Primer Uitbreiding Capture: Gerichte Sequence Retrieval uit zwaar vervuild DNA Bronnen

Deze video legt de primer extension capture- of PECA-techniek uit, waarmee gerichte terugwinning van DNA-sequenties uit extreem laaggekopieerde, sterk gefragmenteerde DNA-bronnen mogelijk is. We hebben deze techniek gebruikt om volledige mitochondriale genomen te sequensen uit neanderthalerbotten van meer dan 40.000 jaar oud, en de methode kan worden gebruikt voor de capture van elke kleine doelregio of enkelvoudige nucleotidepolymorfismen van meerdere individuen. De belangrijkste stappen in deze procedure zijn PCR-amplificatie van een primaire DNA-bibliotheek, kwantificering van de geamplificeerde bibliotheek via kwantitatieve PCR, primaire extensie van het doelwit op de geamplificeerde bibliotheek, bead-capture van primaire extensieproducten om niet-doelwitfragmenten te verwijderen, en elutie en sequencing van de gecapturede en gewassen doelwitten.

Hallo, ik ben Adrian Briggs van het lab van Shanti Payable in de afdeling Genetica van het Max Planck Institute for Evolutionary Anthropology in Leipzig. Vandaag laten we u een procedure zien voor het isoleren van specifieke DNA-sequenties van belang uit een complexe, sterk gedegradeerde DNA-bron, zoals oude botten. Wij hebben deze procedure gebruikt om de mitochondriale genetische diversiteit van Homo neanderthalensis, oftewel de neanderthaler, te bestuderen.

Laten we beginnen. Het DNA dat in ons experiment wordt gebruikt, is afkomstig van Neanderthalerbotten van tussen de 40.000 en 70.000 jaar oud, die zijn gevonden op verschillende vindplaatsen over het geografische verspreidingsgebied van de Neanderthaler. Een bot wordt eerst een nacht lang blootgesteld aan UV-licht om het oppervlak te ontsmetten van elk vreemd DNA.

Een fijne boor wordt gebruikt om tussen 100 en 500 milligram botpoeder te produceren. DNA wordt uit het botpoeder geëxtraheerd met behulp van een procedure die is beschreven in het artikel uit 2007 "comparison and optimization of ancient DNA extraction" door Nadine Rockland en Michael Hof. Het DNA-extract wordt vervolgens omgezet in een sequencingsbibliotheek door het toevoegen van universele adapter-primerplaatsen aan het uiteinde van alle DNA-fragmenten, omdat een 4 5 4-bibliotheek gegenereerd uit een Neanderthalerbot slechts zeer kleine hoeveelheden DNA bevat, soms slechts enkele picogrammen. Deze primaire DNA-bibliotheek wordt eerst geamplificeerd via PCR met behulp van emulsie-PCR-primers die overeenkomen met de universele bibliotheekprimers.

Combineer de volgende reagentia in een PCR-buis om de PCR-mix voor library-amplificatie voor te bereiden: 10 µL 10 X GAMP PCR-buffer, 2 µL magnesiumchloride, 2 µL BSA, 1 µL dNTP-mix, telkens 3 µL van de 4 54 MPCR forward- en reverse-primers, 1 µL Amply Gold DNA-polymerase en 25 µL library-template. Voeg ten slotte 45 µL PCR-water toe om een totaalvolume van 100 µL te verkrijgen. Amply Tech Gold DNA-polymerase is stabiel bij kamertemperatuur, waardoor werken op ijs niet noodzakelijk is.

Nadat de PCR-reactie is voorbereid, wordt de PCR-buis in een thermocycler geplaatst, beginnend met een denaturatiestap van 95 °C gedurende 12 minuten, gevolgd door 14 cycli van 95 °C gedurende 30 seconden, 60 °C gedurende één minuut en 72 °C gedurende één minuut. Stel na deze 14 cycli een finale stap in van 72 °C gedurende vijf minuten, waarna de PCR-buis onbeperkt op 10 °C kan worden bewaard tot gebruik nadat de PCR-amplificatie is voltooid. Vervolg met de zuivering van het PCR-product met behulp van een Kyogen MinLu spincolumn volgens de instructies van de fabrikant en elueer het DNA van de column met 50 µL EB-buffer die bij de MinLu-kit is geleverd, voorafgaand aan de primaire extensie en productcapture.

Kwantitatieve PCR moet worden uitgevoerd op aliquaten van de niet-geamplificeerde en geamplificeerde libraries om de hoeveelheid en de kwaliteit van het geamplificeerde library-product te kwantificeren en te controleren. De na 14 cycli geamplificeerde library moet meerdere duizenden keren meer DNA bevatten dan de primaire library. Als dit niet het geval is, moeten de amplificatiecondities worden gecontroleerd en herhaald.

Primaire extensie-capture-primers, die worden gebruikt om de sequenties van belang uit de geamplificeerde library te vangen, moeten worden ontworpen als normale PCR-primers om overeen te komen met een gewenste doelregio, met een ideale smelttemperatuur van 60 °C aan het 5'-uiteinde van elk van deze doelsequenties bij deze 12 base-staartsequentie, en moeten een biotine-residu aan het 5'-uiteinde bevatten. Tot 150 PEC-primers kunnen samen worden gebruikt in een enkele multiplex-mix, bereid uit stocks van 200 µM. Bereid voor de primaire extensiereactie een PCR-mix in een geschikte PCR-buis door 5 µL 10 X GAMP PCR-buffer, 2,5 µL magnesiumchloride, 1 µL BSA en 0,5 µL dNTPs toe te voegen. Meng 5 µL van de primaire extensie-capture-primermix, 0,5 µL Taq Gold DNA-polymerase, 2 µL van het 14 cycli geamplificeerde library-DNA en tot slot 31 µL PCR-kwaliteitswater om een totaal volume van 50 µL te verkrijgen.

Als de geamplificeerde library-template meer dan 1 × 10¹² kopieën per microliter bevat, moet de template eerst worden verdund met EB-buffer, zodat er niet meer dan 2 × 10¹² kopieën aan het reactiemengsel worden toegevoegd. Plaats de PCR-buis na bereiding in de thermocycler en stel deze in voor één reactieronde. Begin met een denaturatie van 12 minuten bij 95 °C, gevolgd door één minuut bij 60 °C en vijf minuten bij 72 °C voor de primaire extensie.

En wanneer de enkele cyclus is voltooid, wordt de temperatuur op 72 °C gehouden om het PCR-product te behouden tot de volgende stap. Om aspecifieke primer-annealing te voorkomen en direct te capturen, voegt men 150 µL PBI- of PB-buffer uit de Kyogen DNA-purificatiekit toe aan de PCR-reactiebuisjes, terwijl het reactiemengsel in de thermocycler blijft op 72 °C. Door dit te doen, wordt de polymerase geïnactiveerd terwijl de temperatuur te hoog is voor aspecifieke extensie van de doelprimers; sluit de buisjes, vortex kort en centrifugeer vervolgens de vloeistof met een benchtop-centrifuge.

Gebruik in deze stap uitsluitend PBI- of PB-buffer, aangezien andere bindingsbuffers, zoals Qiagen PM-buffer, het daaropvolgende captureproces kunnen verstoren. Verplaats vervolgens het mengsel uit de PCR-buis naar een Rogen MinLu spincolumn voor zuivering volgens de instructies van de fabrikant, zoals eerder is gedaan, en elueer het DNA uit de column met 30 µL EB-buffer die bij de MinLu-kit is geleverd. Om alle fragmenten te verwijderen die niet zijn gebonden aan de PEC-primers, wordt een bead-gebaseerde capturestap uitgevoerd.

Resuspend eerst een voorraadoplossing van M 270 strip divide-beads door te vortexen en neem een hoeveelheid beads af die overeenkomt met 25 µL per monster. Was de beads twee keer met 500 µL twee keer BW-buffer en resuspend in hetzelfde volume twee keer BW als het oorspronkelijk afgenomen volume beads. Bereid 25 µL van de suspensie.

Voeg voor elk monster 25 µL van het gezuiverde geëlueerde DNA toe aan 25 µL van de kraalsuspensie, waarbij de resterende vijf µL worden bewaard voor latere kwantificering. Meng het DNA en de kraalsuspensie door herhaaldelijk te pipetteren en te roeren met de pipetpunt, en roteer vervolgens langzaam op een benchtop-rotator gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Draag na het mengen de inhoud over naar een nieuwe PCR-buis van 1,5 mL.

Tijdens de voorgaande rotatie-incubatiestap kan een deel van het niet-doel-DNA aan de wand van de buis zijn blijven kleven. Het overbrengen van de kraal-suspensie naar een nieuwe buis voorkomt daarom de mogelijkheid dat dit niet-doel-DNA in de eindproducten terechtkomt. Gebruik tijdens de hitte-elutiestap de magnetische partikelcollector om de kralen te pelletteren; na 10 tot 20 seconden zullen alle kralen naar de wand zijn gemigreerd, waardoor een helder supernatant overblijft dat verwijderd moet worden om de kralen te wassen. Voeg 500 µL van één keer BW-buffer toe aan de buis en vortex ongeveer drie seconden op lage snelheid.

Zowel met de buis rechtopstaand als omgekeerd mogen er geen kralen aan de wand van de buis blijven kleven. Centrifugeer de suspensie één tot drie seconden in een tafelcentrifuge, net lang genoeg om alle vloeistof van de wanden van de buis te trekken. Plaats de buis terug in de MPC en wacht 10 tot 20 seconden tot alle kralen zich aan de zijkant van de buis hebben verzameld.

Verwijder vervolgens het supernatant van de SUP. De eerste wasbeurt is nu voltooid. Herhaal deze procedure nog vier keer, na de laatste wasbeurt met BW en het verwijderen van het supernatant.

Voeg 500 µL van één keer hot wash buffer toe. Meng de suspensie door kort te vortexen en te centrifugeren zoals eerder beschreven, en schud de buis vervolgens twee minuten lang bij 65 °C op een thermische blokshaker bij 1000 RPM, gevolgd door een korte centrifugatie om sporen van het supernatant te verwijderen binnen één minuut na het weghalen uit het thermische blok. Deze stap verwijdert fragmenten die mogelijk binden aan PEC-primers, maar die niet zijn verlengd tijdens de primer-extensiestap. Resuspendeer het pellet in 30 µL EB-buffer en breng het mengsel over naar een nieuwe 1,5 mL PCR-buis.

Incubeer de buis in de thermocycler bij 95 °C gedurende drie minuten. Pelleteer de beads in de magnetische partikelcollector. Het duurt 10 tot 20 seconden voordat het supernatant volledig helder is; breng het S-supernatant vervolgens over naar een nieuwe, gelabelde buis.

Zorg ervoor dat er geen kralen worden overgebracht. Bewaar het supernatant, dat het gevangen product van DNA-fragmenten bevat. De kralen kunnen in deze fase worden weggegooid.

Om het gevangen product te amplificeren, bereid een PCR-mix voor tot een totaalvolume van 100 microliters zoals gedaan in deel twee en voer dezelfde PCR-cycluscondities uit. Na voltooiing van de PCR-amplificatie van het gevangen product volgt wederom zuivering met behulp van een Qiagen Ute spin-kolom zoals eerder beschreven in sectie twee; elueer het DNA uit de kolom met 50 microliters Eeb-buffer, waarna het product gereed is voor high-throughput sequencing. We hebben 574 PEC-primers ontworpen om het volledige mitochondriale genoom van de Neanderthaler te bestrijken.

We hebben deze verdeeld over vier multiplex-mengsels en twee seriële rondes van primaire extensie-capture op libraries van vijf Neanderthalerfossielen uit vier locaties verspreid over Eurazië, gedateerd tussen 40.000 en 70.000 jaar oud, waarbij tussen 170.000 en 500.000 sequenties per individu werden gegenereerd en de resultaten werden uitgelijnd met een mitochondriale referentiesequentie. We stelden vast dat de PEC-procedure het mitochondriaal DNA massaal had verrijkt, waardoor een volledige dekking van het mitochondriaal DNA voor elk individu werd bereikt met een gemiddelde dekking tussen 18 en 56,3 keer. Met deze resultaten konden we een hoogwaardige, volledige mitochondriale genoomsequentie voor elk individu genereren.

Vervolgens voerden we een fylogenetische vergelijking uit van deze sequenties met een wereldwijde steekproef van hedendaagse mensen en onze nauwst verwante levende soorten, de chimpansee en de bonobo. Dit bevestigde eerdere bevindingen dat mitochondriaal DNA van neandertallers nauw verwant is aan, maar duidelijk verschilt van dat van moderne mensen. Bovendien bleek uit een vergelijking tussen de neandertallensequenties zelf dat er een extreem lage genetische diversiteit was bij neandertallers, lager dan bij mensen wereldwijd vandaag de dag, en vergelijkbaar met die van hedendaagse Europeanen.

Dit bewijs, gecombineerd met een analyse van de eiwitevolutie in de Neanderthaler-sequenties, suggereert dat Neanderthalers een langdurig kleine populatieomvang hadden. Dit is consistent met archeologische bewijzen waaruit blijkt dat de populatiedichtheid van Neanderthalers nooit de niveaus bereikte die door moderne mensen werden behaald. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe primate extension capture wordt uitgevoerd om doelsequenties te amplificeren en te vangen ter voorbereiding op high-throughput sequencing. Bij het volgen van deze procedure is het essentieel om alle temperatuurspecificaties van de thermocycler strikt op te volgen. Houd er echter rekening mee dat primers verschillende annealing-temperaturen kunnen hebben, waardoor u de annealing-temperatuur mogelijk moet aanpassen aan uw specifieke primers. Wees daarnaast zorgvuldig tijdens alle wasstappen om zoveel mogelijk vloeistof te verwijderen.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.