Zuivering van specifieke cel Bevolking naar fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting (FACS)
10 juli 2010
Voor veel wetenschappelijke studies die een biologische en chemische analyse van celpopulaties de cellen moeten worden in een hoge staat van zuiverheid. Fluorescentie geactiveerde cel sortering (FACS) is een superieure methode om zuivere celpopulaties te verkrijgen.
Hi, Ik ben Hope Campbell, een specialist in flowcytometrie van het Blood Research Institute bij het Blood Center of Wisconsin. Hoi, ik ben STR Baso, een afgestudeerde student in het lab van Dr. Bonnie Dieter. Ik ben ook bij het Blood Research Institute van het Blood Center of Wisconsin.
Vandaag gaan we een procedure uitvoeren om cellen te isoleren met behulp van fluorescente geactiveerde celsortering. We gebruiken deze procedure in een laboratorium om de functie van lymfocyten en myeloïde celpopulaties te bestuderen. Laten we beginnen.
In deze procedure zullen B- en CD vier T-cellen worden gezuiverd uit muiscyten. Het startaantal doelcellen moet worden berekend op basis van het aantal cellen dat nodig is en de herstelsnelheid van de machine met behulp van deze methode. De typische herstelsnelheid voor B- en CD vier T-cellen is 85 tot 90%. De startpopulatie SP cyte is ongeveer 60 tot 70% B-cellen en 20 tot 30% T-cellen.
Dus als je begint met 100 maal 10 tot de zes cellen, zul je 50 tot 60 miljoen B-cellen en 20 tot 30 miljoen T-cellen kunnen herstellen voordat je begint met feiten. De oplossingen en reagentia die nodig zijn voor het protocol moeten op ijs worden geplaatst. Deze omvatten kleurbuffer bestaande uit fosfaatgebufferd zout water met 3% foetaal runderserum, suspensiebuffer bestaande uit 25 millimolair HEPs bereid in Hank's balanced salt solution of HBSS met 3% foetaal runderserum, een 25 millimolair hep B-oplossing bereid in foetaal runderserum, kleurantilichamen en compensatiekorrels.
Dit protocol vereist ook de volgende benodigdheden en reagentia. 15 milliliter conische buisjes, 12 bij 75 millimeter polystyreen of polypropyleen flowbuisjes. Een nylon celstrainer, trien blauw en een hemo cytometer sorteerverzamelbuisjes moeten ook van tevoren worden voorbereid om dit te doen.
300 microliter van de he's FCS-oplossing naar flowbuisjes of een milliliter van de HEPs FFC S-oplossing naar 15 milliliter conische buisjes. Deze moeten op ijs worden geplaatst totdat het verzamelprozes begint. Begin met het genereren van een enkele celsuspensie van de gewenste celpopulatie.
Als de cellen die zijn geïsoleerd met behulp van deze procedure, worden gekweekt. De hele celvoorbereiding moet worden uitgevoerd in een weefselkweekkap. Gebruik steriele techniek om de cellen eenmaal te wassen door ijskoud kleurbuffer toe te voegen en de cellen op te schorsen door de buis meerdere keren om te keren.
Centrifugeer vervolgens de cellen gedurende zeven tot acht minuten bij ongeveer 250 GS vier graden Celsius. Wascondities kunnen variëren met celtype en concentratie. Voor cyten, was tot 200 maal 10 tot de zes cellen met 10 milliliter kleurbuffer.
Verwijder voorzichtig het supernatant door aspiratie zodat het celpellet intact blijft. Resuspendeer vervolgens de cellen in ijskoud kleurbuffer met een concentratie van maximaal 50 maal 10 tot de zesde per 100 microliter. Resuspendeer het cellulair pellet door de buis te schudden of voorzichtig te vortexen.
Breng vervolgens 0,25 tot 1 maal 10 van de zes cellen over naar een nieuwe 12 bij 75 millimeter polystyreen of polypropyleen flowbuisje op ijs. Zet dit opzij om later te gebruiken als de ongekleurde controlemonster. Voeg primaire antilichamen toe aan de celsuspensie om de gewenste uiteindelijke concentratie te bereiken. Hier worden PE Texas's red geconjugeerde anti B twee 20 antilichamen gebruikt om B-cellen te kleuren, terwijl ZI-geconjugeerde anti TCR R bèta en/of 700-geconjugeerde anti CD vier antilichamen worden gebruikt om T-cellen te kleuren, gemengd door aan de onderkant van de buis te schudden of door licht.
Vortex en plaats vervolgens de cellen op ijs en incubeer in het donker gedurende 20 tot 30 minuten. Na de incubatie, was de gekleurde cellen door ze op te schorsen in 10 milliliter ijskoud suspensiebuffer en centrifugeer zoals voorheen, na zorgvuldige verwijdering van het supernatant. Herhaal deze stap om de cellen een tweede keer te wassen.
Ten slotte resuspendeer de cellen in ijskoud suspensiebuffer. Als de primaire antilichamen niet rechtstreeks zijn geconjugeerd aan een fluoro vier, voeg dan gelabelde secundaire antilichamen of strep AVID in conjugaat toe aan de celsuspensie en incubeer de cellen opnieuw op ijs in het donker gedurende 20 tot 30 minuten na de incubatie. Was de cellen twee keer met ijskoud suspensiebuffer.
Nadat de cellen in ijskoud suspensiebuffer zijn opgeschorst. Bepaal de celconcentratie en levensvatbaarheid met behulp van een vitaal kleurmiddel zoals trien blauw en hemo cytometer. Pas de celconcentratie aan tot 10 tot 20 maal 10 tot de zesde cellen per milliliter door suspensiebuffer toe te voegen om verstopping van de faxmachine te voorkomen met clusters van cellen die mogelijk tijdens de isolatie zijn afgestorven.
Procedure en kleuring. Filter de cellen onmiddellijk voordat met het sorteerprotocol wordt begonnen door een druppelzeef. De poriëngrootte van de zeef moet worden gekozen afhankelijk van het celtype voor cyten wordt een zeef met een poriëngrootte van 40 micrometer gebruikt.
Verzamel de gefilterde cellen in een 15 liter conische buis of 12 bij 75 millimeter flowbuisjes, afhankelijk van het volume. Plaats de cellen op ijs terwijl de cytometer wordt ingesteld voor de sorteerprocedure. Als BD comp-korrels worden gebruikt als enkelkleurige positieve controles, bereid één controlebuisje voor voor elke kleur die in de test wordt gebruikt, plus een ongekleurde negatieve controlebuis.
Na het grondig vortexen van de korrelsuspensies, voegt u één druppel van de negatieve en positieve korrelsuspensies toe aan een 100 microliter suspensiebuffer voor elke gebruikte kleur en de negatieve controle. Voeg vervolgens één microliter van het gelabelde antilichaam toe aan elke positieve controlebuis. In dit experiment wordt één buisje bereid met behulp van PE Texas'Red B twee 20 antilichamen.
Eén met behulp van fit ETCR bèta antilichamen en één met
Overzicht
Dit artikel bespreekt het proces van het isoleren van cellen met behulp van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS), een methode die cruciaal is voor het verkrijgen van pure celpopulaties. De procedure is essentieel voor het bestuderen van lymfocyten en functies van myeloide cellen.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Flowcytometrie
- Immunologie
Achtergrond
- Hoge zuiverheid van celpopulaties is noodzakelijk voor nauwkeurige biologische analyse.
- FACS is een veelgebruikte techniek voor celisolatie.
- De procedure omvat specifieke reagentia en zorgvuldige behandeling van monsters.
- Begrip van celtypen en hun functies is cruciaal in onderzoek.
Doel van het onderzoek
- Om de FACS-procedure voor het isoleren van B- en CD4 T-cellen te demonstreren.
- Om een gedetailleerd protocol te bieden voor onderzoekers in het veld.
- Om de belangrijkheid van celzuiverheid in wetenschappelijke studies te benadrukken.
Gebruikte methoden
- Bereiding van celsuspensies en kleuring met antilichamen.
- Centrifugatie en wassen van cellen om zuiverheid te waarborgen.
- Gebruik van flowcytometrie voor het sorteren van cellen op basis van fluorescentie.
- Incorporatie van controles voor nauwkeurige resultaten.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van B- en CD4 T-cellen met hoge herstelpercentages.
- Demonstratie van effectieve kleurings- en sorteertechnieken.
- Validatie van het protocol door gedetailleerde procedurele stappen.
Conclusies
- FACS is een effectieve methode voor het verkrijgen van pure celpopulaties.
- Juiste techniek en voorbereiding zijn cruciaal voor succesvolle resultaten.
- Dit protocol kan onderzoekers helpen bij diverse biologische studies.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) enables biopharma R&D to isolate highly purified cell populations critical for target validation and mechanistic de-risking. The technique supports predictive confidence in early discovery by providing quantitative, reproducible outputs for functional assays. Its ability to sort based on intracellular markers and low-abundance surface phenotypes addresses key challenges in phenotypic screening and translational biomarker alignment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through isolation of phenotypically defined cell subsets for functional analysis.
- Operational Value: Provides high-purity inputs that reduce biological noise in downstream assays, improving target de-risking.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by generating reliable data on target engagement and pathway modulation in primary cells.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers purified cell populations as validated biological systems for assay standardization and compound screening.
- Operational Value: Ensures reproducibility and scalability of screening platforms through consistent input material quality.
- Technical Value: Enables preparation of disease-relevant systems using intracellular staining or low-density markers not accessible via bulk methods.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates continuity from discovery to preclinical validation by supplying mechanistically defined cell types for efficacy and safety studies.
- Operational Value: Supports risk-adjusted advancement decisions through quantitative, sortable readouts aligned with translational biomarkers.
- Strategic Value: Enables mechanistic de-risking by isolating cells based on intracellular protein expression, such as genetically modified fluorescent reporters.
Pipeline & Workflow Integration
FACS functions as a reusable capability bridging early discovery to lead identification and preclinical workflows, particularly when high purity or intracellular targeting is required.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating specific lymphocyte and myeloid subsets for functional interrogation.
- Screening: Enables assay readiness through standardized, high-yield cell purification with recovery rates of 85–90% for B and CD4 T cells.
- Analytics: Provides quantitative measurements of size, granularity, and fluorescence intensity, enabling precise gating and comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical work via isolation of cells based on intracellular staining, supporting biomarker-aligned model systems.
- Enterprise Reuse: Represents a scalable, standardized platform applicable across multiple projects and cell types when appropriate antibodies and instrumentation are available.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, and reduction of mechanistic ambiguity through precise phenotypic isolation.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of cell purification across R&D sites.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk via high-fidelity functional data.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions grounded in purified, functionally validated cell populations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry, antibody selection, and compensation setup for accurate spectral separation.
- Dependent on flow cytometer with sorting capacity, appropriate nozzle size (e.g., 70 μm for lymphocytes), and sterile sorting capabilities.
- Necessitates cross-team standardization of staining panels, gating strategies, and control usage (e.g., compensation beads, unstained controls).
- Requires adaptation across model systems based on cell size, marker density, and susceptibility to stress during sorting.
- Practical limitations include cell viability stress, clogging risk from aggregates, and the need for single-cell suspension preparation.
