra de cataract zich bij afkoeling opnieuw vormt.Derde kunnen resten van de tunica VASIs zichtbaar zijn aan de posterieure zijde. Ten slotte kan de posterieure naad zichtbaar zijn aan de posterieure zijde. Zodra de posterieure zijde is geïdentificeerd, draait u deze naar boven en ondersteunt u de lens met de linker pincet.Knijp vervolgens met de rechter pincet in het achterste kapsel om een kleine plooi te maken. Terwijl het achterste kapsel met de rechter pincet wordt vastgehouden, grijpt u de plooi van het kapsel met de linker pincet en trekt u de twee pincetten in tegenovergestelde richtingen om een kleine scheur in het kapsel te maken. Terwijl u de rand van het terugtrekkende kapsel met de pincet vastgrijpt, trekt u deze eerst aan één zijde naar beneden en vervolgens aan de andere zijde, waarbij u het met de pincet in het plastic van de schaal drukt. Herhaal dit meerdere keren over de gehele equator van de lens, totdat het kapsel stevig aan de plaat vastzit. Houd op verschillende plaatsen het kapsel met de linker pincet op zijn plaats en wiebel voorzichtig met de rechter pincet aan de fibermassa om de verbinding tussen de fibercellen en de epitheelcellen bij de lens-equator te verbreken.Trek nu voorzichtig de vezelmassa weg door deze van het kapsel af te rollen, dat aan de bodem van de schaal blijft kleven. Herhaal dit proces voor alle lenzen in de schaal. Vezelmassa's kunnen worden weggegooid of worden ingevroren en bewaard als bron van lensproteïnen voor andere studies, waarmee de microdissectie van volledige epitheliale explan is voltooid.Laten we kijken naar het micro-dissecteren en kweken van het centrale explantaat. Verwijder met een steriel scalpel het perifere epitheel, dat cellen in de vroege stadia van differentiatie bevat. Laat een centraal vierkant over van ongeveer twee millimeter per zijde, dat bestaat uit centrale epitheelcellen.Kring alleen de schaal met de centrale x explantaat over naar een veiligheidskast. Was de aubergines drie keer met steriele PBS en één keer met één milliliter vers geëquilibreerd suspensiemedium. Voeg vervolgens twee milliliter cultuurmedium toe om differentiatie te induceren en plaats het explantaat in een bevochtigde weefselkweekincubator bij 37 °C, 5% koolstofdioxide.De kweekperiode kan variëren van enkele uren tot twee tot drie weken, afhankelijk van de bestudeerde parameter. Het medium moet elke twee tot drie dagen worden vervangen met microdissectie en Turing complete. Laten we beginnen met het oogsten van de explantaten voor analyse.Verwijder na afloop van de incubatieperiode het kweekmedium met micro-dissectie-pincetten. Maak de randen van elk x explantaat voorzichtig los. Pak elk explantaat met de pincet vast en breng het over naar een buisje met ongeveer 100 µL SDS-lysisbuffer voor eiwitanalyse of RNA later voor RNA-analyse; schud de punt van de pincet in de oplossing om er zeker van te zijn dat het explantaat niet aan de pincet blijft kleven.De explainten zijn nu klaar voor analyse van eiwitten of RNA; explainten kunnen ook worden geanalyseerd via immunofluorescentie. Begin met het kort spoelen van de explainten in PBS. Fixeer de weefsels door 4% paraformaldehyde gedurende 30 minuten toe te voegen.Verwijder bij kamertemperatuur het fixatief en vervang dit door PBS. De gefixeerde explantaten worden enigszins stijf, waardoor ze kunnen worden opgetild en overgebracht naar objectglazen voor immunokleuring. Plaats een kleine druppel PBS zonder calcium en magnesium op het objectglas om het weefsel te helpen positioneren en krullen te voorkomen. Til het explantaat op met microdissectiepincetten en plaats het in de druppel op het objectglas zonder het explantaat aan te raken; gebruik vervolgens voorzichtig een papieren stripje om de vloeistof te verwijderen en het explantaat plat op het glas te drukken.Laat het weefsel drie tot vijf minuten aan de lucht drogen bij kamertemperatuur. De implantaten zijn nu klaar voor immunofluorescentie-analyse. Hier wordt een voorbeeld getoond van een microgediseceerd volledig epitheliaal explantaat dat is aangekleurd via immunhistochemie voor NCO adhere, een marker voor cellen.In de vroege stadia van differentiatie zijn alleen de cellen in het perifere gebied van het epitheel positief gekleurd voor dit eiwit. Het perifere epitheel, zoals beschreven in dit protocol, laat een centraal vlak over dat weinig tot geen cellen bevat die expressie vertonen. Dit wordt aangetoond via western blotting; de centrale en perifere epitheelweefsels werden onderzocht via western blotting voor GA.DH om te bevestigen dat de eiwitmonsters gelijkmatig waren beladen.Het tijdstip van gebeurtenissen die geassocieerd zijn met differentiatie kan worden bepaald door centrale explantaten gedurende verschillende tijdsperioden te kweken. Centrale explantaten werden 2, 5, 24 en 48 uur gekweekt in medium met of zonder 100 nanogram per milliliter FGF. De X explantaten werden op de aangegeven tijdstippen geoogst en overgebracht naar SDS-monsterbuffer voor analyse via western blotting.De resultaten tonen aan dat de expressie van het coherente eiwit wordt geïnduceerd na 24 tot 48 uur in cultuur. Western blotting voor GA DH demonstreert dat de eiwitmonsters in gelijke hoeveelheden zijn geladen.Immunokleuring van explantaten van het centrale zenuwstelsel, gedurende vier dagen gekweekt in afwezigheid of aanwezigheid van 100 ng/mL FGF, laat zien dat de N-cadherine immunofluorescentie sterk verhoogd is in explantaten die zijn blootgesteld aan FGF. De immunofluorescentie toont tevens de subcellulaire lokalisatie van N-cadherine aan de cel-celgrenzen.We hebben zojuist laten zien hoe u lens-epitheelcellen in cultuur kunt voorbereiden voor het bestuderen van differentiatie. Het belangrijkste voordeel van dit systeem is dat de cellen synchroon differentiëren. Hierdoor is het mogelijk om de volgorde van gebeurtenissen te bepalen.Daarnaast kunnen we specifieke groeifactoren of remmers aan het medium toevoegen om bepaalde signaleringspaden te activeren of te blokkeren. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om contaminatie te voorkomen door de dissectie en het steriele medium in een schone omgeving te hanteren en door de explanten grondig te controleren vóór het cultiveren. Dat is alles.Bedankt voor het kijken. Veel succes met uw experiment. Tot ziens.

preparation-culture-rat-lens-epithelial-explants-for-studying

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Stamcellenafgeleide retinale pigmentepitheel (RPE) cellen kunnen voor meerdere toepassingen worden gebruikt, waaronder cel-gebaseerde therapieën voor retinale degeneratie, ziektemodellering en geneesmiddelstudies. Hier presenteren we een eenvoudig protocol voor het reproduceerbaar verkrijgen van RPE uit stamcellen.

Efficiënte Afleiding van retinale pigment epitheel cellen uit stamcellen

Angiogenese omvat interacties tussen meerdere cellen en systemen die onderzocht moeten worden in een fysiologisch relevante omgeving. Het doel van deze studie is om de capaciteit van het kweekmodel van de rat mesenterium te demonstreren om tijdsverloopvergelijkingen van intacte microvasculaire netwerken tijdens angiogenesis te maken.

Een<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Methode voor Time-lapse imaging van gekweekte Rat Mesenteriale microvasculaire Networks

Beschrijven we een methode om ingenieur een retinale weefsel samengesteld van retinale pigment epitheliale cellen afgeleid van menselijke pluripotente stamcellen gekweekt op de top van menselijke vruchtwater membranen en de voorbereiding voor de transplantatie in diermodellen.

Transplantatie-geschikt retinale Pigment epitheel Tissue Engineering afgeleid van menselijke embryonale stamcellen

We presenteren een in vitro model om olfactorisch verwarmend glia (OEG) neuroregeneratief vermogen te beoordelen, na neuraal letsel. Het is gebaseerd op een cocultuur van axotomized volwassen retinale ganglion neuronen (RGN) op OEG monolagen en daaropvolgende studie van axonale regeneratie, door het analyseren van RGN axonale en somatodendritische markers.

Cocultuur van Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons met Olfactory Ensheathing Glia, als een In Vitro Model van Volwassen Axonale Regeneratie

Het protocol beschrijft organotypische explants van het neuro-netvliesvan muizen , gekweekt samen met het retinale pigmentepitheel (RPE), in R16 gedefinieerd medium, vrij van serum en antibiotica. Deze methode is relatief eenvoudig uit te voeren, goedkoper en tijdrovend in vergelijking met in vivo experimenten en kan worden aangepast aan tal van experimentele toepassingen.

Langdurige, serumvrije teelt van organotypische muis retina explants met intact retinale pigmentepitheel

Deze studie heeft tot doel een nieuw humaan organotypisch retinale cultuurmodel (HORC) te ontwikkelen dat voorkomt dat de retinale integriteit tijdens explantbehandeling in gevaar komt. Dit wordt bereikt door het netvlies te kweken met het bovenliggende glasvocht en het onderliggende retinale pigmentepitheel-vaatvlies (RPE-vaatvlies) en sclera.

Karakterisering van een nieuwe menselijke organotypische retinale cultuurtechniek

Dit protocol, dat oorspronkelijk werd gerapporteerd door Fernandez-Godino et al. in 20161, beschrijft een methode om RPE-cellen van muizen efficiënt te isoleren en te cultiseren, die binnen een week een functionele en gepolariseerde RPE-monolaag vormen op Transwell-platen. De procedure duurt ongeveer 3 uur.

Efficiënte dissectie en cultuur van primaire muis retinale pigment epitheelcellen

Dit protocol presenteert en beschrijft stappen voor de isolatie, dissectie, kweek en kleuring van retinale explantaten verkregen van een volwassen muis. Deze methode is gunstig als een ex vivo model voor het bestuderen van verschillende retinale neurovasculaire ziekten zoals diabetische retinopathie.

Retinale explant van het netvlies van de volwassen muis als een ex vivo model voor het bestuderen van retinale neurovasculaire ziekten

Dit manuscript schetst een gedetailleerd videoprotocol voor het kweken van primaire lensepitheelcellen (LEC's), met als doel de reproduceerbaarheid te verbeteren en onderzoek naar cataract en posterieure capsule-opacificatie (PCO) te ondersteunen. Het biedt stapsgewijze instructies over lensdissectie, LEC-isolatie en validatie en dient als een waardevolle gids, vooral voor nieuwkomers in het veld.

Optimalisatie van de epitheelcelcultuur van de primaire lens van muizen: een uitgebreide gids voor trypsinisatie

We ontwikkelden een rattenmodel van ernstige hoornvliesontsteking door middel van hoornvliesepitheelcurettage in combinatie met hoornvlieshechtingen. De studie evalueerde ontstekingspatronen van het hoornvlies, epitheliale proliferatie en veranderingen in limbale stamcellen onder ontstekingsomstandigheden.

Het opzetten van een model voor ernstige hoornvliesontsteking bij ratten op basis van hoornvliesepitheelcurettage in combinatie met hoornvlieshechtingen

Dit protocol beschrijft de scheiding van het epitheel van de ooglens van de muis en de bulkmassa van de vezelcel, gevolgd door RNA-isolatie en qPCR-analyse. Deze methode maakt het mogelijk om lenscelcompartimenten te scheiden voor een meer gedetailleerde analyse van het transcriptoom en biologische processen in epitheelcellen versus gedifferentieerde vezelcellen.

RNA-isolatie van oculair lensepitheel van muizen en bulkmassa's van vezelcellen

Leer een methode voor het kweken van lens-epitheelexplantaat van pasgeboren ratten om terminale differentiatie te bestuderen met FGF-2. Deze techniek maakt analyse van genexpressie en signaaltransductie mogelijk.

Voorbereiding en Cultuur van Rat Lens Epitheliale Explantaten voor het bestuderen van terminale differentiatie

Meer video's verkennen