Cellulaire Encapsulation in 3D Hydrogelen voor Tissue Engineering

Het stapsgewijze proces voor het inkapselen van cellen begint met de preparatie en sterilisatie van hydrogelmallen en andere materialen, gevolgd door de isolatie van cellen in individuele populaties, in buisjes voor elke gelset. De gelering wordt vervolgens uitgevoerd in aanwezigheid van cellen, gevolgd door de in vitro of in vivo incubatieperiode. Latere analyses van het celgedrag kunnen tests voor levensvatbaarheid, morfologie, proliferatie en differentiatie omvatten.

Hallo, ik ben Amidio Kahan van het laboratorium van Dr. Jason Burdick van de afdeling Bioengineering aan de University of Pennsylvania. Vandaag tonen we u een procedure voor cellulaire inkapseling in 3D-hydrogels voor weefselengineering. Wij gebruiken deze procedure om de effecten van de samenstelling en structuur van de hydrogel op het gedrag van ingekapselde cellen te bestuderen.

Laten we beginnen. Bereid voor deze procedure een 0,5% gewichtsoplossing van de foto-initiator air cure 2 9 5 9 of I 2 9 5 9 in PBS. Meng en incubeer gedurende twee tot drie dagen in het donker bij 37 °C.

Gebruik, zodra u klaar bent, een spuitfilter om de oplossing te steriliseren en bewaar deze bij kamertemperatuur. Gebruik vervolgens een spreadsheetprogramma zoals Microsoft Excel om de benodigde hoeveelheid polymeer en crosslinker te berekenen zoals gedemonstreerd. Hier is hyaluronzuur gefunctionaliseerd met acrylaat-reactieve groepen.

Bereken ook de hoeveelheid van het pendant peptide dat het functionele adhesiedomein bevat met de aminozuren cystine, arginine, glycine en aspartaat. Het cystine dient voor de koppeling aan het polymeer. Nu de vereiste hoeveelheden polymeer-crosslinker en pent zijn bepaald, kunnen deze worden afgewogen en elk in een eppendorfbuis worden geplaatst.

Pas het rekenblad dienovereenkomstig aan. Ga verder naar het voorbereiden van de gelmallen voor de daadwerkelijke massa van het verkregen polymeer. Gebruik een scheermesje om de uiteinden van de individueel verpakte steriele materialen af te snijden.

Wegwerpspuiten van één milliliter. Zorg voor een vlakke snede voor de mallen die worden gebruikt voor fotopatronen naar gels. Steriliseer tot slot de spuitmallen, EOR-buisjes met opene doppen en alle andere benodigde materialen door ze gedurende 30 minuten onder een kiemdodend lichtbron in de biologische veiligheidskabinet te plaatsen.

Zodra de sterilisatie is voltooid, kunnen de cellen worden voorbereid nadat de experimentele apparatuur is gesteriliseerd. Werk in de zuurkast en voeg steriele TEA toe aan het polymeer dat wordt gebruikt voor de mical-type crosslinking en steriele PBS aan het polymeer dat wordt gebruikt voor de vrije radicaal crosslinking. VOEG de bijbehorende buffer toe aan de buisjes met de pendant moiety en vortex deze.

Om de hangergroep te binden aan het gealkyleerde hyaluronzuur via een thiol uit een INE-groep op het peptide om de hangergroep aan het polymeer te koppelen, voegt u deze toe aan de polymeeroplossing en sluit u deze af met param. Vortex kortstondig en incubeer bij 37 °C onder menging. Terwijl de hangergroep wordt gekoppeld, bereidt u de te encapsuleren cellen voor, in dit geval menselijke mesenchymale stamcellen of hMSCs, door ze te wassen met PBS.

Incubeer vervolgens gedurende één minuut met trypsine bij kamertemperatuur, verwijder de trypsine en incubeer nog vijf minuten bij 37 °C. Voeg daarna HMSC-groeimedium toe om de trypsine te neutraliseren en de cellen van het plaatsoppervlak los te maken. Tel de cellen met een hemocytometer.

Verdeel de getelde cellen in porties met het juiste aantal voor elke set gels. Voor een set van drie 50 µL gels met een dichtheid van 10 miljoen cellen per milliliter, verdeel 1,5 miljoen cellen over een individuele conische buis. Bereid niet meer dan vier gels in een individuele set vanwege de timing van de procedure.

Centrifugeer de cellen vervolgens bij 500 RCF gedurende zes minuten. Terwijl de cellen sedimenteren bij kamertemperatuur, bereidt u het polymerisatiemengsel voor de mical edition crosslinking. Voeg buffer toe aan de crosslinker om de juiste concentratie te bereiken.

Voeg voor de lichtgeïnitieerde vrije radicaal-crosslinking de eerder bereide I 2 9 5 9-oplossing toe aan de polymeeroplossing. Gebruik 10% van het totale gelvolume voor een uiteindelijke initiatorconcentratie van 0,05% gewicht. De cellen en het polymerisatiemengsel zijn nu klaar voor inkapseling in de hydrogel.

Begin met het aspireren van het supernatant uit de gecentrifugeerde cellen. Wacht nadat de eerste aspiratie is voltooid tot de vloeistof is gezakt en aspireer opnieuw om zoveel mogelijk medium te verwijderen zonder het celpellet te verstoren. Resuspendeer het celpellet met de polymeeroplossing om luchtbellen te voorkomen.

Pipetteer de oplossing langzaam ongeveer 10 keer op en neer; dit moet voldoende zijn om de cellen gelijkmatig te verdelen. Gebruik voor de toevoegingsreactie van het mical-type een pipetpunt met een brede opening om het juiste volume crosslinker-oplossing aan de polymeercel toe te voegen. Meng. Stel de pipet in op het gewenste individuele gelvolume.

Pipetteer de oplossing meerdere keren op en neer om te homogeniseren en breng deze aan in de mallen van de spuitpunt. Voer deze stap snel uit om een gelijkmatige verdeling van de cellen te waarborgen en laat het gedurende 10 tot 30 minuten incuberen in de kweekkap voor cross-linking. Voor de lichtgeïnitieerde vrije radicaal cross-linking.

verdeel het juiste volume over de spuitpuntmallen. Stel de spuiten bloot aan UV-licht voor radicale cross-linking met een blootstelling van 10 minuten bij 365 nanometer. Voor ACRL-gefunctionaliseerde polymeren is UV-licht van vier milliwatt per vierkante centimeter gebruikelijk.

Voer deze stap snel uit om het bezinken van cellen vóór de blootstelling aan UV-licht te minimaliseren. Dompel de gels na crosslinking in de putjes van een kweekplaat met medium voor incubatie en analyse. Crosslinking van de hydrogel kan ook sequentieel worden uitgevoerd.

Voeg eerst de gefunctionaliseerde kleurstof gemethyleerde rumine toe tot een uiteindelijke concentratie van 20 nanomolar in de gel. De kleurstof helpt bij het visualiseren van het patroon, aangezien deze bij voorkeur wordt ingebouwd in radicaal gecrosslinkte regio's van de gel. Start vervolgens met de polymerisatiereactie van het mic-type, waarbij een fractie van de theoretische crosslinks wordt gevormd voor het volgende.

Voor cross-linking via vrije radicalen moet een masker worden ontworpen in een programma zoals Adobe Photoshop of Illustrator en direct op transparantiemaskers worden geprint. De afmetingen van het masker moeten overeenkomen met de ronde bovenkant van de spuit. Gebruik gesteriliseerde pincetten om een steriel masker direct op het geloppervlak aan te brengen en stel dit bloot aan licht om de gel te cross-linken.

Hierna worden HMC's getoond in HA-gebaseerde hydrogels één uur na encapsulatie. Omdat gesynthetiseerde hydrogels doorgaans transparant zijn, kunnen de cellen met behulp van lichtmicroscopie worden gevisualiseerd om de morfologie te bepalen. Dezelfde cellen werden 24 uur na encapsulatie gevisualiseerd om de levensvatbaarheid te bepalen met een fluorescent live/dead-kleuringskit.

We gebruikten calcium M om levende cellen te detecteren en atherium homodimeer voor dode cellen, waarbij een levensvatbaarheid van meer dan 95% werd waargenomen. We gebruikten daarnaast de alamar blue-assay om het niveau van celproliferatie te bepalen, gemeten aan de hand van de mate waarin de cellen het assay-reagens metaboliseren, wat resulteert in een kleurverandering. De celkleuring werd uitgevoerd op H HMC's zeven dagen na inkapseling in een afbreekbare en adhesieve hydrogel op basis van HA, waarbij standaard fixatie- en permeabilisatieprocedures werden toegepast.

Cellulaire actine is zichtbaar met fluoresceïne-gelabelde phalloidine en kernen zijn gemarkeerd met DAPI. Immunokleuring tegen culline wordt gebruikt voor de visualisatie van focale adhesies binnen de hydrogelmatrix. Histologische kleuring wordt uitgevoerd na dehydratatie, paraffine-inbedding en doorsnijden van de hydrogels volgens standaardprotocollen voor radicaal gepolymeriseerde HMSC-ingekapselde HA-hydrogels.

Na één week in cultuur werden deze gekleurd met hematoxyline om de kernen te markeren en ASIN om het bindweefsel te markeren, en met blauwe kleurstoffen voor glycosaminoglycanen. Realtime PCR wordt gebruikt om de differentiatie van ingekapselde stamcellen te kwantificeren. Na aftrek van de achtergrond wordt het expressieniveau van een gen van belang bepaald aan de hand van het cyclusaantal waarbij de drempelfluorescentie werd bereikt, vergeleken met een passief referentiesignaal, wat een constitutief actief housekeeping-gen is. We hebben u zojuist laten zien hoe u cellen kunt inkapselen in 3D-hydrogelen en het gedrag van cellen in gelen kunt bestuderen.

Bij het gebruik van deze procedures is het belangrijk om volledige steriliteit van materialen te waarborgen, door steriele buffersoluties en reagentia op lange termijn te bewaren of door te steriliseren met de kiemdodende UV-lamp. Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.