Name: Antilichaam Profiling door Luciferase Immunoprecipitatie Systems (LIPS) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-07T17:25:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Leer Luciferase Immunoprecipitation Systems (LIPS) voor antilichaamprofilering met COS-1-cellen en ruwe extracten. Deze efficiënte methode kwantificeert antilichamen via luminescentiemeting voor diagnostiek en onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd ondersteund door de Intramurale Research Program van de NIDCR.

1. Schematisch overzicht: Deze video toont de stappen die betrokken zijn bij het uitvoeren van de LIPS-test. Antigenen zijn uitgedrukt in Cos1 cellen als recombinant Renilla luciferase (RUC)-antigeen fusies, en ruwe extracten worden verkregen en gebruikt zonder zuivering. De LIPS test is een initiatief van incuberen crud e Ruc-antigeen extracten met de patiënt sera in microtiterputjes. Het antilichaam-antigen mengsel wordt vervolgens overgebracht naar een 96-well filter plaat met proteïne A / G kralen om een ​​IgG-moleculen vast te leggen. Na het wassen van de filter plaat met het proteïne A / G kralen, antilichaam gebonden Ruc-antigen wordt gemeten door de toevoeging van coelenterazine ondergrond en lichtunits worden gemeten met een luminometer. DEEL 1: Transfectie van plasmiden voor de productie van Renilla-Antigen fusieproteïnen Set-up: Cos1 cellen worden gekweekt in DMEM-10% FCS met behulp van standaard weefselkweek protocollen. Plasmiden voor Renilla luciferase fusies zijn eerder een beschreven. DNA voor deze plasmiden is bereid met behulp van een Midiprep kit van Qiagen. De opbrengst moet ongeveer 1 -3 mg. Meet de DNA-concentratie en opslaan als een 1000 ug / ml stockoplossing bij -20 ° C. Procedure: <ol><li> Een dag voor transfectie, split Cos-1-cellen in de nieuwe 100 x 20 mm gerechten op ongeveer 2 x 10 6 per plaat en incubeer bij 37 ° C. </li><li> Op de volgende dagen, dient de Cos-1-cellen worden 80-95% confluent. Label 1,5 ml polypropyleen microfugebuisje buizen voor elk plasmide DNA getransfecteerd worden. Laat de Fugene-6 transfectiereagens, die wordt opgeslagen bij 4 ° C, op te warmen tot kamertemperatuur. </li><li> Voeg 94 ul van Opti-MEM media aan elke microfugebuis. Voeg vervolgens 6 pl Fugene 6 tot en met de Opti-MEM media zonder het aanraken van de zijwand. </li><li> Incubeer dit mengsel gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Voeg 1-2 microgram (van 1mg/ml DNA voorraad) van plasmide voor Renilla luciferase antigen fusieconstruct. Meng en incubeer het mengsel gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Breng de DNA-Fugene 6-Opti-MEM oplossing voor de cellen door druppelen er gelijkmatig in de media van de Cos1 cellen. </li></ol> DEEL 2: Oogst Renilla-antigeen Fusions <ol><li> Twee dagen na transfectie, worden de Cos-1-cellen geoogst. Dit wordt geïnitieerd door het verwijderen van de media en vervolgens het spoelen van de cellen met 6 ml PBS. Na decanteren van de PBS, pipet weg eventuele resterende PBS uit de weefselkweek schotel. </li><li> Voeg 1,4 ml koud lysis buffer bestaat uit 50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl 2, 1% Triton X-100, 50% glycerol en proteaseremmers (2 tabletten van complete miniprotease inhibitor cocktail per 50 ml lysis buffer). Oogst cellen met een cel scrapper en zo snel mogelijk de helft van het lysaat aan elk van de twee 1,5 ml microfugebuisje buisjes op ijs. </li><li> Een Branson Sonifier 150 wordt gebruikt voor het breken van de cellen te openen. Plaats de microcentrifugebuis met het cellysaat op ijs en pols gedurende 5 sec, 5 sec en 5 sec met sonicatie instellingen van 2, 2 en 4, respectievelijk. </li><li> Centrifugeer de cellysaat bij 12.500 RPM voor twee vier minuten draait bij 4 ° C. Na de eerste spin, voorzichtig omkeren van de buizen naar de los bijgevoegde vuil te verwijderen uit de zijwand van de buis. Na de tweede spin, overdracht zorgvuldig het supernatans, zonder verstoring van de pellet, van de twee buizen tot een nieuwe microfugebuis op ijs. </li><li> Het berekenen van de licht-eenheden (GVE) per pi lysaat. Voor het meten van de LU: verdun 1 ui lysaat met 8 pi PBS in een nieuwe microfugebuis. Direct toe te voegen 100 ul van 1X coelenterazine substraat om de verdunde mengsel en onmiddellijk luminescentie te meten in de buis met behulp van een buis luminometer (20/20 n Turner Scientific) met een 5 seconden te lezen. </li><li> Bewaar de Ruc-antigen lysaat bij -20 ° C gedurende 1-2 dagen of op te slaan voor een langere periode van tijd in gelijke fracties bij -80 ° C. </li></ol> DEEL 3: Voorbereiden van een Sera Master Plate <ol><li> Maak een sera meester plaat door eerst toe te voegen 450 ul buffer A (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl 2, 1% Triton X-100) aan elk putje van een 96-deep-well polypropyleen microtiterplaat . Bij deze stap kan een kleurstof, Phenol Red, ook opgenomen worden in buffer A (uiteindelijke concentratie 0,2 mg / ml in buffer A) op te treden als een tracer voor de bewaking toekomst sera monster toevoegen en andere stappen van de lippen test. </li><li> Voeg vervolgens 50 ul van sera van elk monster naar de verschillende putjes die 450 ul buffer A. Merk op dat dit is een 1:10 verdunning van de sera in buffer A. Typisch sera wordt niet toegevoegd aan de laatste twee putjes van de master-plaat, omdat dit is gereserveerd voor de buffer losse flodders. </li><li> Voor het gebruik van de master plaat, is het uitvoerig geschud (1-2 uur) op een rotator platform. Het serum in de master plaat is staantwoordelijk voor ten minste 1 maand (of langer) bij 4 ° C, indien correct opgeslagen om verdamping te voorkomen. </li><li> Zoals hieronder beschreven, is deze meester plaat geeft 10 ul van de verdunde sera bij herhaling moet worden verwijderd voor profilering van de sera tegen meerdere antigenen. Grotere en kleinere meester platen kunnen ook worden gebruikt. Seal de plaat goed met Parafilm wanneer deze niet wordt gebruikt. </li></ol> DEEL 4: LIPS-test <ol><li> Polypropyleen 96-ondiepe goed microtiterplaten worden gebruikt om sera te testen. In de eerste stap, voeg 40 ul van buffer A aan elke well van de 96-well plaat met behulp van een 8-kanaals micropipet. </li><li> Vervolgens neemt 10 pi van de verdunde sera (1 pi sera equivalent) van de master bord en voeg het direct toe aan elke well van de werkende plaat met behulp van een 8-kanaals micropipet. </li><li> Een meester mix met het Ruc-antigen extract is naast zodanig geformuleerd dat 1 X 10 7 licht-eenheden (GVE) wordt toegevoegd in 50 ul buffer A aan elk putje. Lagere inputs (zo weinig als 1 X 10 6) kan ook worden gebruikt, maar resulteren in een lagere dynamisch bereik. Maak deze meester mengsel en pipet 50 ul van Ruc-antigeen mengsel aan elke well. </li><li> Incubeer de plaat op een rondschudapparaat gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. </li><li> Tijdens de incubatie, voeg 5 ul van een 30% suspensie van Ultralink proteïne A / G kralen (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) in PBS aan de onderkant van elk putje van een nieuwe 96 goed filter HTS plaat (Millipore, Bedford, MA) . </li><li> Na 1 uur incubatie, overdracht van de 100 pi Ruc-antigen antilichaam reactie-mengsel tot 96 goed filter HTS platen die het proteïne A / G kralen met behulp van een 8-kanaals micropipet. </li><li> Incubeer de 96-well filter plaat op een rondschudapparaat voor een extra uur bij kamertemperatuur. </li><li> Was dan het filter plaat op een vacuum spruitstuk. Elk goed is gewassen acht maal met 100 pi buffer A, gevolgd door twee maal met 100 pi PBS. Dit kan handmatig of met een robot pipetteren werkplek worden uitgevoerd. </li><li> Na de laatste wasbeurt, is het vacuüm uitgeschakeld. Verwijder het filter plaat en dep het droog met behulp van een stapel papieren handdoeken of filtreerpapier en zorg ervoor dat vocht te verwijderen op de boven-en onderkant van de plaat. </li></ol> DEEL 5: Meten Luminescentie en data-analyse Set-up: Een Berthold LB 960 Centro microplaat luminometer wordt gebruikt voor het bepalen van luminescentie in elk putje met een enkele injector. Zodra de machine op, spoel de injector met gedestilleerd H 2 O met behulp van de injector wascyclus. Coelenterazine ondergrond is opgesteld volgens de Promega Renilla substraat kit zoals beschreven door de fabrikant. Typisch 6 ml 1X coelenterazine substraat mix (dat wil zeggen 60 ul coelenterazine aandelen plus 6 ml 1X buffer) is voorbereid voor het vullen van de machine en draait een volle 96-well plaat. Voor het analyseren van de plaat, is het Berthold LB 960 Centro microplaat luminometer geprimed met 1X coelenterazine substraat. Open een programma bestand met de instelling voor het injecteren van de ondergrond en het lezen van de plaat. Voor deze metingen werd 50 ul van coelenterazine ondergrond wordt geïnjecteerd, wordt de plaat geschud gedurende 2 seconden, gevolgd door een 5 sec lezen van luminescentie. <ol><li> Hoewel de plaat luminometer heeft de capaciteit om de hele plaat te lezen, kan een gedeeltelijke lezen van de plaat ook geselecteerd worden (onder het lezen menu). Start het programma, dat initieert het lezen van de plaat. </li><li> Na de run, onmiddellijk te verwijderen van de microtiterplaat filter plaat te morsen te voorkomen in de luminometer. Exporteer de gegevens die zijn gegenereerd met de MikroWin programma in een Excel-formaat voor analyse. </li><li> Wij raden aan het evalueren van de sera van twee onafhankelijke runs. Gegevens worden vervolgens gemiddeld om de LU titer waarden genereren voor elk monster. Deze waarden kunnen verder worden aangepast aan de buffer blanks af te trekken. </li><li> Bijkomende data-analyse, zoals het bepalen van de cutoff kan worden berekend door het nemen van de gemiddelde plus 3 of 5 standaarddeviaties van de controle-waarden. </li></ol>

<ol><li>Burbelo, P. D., Goldman, R., Mattson, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+immunoprecipitation+method+for+quantitatively+measuring+antibody+responses+in+clinical+sera+samples+by+using+mammalian-produced+Renilla+luciferase-antigen+fusion+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A simplified immunoprecipitation method for quantitatively measuring antibody responses in clinical sera samples by using mammalian-produced Renilla luciferase-antigen fusion proteins.</a> BMC Biotechnol. 5, 22-22 (2005).</li>
<li>Burbelo, P. D., Leahy, H. P., Iadarola, M. J., Nutman, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Four-Antigen+Mixture+for+Rapid+Assessment+of+Onchocerca+volvulus+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">A Four-Antigen Mixture for Rapid Assessment of Onchocerca volvulus Infection.</a> PLoS Negl Trop Dis. 3, e438-e438 (2009).</li>
<li>Burbelo, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+and+robust+luminescent+profiling+of+anti-La+and+other+autoantibodies+in+Sj+gren%E2%80%99s+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">Sensitive and robust luminescent profiling of anti-La and other autoantibodies in Sj gren’s syndrome.</a> Autoimmunity. 139, 241-245 (2009).</li>
<li>Burbelo, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+antibody+quantification+and+generation+of+whole+proteome+antibody+response+profiles+using+LIPS+%28luciferase+immunoprecipitation+systems%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Rapid antibody quantification and generation of whole proteome antibody response profiles using LIPS (luciferase immunoprecipitation systems).</a> Biochem Biophys Res Commun. 352, 889-895 (2007).</li>
<li>Burbelo, P. D., Groot, S., Dalakas, M. C., Iadarola, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+definition+profiling+of+autoantibodies+to+glutamic+acid+decarboxylases+GAD65%2FGAD67+in+stiff-person+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">High definition profiling of autoantibodies to glutamic acid decarboxylases GAD65/GAD67 in stiff-person syndrome.</a> Biochem Biophys Res Commun. 366, 1-7 (2008).</li>
<li>Burbelo, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+luminescence+assay+for+autoantibodies+to+mammalian+cell-prepared+insulinoma-associated+protein+2%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">A new luminescence assay for autoantibodies to mammalian cell-prepared insulinoma-associated protein 2.</a> Diabetes Care. 31, 1824-1826 (2008).</li>
<li>Burbelo, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serological+diagnosis+of+human+herpes+simplex+virus+type+1+and+2+infections+by+luciferase+immunoprecipitation+system+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Vaccine+Immunol%22%5BJournal%5D)">Serological diagnosis of human herpes simplex virus type 1 and 2 infections by luciferase immunoprecipitation system assay.</a> Clin Vaccine Immunol. 16, 366-371 (2009).</li>
<li>Burbelo, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+quantitative+serological+detection+of+anti-cytomegalovirus+%28CMV%29+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">Highly quantitative serological detection of anti-cytomegalovirus (CMV) antibodies.</a> Virol J. 6, 45-45 (2009).</li>
<li>Burbelo, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four-antigen+mixture+containing+v-cyclin+for+serological+screening+of+human+herpesvirus+8+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Vaccine+Immunol%22%5BJournal%5D)">Four-antigen mixture containing v-cyclin for serological screening of human herpesvirus 8 infection.</a> Clin Vaccine Immunol. 16, 621-627 (2009).</li>
<li>Ramanathan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+luciferase+immunoprecipitation+systems+assay+enhances+the+sensitivity+and+specificity+of+diagnosis+of+Strongyloides+stercoralis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">A luciferase immunoprecipitation systems assay enhances the sensitivity and specificity of diagnosis of Strongyloides stercoralis infection.</a> J Infect Dis. 198, 444-451 (2008).</li>
</ol>

LIPS vereist een minimale test-optimalisatie en, vanwege de eenvoud, gegevens van hoge kwaliteit kan meestal worden gegenereerd met behulp van LIPS in minder dan twee weken voor een bepaalde antigeen. De meest tijdrovende stappen zijn het klonen en het genereren van de juiste plasmide expressievector die de Ruc-antigen fusie. Zodra deze plasmiden zijn gegenereerd, kunnen een of meerdere antigenen snel getest worden met LIPS zoals hierboven beschreven. Opgemerkt moet worden dat LIPS is heel veelzijdig zodanig dat sera ook kan worden getest in een buis formaat of als alternatief op een microtiter filter plaat met behulp van een robot BIOMEK werkstation 2 of een plaatwasser met vacuüm filtratie. Dit zeer schaalbaar systeem maakt het mogelijk om parallel LIPS profilering van een panel van menselijk autoantigenen 3 of de hele proteoom van een virus 4. Het is waarschijnlijk dat er veel verschillende antilichaam profielen die door LIPS zal nuttig zijn voor diagnostiek 3-9, antigeen ontdekking negen, na het verloop van een behandeling 10, vaccin monitoring en heeft grote gevolgen voor de specifieke ziekte staten en voor de volksgezondheid in het algemeen.

<table><tbody><tr><td>HiSpeed Plasmid Midi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12643</td><td></td></tr><tr><td>Weefselkweekschalen 100 x 20 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE 6</td><td>Roche Group</td><td>1814443</td><td></td></tr><tr><td>Complete, Mini protease-remmer cocktail</td><td>Roche Group</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>Polypropyleen 96 DeepWell 1 ml plaat</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-566-120</td><td>Deep well-plaat met deksel en afgesloten met Parafilm</td></tr><tr><td>Polypropyleen microtiterplaat</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-566-120</td><td></td></tr><tr><td>HTS-filterplaat</td><td>EMD Millipore</td><td>MSBVN1B50</td><td></td></tr><tr><td>Ultralink Immobilized Protein A/G</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>53133 (10ml)</td><td></td></tr><tr><td>Renilla Luciferase Assay System</td><td>Promega Corp.</td><td>E2820</td><td>Voor 2000 assays</td></tr><tr><td>Centro microplaat luminometer</td><td>Berthold Technologies</td><td>LB 960</td><td></td></tr></tbody></table>

antilichaam profiling door luciferase immunoprecipitatie systems (lips)

Antibody Profiling by Luciferase Immunoprecipitation Systems (LIPS)

Technologieën voor volledig te begrijpen en te kwantificeren antilichaam profielen om autoantigenen en infectieuze agentia kan zorgen voor nieuwe inzichten in ziektemechanismen en kunnen ophelderen nieuwe markers van de ziekte substratify met verschillende klinische kenmerken beter te begrijpen en pathogenese. We hebben een zeer kwantitatieve methode genaamd Luciferase Immunoprecipitatie Systems (LIPS) voor het profileren van de patiënt sera antilichaamrespons tegen autoantigenen en pathogeen antigenen geassocieerd met infectie. In tegenstelling tot de ELISA&#39;s, is het zeer gevoelig LIPS gemakkelijk geïmplementeerd om humorale serologische respons profielen onderzoek naar verschillende antigenen in een universeel formaat en produceert dynamische antilichaamtiter bereiken tot 6 loggen<sub&gt; 10</sub&gt; Voor sommige antigenen. In deze studies, kwantitatieve profilering door LIPS van de patiënt humorale responsen tegen panelen van antigenen of zelfs de gehele proteoom van een aantal pathogenen (bijv. HIV), is meestal meer informatief dan het testen van een enkel antigeen met behulp van ELISA. Daarnaast LIPS elimineert ook tijd en moeite die nodig is om sterk gezuiverde antigenen evenals de arbeidsintensieve test optimalisatie stappen die nodig zijn voor de standaard ELISA&#39;s te produceren. Hier hebben we een gedetailleerd protocol beschrijft de technische aspecten van het uitvoeren van LIPS testen voor gemakkelijk profilering antilichaamrespons tegen een of meerdere antigenen.

De technische aspecten van het uitvoeren van LIPS (Luciferase Immunoprecipitatie Systems) worden beschreven. De algemene benadering bestaat uiten chimere genen die coderen voor antigenen gefuseerd met Renilla luciferase (RUC) in zoogdiercellen. Ruwe Ruc-antigeen extracten worden dan voorbereid en, zonder zuivering, werkzaam in de immunoprecipitatie testen op antilichamen te kwantificeren.

Antilichaam Profiling door Luciferase Immunoprecipitatie Systems (LIPS)

Technologieën voor het uitgebreid begrijpen en kwantificeren van antilichaamprofielen tegen autoantigenen en infectieuze agentia kunnen nieuwe inzichten bieden in ziekten ...

Deze video demonstreert de stappen die komen kijken bij het uitvoeren van de lips. Assay-antigenen worden tot expressie gebracht in CO one-cellen als recombinante ran vanilla luciferase- of rook-antigeenfusies. Ruwe extracten worden verkregen en gebruikt zonder zuivering.De LIPS-assay wordt gestart door ruwe rookantigeenextracten te incuberen met SRA van de patiënt. In microtiterputjes wordt het antilichaam-antigeenmengsel vervolgens overgebracht naar een filterplaat met 96 putjes die Proteïne A/G-beads bevatten om IgG-moleculen op te vangen, nadat de filterplaat met de Proteïne AG-beads is gewassen. Antilichaam-gebonden rookantigeen wordt bepaald door toevoeging van lumine-substraat en de lichteenheden worden gemeten met een luminometer.Hallo, ik ben Dr. Catherine Chang van het Laboratory of Sensory Biology aan het National Institute of Dental and Craniofacial Research. Vandaag laten we u de procedure zien voor lips-luciferase immunoprecipitatiesystemen. We gebruiken lips in ons laboratorium om antilichaamtiters te meten voor het diagnosticeren van ziekten en/of infecties.Subst stratify ziektestadia, het monitoren van vaccinaties en andere toepassingen waarbij het genereren van antilichaamprofielen betrokken is. Laten we beginnen. Voordat de transfectie start, worden de plasmiden voor vanilla luciferase-fusies vooraf klaargemaakt zoals beschreven in het BMC biotechnology-artikel.BYO et al. 2005 plasmisch DNA wordt geprepareerd met een MIDI-prepkit met een opbrengst van één tot drie milligram en bewaard als een voorraadoplossing van één milligram per milliliter bij -20 °C. Cost one-cellen die voor transfectie worden gebruikt, worden gekweekt in DMEM met 10% FCS volgens standaard protocollen voor weefselkweek. Splits de cost one-cellen één dag voor de transfectie in nieuwe schalen van 100 bij 20 millimeter tot ongeveer 2 × 10⁶ cellen per plaat en incubeer deze op de volgende dag bij 37 °C.De cellen moeten 80 tot 95% confluent zijn. Laat het FUgene 6 transfectiereagens, dat bij vier graden Celsius wordt bewaard, opwarmen tot kamertemperatuur. Terwijl het FUgene opwarmt, labelt u 1,5 milliliter polypropyleen microcentrifugebuisjes voor elk te transfecteren plasmida-DNA, waarbij u voorzichtig bent dat u de zijwand van de buisjes niet aanraakt. Voeg zes microliters FUgene 6 toe aan de buisjes, die al 94 microliters optimum medium moeten bevatten; incubeer vijf minuten bij kamertemperatuur. Voeg één tot twee micrograms plasmide voor het luciferase-antigeen fusieconstruct toe. Meng door het buisje enkele keren om te keren, centrifugeer kort en incubeer 15 minuten bij kamertemperatuur.Breng de volledige DNA-fusiezes-optimale oplossing over naar de cellen door deze gelijkmatig in het medium van de cos. Eén cellen incuberen de getransfecteerde cos-één-cellen gedurende twee dagen en oogsten deze vervolgens. Om te beginnen met het oogsten van het fusie-eiwit, verwijdert u het medium en wast u de cellen met 6 ml PBS.Pipette elk residu PBS uit de weefselkweekschaal, voeg 1,4 milliliter koude lysisbuffer toe en oogst de cellen met een celschraper. Draag vervolgens snel de helft van het lysaat over naar elk van de twee 1,5 milliliter microcentrifugebuisjes op ijs. Een Branson SOLIDIFIER one 50 wordt gebruikt om de cellen open te breken. Plaats het microcentrifugebuisje met het cellysaat op ijs en zet het apparaat vijf seconden in pulsvorm.Vijf seconden en vijf seconden. Met sonicatie-instellingen van respectievelijk twee, twee en vier. Centrifugeer het cellysaat bij 12.500 RPM gedurende vier minuten.Centrifuge bij vier graden Celsius. Keer de buisjes tussen de centrifugatiestappen voorzichtig om om loszittend debris van de wand van de buisjes te verwijderen. Draag vervolgens het supernatant vanuit de twee buisjes zorgvuldig over naar een nieuw microcentrifugebuisje op ijs, zonder het pellet te verstoren.Om de lichteenheden of lu van het lysaat te meten, verdunt u één µL lysaat met acht µL PBS in een nieuwe microcentrifugebuis. Voeg direct 100 µL OneClentIne-substraat toe aan het verdunde mengsel en meet onmiddellijk de luminescentie in de buis met een buisluminometer met een meettijd van vijf seconden vanaf deze stap. Vergeet niet veiligheidsmaatregelen te nemen bij het werken met menselijke en dierlijke monsters. Om een serum-masterplaat te maken, die dient als bron van patiëntantilichamen voor antigeenprofilering, voegt u eerst 450 µL buffer A toe aan elke well van een 96-wellse diepe polypropylene microtiterplaat.Bij deze stap kan ook de kleurstof fenolrood aan buffer A worden toegevoegd om als tracer te dienen bij het monitoren van toekomstige SRA-monsterbehandelingen en andere stappen van de lips-assay. Voeg vervolgens 50 µL serum van elk monster toe aan elke put die 450 µL buffer bevat. Ter attentie: dit is een verdunning van de SRA in buffer van 1 op 10.Normaal gesproken wordt er geen SRA toegevoegd aan de laatste twee putjes van de masterplaat, aangezien deze gereserveerd zijn voor de bufferblanco's voordat de masterplaat wordt bewaard voor toekomstig gebruik. De plaat wordt gedurende één tot twee uur uitgebreid geschud op een rotatieplatform. Bij 650 RPM is het serum ten minste één maand of langer stabiel bij vier graden Celsius en kan de plaat met parafilm worden afgesloten om verdamping te voorkomen als deze wordt bewaard vóór het uitvoeren van de lips-assay. Maak een spreadsheet met de monsteridentificatienummers en de bijbehorende putjes op de masterplaat; er worden polypropyleen 96-wells ondiepe microtiterplaten gebruikt als werkplaten om sera te testen.Voeg in de eerste stap met een achtkanals micropipet 40 µL buffer A toe aan elke put van de 96-puttsplaat. Neem vervolgens 10 µL verdund serum van de masterplaat en voeg dit met een achtkanals micropipet direct toe aan elke put van de werkplaat. Seal de masterplaat na gebruik met parafilm, plaats het deksel terug op de masterplaat, dek deze vervolgens af met Saran wrap en bewaar bij 4 °C.Vervolgens wordt een mastermix geformuleerd die het rookantigeenextract bevat, zodanig dat 1 x 10⁷ IU wordt toegevoegd aan 50 µL buffer A per putje. Maak dit mastermix-mengsel en pipetteer 50 µL van het rookantigeenmengsel in elk putje. Dek de plaat af met een polystyreenplaatdeksel en incubeer deze op een rotatieschudder bij 100 RPM gedurende één uur.Haal tijdens de incubatie bij kamertemperatuur een aliquot van 1,5 milliliter van een 30% ultra link protein ag-bead-suspensie in PBS uit de koelkast. Voeg vijf microliters toe aan de bodem van elke well van een nieuwe 96-well filter HTS-plaat. Na de incubatie van de plaat van één uur wordt de 100 microliters van het rook-antigeen-antilichaam-reactiemengsel met een multichannel-pipet overgebracht naar de 96-well filter HTS-platen die de protein ag-beads bevatten. Incubeer de 96-well filterplaat gedurende nog een uur op een rotatieschudder bij 100 RPM bij kamertemperatuur.Was vervolgens de filterplaat met behulp van een Biome FX automatiseringswerkstation. Met een vacuümm manifold wordt elke well acht keer gewassen met 100 µL buffer A, gevolgd door twee keer 100 µL PBS; na de laatste wasbeurt wordt het vacuüm uitgeschakeld. Verwijder de filterplaat en dep deze droog met een stapel papieren handdoeken of filterpapier, waarbij u er zeker van bent dat het vocht aan zowel de boven- als onderkant van de plaat is verwijderd. Een Burt hold LB nine 60 Centro Microplate luminometer wordt gebruikt om de luminescentie in elke well van de plaat te bepalen.Zet het apparaat aan en spoel de injector met gedestilleerd water. Gebruik de wascyclus van de injector. Voor het primen en bedienen van het apparaat wordt INE-substraat gebruikt, dat wordt bereid met de Promega ranil-substraatkit volgens de instructies van de fabrikant; doorgaans zijn zes milliliter van de ene uitstekende tijd substraatmix nodig voor één plaat. Laad het substraatmengsel in de luminometer en open een programmaprofiel met de instellingen voor het injecteren van het substraat en het uitlezen van de plaat.Voor deze metingen wordt 50 µL substraat geïnjecteerd. De plaat wordt twee seconden geschud, gevolgd door een luminescentiemeting van vijf seconden.Start het programma dat het uitlezen van de plaat na de run initieert en verwijder onmiddellijk de microtiterfilterplaat om morsen in de luminometer te voorkomen. De gegevens worden automatisch vanuit het microwind-programma geëxporteerd naar een Excel-formaat voor verdere analyse. Bereken het gemiddelde van de resultaten van twee verschillende runs met dezelfde sera.Om lu-titerwaarden te genereren, wordt aanbevolen dit voor elk monster te doen. De dubbele monsters moeten een hoge concordantie in titerwaarden tussen de twee runs vertonen. Voor het plotten van gegevens kunnen de lu-titerwaarden verder worden aangepast door de bufferblanco's af te trekken, zoals hier wordt getoond.De sensitiviteit en specificiteit van de assay kunnen ook worden berekend door gebruik te maken van afkapwaarden afgeleid van het gemiddelde plus drie of vijf standaarddeviaties van de controlemonsters. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe antilichaamtiters gemeten kunnen worden met behulp van LIPS. LIPS vereist minimale optimalisatie van de assay en kan vanwege de eenvoud worden gebruikt om in minder dan twee weken hoogwaardige gegevens te genereren voor elk gegeven antigeen. Bij het werken met menselijke sera is het belangrijk om rekening te houden met de passende veiligheidsmaatregelen.Houd er rekening mee dat LIFT zeer schaalbaar is en daarom kan worden gebruikt om een klein aantal monsters te meten via handmatig wassen, of een volledige plaat met behulp van een robotisch werkstation. Vanwege deze veelzijdigheid denken wij dat LIFT zeer nuttig zal zijn bij sero-antigene analyse en brede implicaties zal hebben voor ziekteanalyse en de volksgezondheid in het algemeen. Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw antilichaamprofiel-experimenten.

antibody-profiling-by-luciferase-immunoprecipitation-systems-lips

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een ELISA kan gemakkelijk worden omgezet Luminex xMAP assay en door de voordelen van multiplexing verschillende antilichamen tegelijkertijd worden gescreend voor een optimale antilichaam paar identificeren resulteert in een verhoogde gevoeligheid en dynamisch bereik, met minder kosten assay.

Omzetting van een Capture ELISA aan een Luminex xMAP test met behulp van een Multiplex Antilichaam screeningsmethode

The video demonstrates the luciferase assay used to quantify luciferase-tagged proteins. The assay uses an engineered luciferase enzyme composed of a large fragment that binds with the small fragment, which is conjugated with a protein of interest. The bound subunits form an active enzyme that, in the presence of the substrate, releases a luminescent signal. This signal is then quantified using a luminometer.

The Luciferase Assay: A High-Throughput Assay to Measure Luminescent Signals Using Engineered Nanoluciferase System-Based Bioreporters

This video demonstrates the use of the ELISpot assay to assess the function of antibody-secreting B cells, ASCs. The antibodies secreted by the ASCs interact with the membrane-bound polyclonal antibody fragments, which are detected by the enzyme-conjugated IgG or IgM antibodies. The colored spot produced in each well indicates the presence of the specific antibody's isotype, which correlates with the B cells' secretory activity.

Functional Assessment of Antibody-Secreting B Cells Using ELISpot Assay

Eiwit-eiwit interacties kunnen zowel in de kern als in het cytoplasma van een cel optreden. Om deze interacties te onderzoeken, worden traditionele co-immunoprecipitatie en moderne proximity ligatie-assay toegepast. In deze studie vergelijken we deze twee methoden om de verdeling van NF90-RBM3 interacties in de kern en het cytoplasma te visualiseren.

Visualisatie van eiwit-eiwit interacties in nucleaire en cytoplasmatische fracties door Co-immunoprecipitatie en<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity Ligatie Assay

Een capillair gebaseerde-immunoassay met een commercieel platform om te meten doel eiwitten uit totaal eiwit preparaten wordt aangetoond. Daarnaast zijn assay parameters van blootstellingstijd, eiwitconcentratie en verdunning van de antilichamen geoptimaliseerd voor een model van de celcultuur.

Procedure en belangrijkste optimalisatie strategieën voor een geautomatiseerde capillaire elektroforetische gebaseerde Immunoassay-methode

Het onderzoeken van meerdere, kunnen endogene posttranslationele modificaties voor een eiwit-doelstelling zeer uitdagend. De hier beschreven technieken gebruiken een geoptimaliseerde lysis buffer en filter systeem ontwikkeld met specifieke PTM-targeting, affiniteit matrices te sporen van de acetylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3 en tyrosine fosforylering wijzigingen voor een doel eiwit met behulp van een enkele, gestroomlijnde systeem.

Met behulp van een uitgebreide Immunoprecipitation verrijking systeem ter identificatie van het profiel van een endogene posttranslationele wijziging voor Target eiwitten

Hier, laten we zien hoe een nabijheid afbinding Assay (PLA) gebruiken om te visualiseren van MST1/MST2 heterodimerization in vaste cellen met hoge gevoeligheid.

Detectie van Heterodimerization van eiwit Isoforms met behulp van een in Situ nabijheid afbinding Assay

Hier presenteren we een luciferase gebaseerde biosensor om te kwantificeren van het kinaseactiviteit van grote tumor suppressor (LATS)-een centrale kinase in de Hippo signalering traject. Deze biosensor heeft diverse toepassingen bij fundamenteel en translationeel onderzoek gericht op het onderzoeken van Hippo traject regelgevers in vitro en in vivo.

Controle van Hippo signalering Pathway activiteit met behulp van een Biosensor Luciferase gebaseerde grote Tumor Suppressor (LATS)

De BSelex-methode om individuele antigeen-specifieke antilichamen van humane perifere bloed mononucleaire cellen te identificeren en te herstellen combineert Flowcytometrie met eencellige PCR en klonen.

Eencellige screening methode voor de selectie en terugwinning van antilichamen met de gewenste specifieke kenmerken van verrijkte menselijke geheugen B-celpopulaties

Het geschetste protocol beschrijft de procedure voor de productie van het HiBiT-receptor-bindende domeineiwitcomplex en de toepassing ervan voor snelle en gevoelige detectie van SARS-CoV-2-antilichamen.

Detectie van SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody met behulp van een HiBiT-gebaseerde Bioreporter

Leer Luciferase Immunoprecipitation Systems (LIPS) voor antilichaamprofilering met COS-1-cellen en ruwe extracten. Deze efficiënte methode kwantificeert antilichamen via luminescentiemeting voor diagnostiek en onderzoek.

Antilichaam Profiling door Luciferase Immunoprecipitatie Systems (LIPS)

Meer video's verkennen