Cellulaire Encapsulation in 3D Hydrogelen voor Tissue Engineering
October 26th, 2009
We presenteren protocollen voor de 3-dimensionale (3D) het inkapselen van de cellen binnen synthetische hydrogels. De inkapseling procedure is beschreven voor de twee meest gebruikte methodes van verknoping (michael-type naast en licht geïnitieerde vrije radicalen mechanismen), evenals een aantal technieken voor het beoordelen van ingekapselde cel gedrag.
Het stapsgewijze proces voor het inkapselen van cellen begint met de voorbereiding en sterilisatie van hydrogelvormen en andere materialen, gevolgd door het isoleren van cellen in individuele populaties, in buisjes voor elke gelset. Actie wordt vervolgens uitgevoerd in aanwezigheid van cellen, gevolgd door de incubatieperiode in vitro of in vivo. Downstream-analyse voor celgedrag kan tests voor levensvatbaarheid, morfologie, proliferatie en differentiatie omvatten.
Hallo Amidio Kahan van het laboratorium van Dr. Jason Burdick in de afdeling Bioengineering aan de Universiteit van Pennsylvania. Vandaag laten we je een procedure zien voor cellulaire inkapsling in 3D-hydrogels voor weefselengineering. We gebruiken deze procedure om de effecten van hydrogelsamenstelling en -structuur op het gedrag van ingekapselde cellen te bestuderen.
Dus laten we beginnen. Om deze procedure te starten, bereid je een 0,5%gewichtsoplossing van de foto-initiator air cure 2 9 5 9 of I 2 9 5 9 in PBS. Meng en incubeer gedurende twee tot drie dagen in het donker bij 37 graden Celsius.
Wanneer je klaar bent, gebruik je een spuitfilter om de oplossing te steriliseren en bewaar deze bij kamertemperatuur. Gebruik vervolgens een spreadsheetprogramma zoals Microsoft Excel om de hoeveelheid polymeer en crosslinker te berekenen die nodig is. Hier is hyaluronzuur gefunctionaliseerd met acrylaatreactieve groepen.
Bereken ook de hoeveelheid penantpeptide dat het functionele kleefdomein bevat met aminozuur cystine, arginine, glycine en aspartaat. De cystine is voor het vastzetten aan het polymeer. Nu de vereiste hoeveelheden polymeercrosslinker en pent zijn bepaald, weeg ze af en plaats ze elk in een einorbuis.
Pas de berekeningsspreadsheet dienovereenkomstig aan. Voor de werkelijke massa polymeer die is verkregen, ga je verder met het voorbereiden van gelvormen. Gebruik een scheermes om de punten af te snijden van individueel verpakte steriele.
Een milliliter wegwerpspuiten. Zorg voor een vlakke snede voor mallen die worden gebruikt voor fotopatroon op gels. Steriliseer ten slotte de spuitvormen EOR buizen met hun doppen open en alle andere benodigde materialen door ze gedurende 30 minuten onder een germicide lichtbron te plaatsen die is ingebouwd in de biologische veiligheidskast.
Zodra de sterilisatie is voltooid, ga je verder met het voorbereiden van de cellen na sterilisatie van de experimentele apparatuur. Werk in de kap en voeg steriele TEA toe aan het polymeer dat wordt gebruikt in de mical type cross-linking en steriele PBS aan het polymeer dat wordt gebruikt voor de vrije radicaal cross-linking. Voeg matchende buffer toe aan de hangende moeilijkheidsgraad buizen en vortex.
Om de hangende moeilijkheidsgraad te laten oplossen, bindt deze zich via een thiol van een INE-groep op het peptide aan het alkylaat hyaluronzuur om de hangende moeilijkheidsgraad aan het polymeer te bevestigen, voeg je deze toe aan de polymeeroplossing en verzegel je met param. Vortex kort en incubeer bij 37 graden Celsius met mengen. Terwijl je de cellen voorbereidt, terwijl de hangende moeilijkheidsgraad zich hecht, bereid je de cellen voor die moeten worden ingekapseld tryis, humane mesenchymale stamcellen of HMC's door ze te wassen met PBS.
Behandel vervolgens met trypsine gedurende één minuut bij kamertemperatuur, verwijder de trypsine en incubeer vijf minuten langer bij 37 graden. Voeg vervolgens HMSC-groeimedia toe om de trypsine te neutraliseren en de cellen van het oppervlak van de plaat los te maken. Tel de cellen met een hemo cytometer.
Schei de getelde cellen in porties met het juiste aantal voor elke set gels. Voor een set van drie 50 microliter gels met een dichtheid van 10 miljoen cellen per milliliter, scheid je 1,5 miljoen cellen in een afzonderlijk conisch buisje. Bereid niet meer dan vier gels in een afzonderlijke set vanwege de timing van actie.
Centrifugeer vervolgens de cellen gedurende zes minuten bij 500 RCF. Terwijl de cellen bij kamertemperatuur ronddraaien, bereid je de polymerisatiemix voor de mical edition cross-linking. Voeg buffer toe aan de crosslinker om de juiste concentratie te bereiken.
Voor de lichtgeïnitieerde vrije radicaal cross-linking, voeg je de eerder bereide I 2 9 5 9 oplossing toe aan de polymeeroplossing. Bij 10% van het totale gelsetvolume voor een uiteindelijke initiatorconcentratie van 0,05%gewicht. Nu zijn de cellen en de polymerisatiemix klaar voor inkapsling in de hydrogel.
Begin met het afzuiging van de snat uit de gecentrifugeerde cellen. Wacht tot het vocht is bezonken na de eerste afzuiging en zuig opnieuw af om zoveel mogelijk media te verwijderen zonder de celpellet te verstoren Resus. Suspendeer de celpellet met de polymeeroplossing om luchtbellen te voorkomen.
Pipet de oplossing langzaam ongeveer 10 keer op en neer, wat voldoende zou moeten zijn om de cellen gelijkmatig te verdelen. Gebruik voor de mical type additiereactie een breed orifice pipettentip om het juiste volume crosslinkeroplossing aan de polymeercel toe te voegen. Mix. Stel de pipet in op het gewenste individuele gelvolume.
Pipet de oplossing op en neer om te homogeniseren en Eloqua in de spuittipvormen. Voer de stap snel uit om een gelijkmatige verdeling van cellen te garanderen en laat 10 tot 30 minuten incuberen in de kweekkap voor cross-linking. Voor de lichtgeïnitieerde vrije radicaal cross-linking.
Deel het juiste volume in spuittipvormen. Stel de spuiten bloot aan UV-licht voor radicaal cross-linking, een blootstelling van 10 minuten aan 365 nanometer. Vier milliwatt per vierkante centimeter UV-licht is gebruikelijk voor ACRL-gefunctionaliseerde polymeren.
Voer de stap snel uit om celbezinking vóór blootstelling aan UV-licht te minimaliseren. Na cross-linking dompel je de gels in de putjes van een weefselkweekplaat met media voor incubatie en analyse. Cross-linking van de hydrogel kan ook sequentieel worden uitgevoerd.
Voeg eerst de functionele kleurstof gemethyleerde rumine toe aan een uiteindelijke concentratie van 20 nanomolair in de gel. De kleurstof helpt bij het visualiseren van het patroon omdat deze
Overzicht
Dit artikel presenteert protocollen voor de 3D-incapsulatie van cellen binnen synthetische hydrogels, met details over methoden voor crosslinking en het beoordelen van celgedrag.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Bio-engineeren
- Weefseltechniek
Achtergrond
- 3D celincapsulatie is cruciaal voor weefseltechniek toepassingen.
- Hydrogels bieden een ondersteunende omgeving voor celgroei en differentiatie.
- Verschillende crosslinking methoden kunnen het celgedrag beïnvloeden.
- Het begrijpen van deze methoden kan weefseltechniek strategieën verbeteren.
Doel van het onderzoek
- Procedures voor het incapsularen van cellen in hydrogels beschrijven.
- Verschillende crosslinking technieken vergelijken.
- Het gedrag van ingekapselde cellen onder verschillende omstandigheden beoordelen.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding en sterilisatie van hydrogel mallen.
- Isolatie en voorbereiding van celpopulaties.
- Crosslinking met behulp van michael-type toevoeging en licht-geïnitieerde vrije radicale mechanismen.
- Downstream analyse van celviabiliteit, morfologie, proliferatie en differentiatie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle incapsulatie van cellen in hydrogels werd bereikt.
- Verschillende crosslinking methoden beïnvloedden het celgedrag.
- Viabiliteit en morfologie van ingekapselde cellen werden beoordeeld.
- Hydrogel samenstelling en structuur bleken effecten op de resultaten te hebben.
Conclusies
- De gevestigde protocollen kunnen voor verschillende weefseltechniek toepassingen worden gebruikt.
- Het begrijpen van crosslinking effecten is vitaal voor het optimaliseren van celgedrag.
- Toekomstige studies kunnen op deze bevindingen voortbouwen om weefseltechniek technieken te verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
3D hydrogel encapsulation enables physiologically relevant cell culture models that improve predictive confidence in early-stage target validation and mechanistic de-risking. By mimicking native tissue microenvironments, this approach supports more translatable assessments of stem cell behavior, differentiation, and response to bioactive cues. It addresses a key discovery-stage challenge: reducing biological ambiguity when evaluating therapeutic candidates in preclinical workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in a tissue-like 3D context that better reflects in vivo conditions.
- Operational Value: Supports functional target validation by allowing observation of cellular phenotype, viability, and differentiation under controlled matrix properties.
- Predictive Value: Improves confidence in lead identification by linking hydrogel composition to stem cell behavior and lineage specification.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized, reproducible platform for preparing validated biological systems suitable for downstream compound screening.
- Operational Value: Enables quantitative readouts such as proliferation (via Alamar Blue), viability (live/dead staining), and morphology, supporting assay reproducibility.
- Platform Utility: Compatible with multiple crosslinking mechanisms (Michael-type addition, free radical) and polymer types (e.g., hyaluronic acid, PEG), allowing assay adaptation across target classes.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains biological relevance from discovery through preclinical validation by preserving stem cell multipotency and differentiation capacity in degradable, adhesive hydrogels.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables evaluation of cellular behavior over time (e.g., one-week culture) to inform go/no-go decisions based on matrix-mediated effects on proliferation and lineage commitment.
- Biomarker Alignment: Supports translational biomarker development through immunostaining of focal adhesions (e.g., vinculin) and histological analysis of glycosaminoglycan deposition.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, particularly for modalities requiring assessment of cell-matrix interactions and differentiation potential.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling controlled study of how hydrogel structure influences stem cell fate and mechanotransduction.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible 3D cultures with quantifiable outputs for viability, proliferation, and morphological analysis.
- Analytics: Generates measurable readouts including gene expression (via qPCR), protein localization (immunostaining), and metabolic activity, facilitating comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical work through degradation-adaptive hydrogels and extracellular matrix-like cues that model tissue remodeling.
- Enterprise Reuse: Represents a scalable, modular capability applicable across multiple projects in regenerative medicine, disease modeling, and mechanistic screening.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in stem cell responses to biomaterial cues.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through defined sterilization, crosslinking, and cell encapsulation steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality by providing earlier, more physiologically relevant functional data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on their performance in tissue-mimetic environments.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sterile technique, hydrogel chemistry, and stem cell culture.
- Depends on access to UV light sources for photoinitiated crosslinking and standard tissue culture equipment.
- Necessitates cross-team standardization of hydrogel formulation and cell preparation protocols.
- Involves adaptation considerations when transferring across different stem cell types or polymer backbones.
- Includes practical limitations such as gel settling timing constraints and the need for rapid processing to ensure uniform crosslinking.
