Monitoring Heart Functie in larvale Drosophila melanogaster Voor Fysiologische Studies
16 november 2009
We presenten verschillende manieren om de hartfunctie in de larve van Drosophila te monitoren voor het beantwoorden van vragen over de functie van gap junctions, ionkanaalmutaties, modulatie van pacemakeractiviteit en farmacologische studies.
Drosophila zijn genetisch gezien zeer geschikt voor onderzoek naar de ontwikkeling en functie van het hart en de onderliggende pacemakeractiviteit. Deze procedure laat zien hoe men preparaten maakt van zowel intacte als gedisseceerde larven en hoe de hartslag kan worden gemonitord. Het gedisseceerde preparaat maakt daarnaast registraties van extracellulaire of intracellulaire potentialen mogelijk om de functie van ionkanalen verder te bestuderen.
Hallo, ik ben Robin Cooper, docent bij de afdeling biologie aan de University of Kentucky. Vandaag zullen mijn studenten, Ann Cooper, Kyla Ryman, Matt Ward en Easter Boku, u verschillende procedures laten zien om de hartslag bij Drosophila-larven te monitoren. De volgende methode zonder fixatie wordt 'mierenfarm' genoemd, omdat de larven binnen één brandvlak worden gevisualiseerd.
Voor de beste visualisatie van de larven dient een dissectiemicroscoop te worden gebruikt met een 2x basisobjectief en een 0,5x tube-objectief voor de beste ruimtelijke resolutie en vergroting over een rechthoek van 1 centimeter bij 0,5 centimeter. Foto's en video's kunnen worden opgenomen met een camera op een oculairhouder. Begin deze methode door een larve met een dunne laag voedsel tussen twee objectglazen te plaatsen.
De objectglazen worden op een afstand van 1 tot 1,5 millimeter van elkaar gehouden met plastic afstandhouders aan alle vier de zijden. Kantel het preparaat gedurende enkele minuten tussen de 20 en 45 graden om ervoor te zorgen dat de larve haar kop naar beneden houdt. Stel de microscoopspiegel in voor het beste contrast van het hart of de twee tracheae om de hartslag waar te nemen.
De lijmmethode is een permanente montage voor het fixeren van larven op een glazen objectglas. Om met de lijmmethode te beginnen, plaatst u een schoon dekglas bovenop een objectglas. Breng een kleine druppel secondelijm aan op een hoek van het dekglas.
Spoel de larven vervolgens af met water. Om overtollig voedsel te verwijderen, wordt de vloeistof opgezogen met een tissue of de hoek van een papieren handdoek. Zodra de larve grondig is afgespoeld, wordt deze voorzichtig met een schone pincet opgepakt en op het preparaat geplaatst, uit het zicht van het dekglas onder de microscoop, waarbij de larve op de buik wordt georiënteerd.
De maag vertoont vage horizontale groeven met fijne zwarte haartjes. De rugzijde van de larven moet naar boven zijn gericht en vertoont twee racestrepen, wat de trachea zijn. Gebruik een tweede set pincetten die uitsluitend is bestemd voor het hanteren van de lijm, neem een klein beetje van de druppel aan het uiteinde van het dekglas en breng dit aan op de hoek aan de tegenovergestelde zijde.
Gebruik een kleine hoeveelheid, net genoeg om de kop van de pincet te bedekken. Pak het dier op en plaats het op de lijm, waarbij u ervoor zorgt dat het met de buikzijde naar beneden in de zwarte opening blijft.
De haken moeten zich op of nabij de rand van het dekglas bevinden, evenals de mondhaken en de bruine spiraal. Ze mogen de lijm niet raken. Druk de larve voorzichtig plat.
Om een teststof toe te dienen, is het raadzaam om met een spuit kleine druppels nabij de kop van de larve aan te brengen. Observeer de hartslag door het aantal keren te tellen dat de spiralen per minuut pulseren. Voor langere observaties kunnen de larven ter plaatse gevoed en bevochtigd worden om uitdroging te voorkomen; om een dissectieplaat te maken die onder de microscoop bruikbaar is, gebruikt u een scalpel om een gat van twee centimeter diameter in het midden van een stuk magneettape te snijden en plakt u dit op een objectglas.
Gebruik dissectiespelden die zijn omgebogen en aan paperclips zijn gelijmd voor een gemakkelijker vastzetten. Plaats tijdens de dissectie een intact third-instar larve op de dissectieplaat. Met de dorsale zijde naar boven moet de trachea door de cuticula zichtbaar zijn.
Plaats twee spelden in de larven aan weerszijden van de mondhaken en nog eens twee spelden aan weerszijden van de spiralen. Voeg vervolgens zoutoplossing toe om de larven vochtig te houden. Maak daarna een horizontale incisie bij het achterste uiteinde, gevolgd door een longitudinale snede die langs de spiralen richting de kop van het dier moet lopen.
Til één dorsale speld op en haak deze onder de cuticula. Gebruik de speld om het weefsel te spreiden. Open de lichaamsholte.
Herhaal dit met de overige drie spelden. Zodra het dier is vastgepind, verwijdert u de ingewanden, waarbij u er zorg voor draagt dat de trachea of het hart niet beschadigd raken. Sommige structuren, waaronder de hersenen en enkele vetlichamen, zijn verbonden met het hart en zullen dit beschadigen wanneer ze worden verwijderd.
Laat het preparaat na de dissectie drie tot vijf minuten rusten in een HL drie zoutoplossing; intracellulaire en veldregistraties worden in dit preparaat uitgevoerd terwijl farmacologische middelen direct op het hart worden aangebracht. De totale tijd voor deze dissectiestap bedraagt drie tot zes minuten. Om elektrische pacing uit te voeren, moeten eerst focale elektroden worden gemaakt: laat een glaselektrode over een verhittelement lopen om deze vlamte polijsten en maak een geleidelijke buiging van ongeveer 45 graden, monteer vervolgens een focale elektrode gevuld met HL drie zoutoplossing op kamertemperatuur in de manipulator met de punt naar beneden gericht.
Zorg ervoor dat de stimulatiedraad de zoutoplossing in de elektrode raakt en dat de stimulator is uitgeschakeld. Bevestig een verse dissectie van een hart op de microscoop. Plaats de aardingsdraad in de zoutoplossing.
Zorg ervoor dat de pinnen niet worden aangeraakt en de preparatie niet wordt verstoord. Houd de elektrode in beeld terwijl u de manipulator gebruikt om deze naar beneden in de zoutoplossing te bewegen. Positioneer, zodra de elektrode zich in de zoutoplossing bevindt, de tip van de elektrode zodanig dat het lumen plat tegen het hart ligt en dit lichtjes raakt.
Zodra de elektrode is geplaatst, stelt u de frequentie van de stimulator in op twee hertz met de spanning op de laagste stand. Zet de stimulator aan. Stem de frequentie af op ongeveer drie hertz en verhoog langzaam de spanning totdat de hartslag versnelt om overeen te komen met het ritme van de stimulator.
Het ritme kan nu via de stimulator worden gemanipuleerd. Er kunnen verbindingen worden toegevoegd om te bepalen of deze invloed hebben op de contractie of de elektrische geleiding. Voor het uitvoeren van veldpotentiaalmetingen vult u een macro-patch-registratie-elektrode met badmedium en monteert u deze in een manipulator op een samengestelde microscoop.
Sluit de elektrode aan op een versterker en een registratiesysteem. Gebruik de manipulator om het lumen van de elektrode boven het hart van een dissectiepreparaat te laten zakken dat aan de microscoop is bevestigd. Raak het hart zeer lichtjes aan met de elektrodetip.
Veldregistraties kunnen nu worden uitgevoerd om veldpotentialen uit een ander gebied van het hart vast te leggen. Til de punt van de elektrode voorzichtig op en verplaats deze met de manipulator naar een nieuw gebied, en voer vervolgens opnieuw de veldpotentiaalregistraties uit. Hiermee is nauwkeurige monitoring van de frequentie en duur van de elektrische signalen in het hart mogelijk om de transmembraanpotentialen van myocyten in larven te meten.
Zorg er eerst voor dat het lumen van een scherpe elektrode, gevuld met drie molair kaliumchloride, plat tegen het hart rust onder een hoek van ongeveer 45 graden ten opzichte van de verticale as. Zodra de elektrode correct is gepositioneerd, raakt u het hart voorzichtig aan met de elektrodepunt en tikt u de punt in een cel. De elektrode kan opnieuw worden gebruikt als deze niet is gebroken.
Intracellulaire opnames maken het mogelijk om de ionische basis van het actiepotentiaal en de kenmerkende vormen van de potentialen te meten, om zo de effecten van ionkanaalmutaties of kanaalmodulatoren te onderzoeken. We hebben u zojuist laten zien hoe u hartopnames uitvoert en hoe u intracellulaire potentialen en veldpotentialen meet. U kunt deze technieken gebruiken om hartafwijkingen, farmacologische manipulaties en genalteraties te bestuderen.
Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om niet aan een aan het hart verbonden structuur te trekken of te hard met de focale elektrode te drukken. Let bij de lijmmethode daarnaast op dat de mond of de sfeer niet wordt dichtgeplakt. Dat is alles.
Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.
Overzicht
Dit artikel presenteert methoden voor het monitoren van de hartfunctie bij Drosophila-larven, met een focus op de beoordeling van gap junctions, ionkanaalmutaties en pacemakeractiviteit. De technieken omvatten zowel intacte als gedisseceerde preparaten voor gedetailleerde analyse.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Fysiologie
- Genetica
Achtergrond
- Drosophila zijn waardevol voor het bestuderen van de hartontwikkeling en -functie.
- Inzicht in de pacemakeractiviteit is essentieel voor het begrijpen van de cardiale fysiologie.
- De functie van ionkanalen kan worden beoordeeld via diverse experimentele opstellingen.
- Farmacologische studies kunnen de effecten van verschillende verbindingen op de hartfunctie onthullen.
Doel van de studie
- Om technieken aan te tonen voor het monitoren van de hartslag in Drosophila-larven.
- Om de effecten van farmacologische middelen op de hartfunctie te onderzoeken.
- Om een gedetailleerde methodologie te bieden voor zowel intacte als gedissecteerde preparaten.
Gebruikte methoden
- Methode voor onbelemmerde visualisatie met behulp van een dissectiescoop.
- Lijmmethode voor permanente montage van larven op objectglazen.
- Dissectietechnieken voor toegang tot het hart en de trachea.
- Elektrische pacing en veldpotentiaalmetingen om de hartactiviteit te beoordelen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle monitoring van de hartslag in verschillende larvale preparaten.
- Aangetoonde effecten van farmacologische agentia op hartcontracties.
- Biedt een duidelijk protocol voor dissectie en elektrodeplaatsing.
- Toont de haalbaarheid aan van het gebruik van Drosophila voor cardiale studies.
Conclusies
- Drosophila-larven zijn effectieve modellen voor het bestuderen van de hartfunctie.
- De beschreven methoden kunnen worden aangepast aan uiteenlopende experimentele behoeften.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op deze technieken om de cardiale fysiologie verder te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Modellen van het hart van Drosophila-larven maken mechanische risicoreductie van ionkanaal- en pacemakerfuncties mogelijk in de vroege ontdekkingsfase, wat de validatie van targets voor hartgerelateerde pathways ondersteunt. De preparatie biedt kwantitatieve, reproduceerbare read-outs van de hartslag en elektrische activiteit, wat de ontwikkeling van assays voor compound-screening vergemakkelijkt. Dit systeem biedt een genetisch hanteerbaar, ziekterelevant model om het potentieel van translationele biomarkers en het voorspellend vertrouwen bij de identificatie van lead-compounds te beoordelen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen met betrekking tot ionkanaalfunctie en pacemakeractiviteit te onderzoeken in een genetisch toegankelijk systeem.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door directe toepassing van farmacologische middelen op het blootgelegde hart mogelijk te maken.
- Voorspellende waarde: Levert kwantitatieve metingen van de hartslag en membraanpotentialen om target-engagement en padmodulatie te beoordelen.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gestandaardiseerde, kwantificeerbare resultaten (hartslag, veldpotentialen, intracellulaire registraties) voor een betrouwbare evaluatie van verbindingen.
- Operationele waarde: Maakt reproduceerbaarheid van assays mogelijk via gedisseceerde preparaten die een gecontroleerde blootstelling aan verbindingen en omgevingsbeheersing mogelijk maken.
- Schaalbaarheid: Gedisseceerde hartpreparaten kunnen worden gebruikt voor adaptaties in multi-well formaten om medium-throughput screening te ondersteunen.
Translationeel en preklinisch onderzoek
- Translationele relevantie: De preparatie van het larvale hart dient als een ziekterelvant systeem om ionische dysfuncties te modelleren die geassocieerd zijn met specifieke genen die gelinkt zijn aan hartziekten bij zoogdieren.
- Mechanistische risicoreductie: Maakt het mogelijk om de ionische basis van actiepotentialen en de effecten van ionkanaalmutaties of modulatoren te onderzoeken, waardoor mechanistische ambiguïteit wordt verminderd.
- Predictieve continuïteit: Ondersteunt de afstemming van translationele biomarkers door larvale elektrofysiologie te koppelen aan bekende ionische mechanismen in hogere organismen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot leadidentificatie en biedt mechanistische inzichten die bijdragen aan de preklinische risicobeoordeling.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypotheseonderzoek naar de bijdragen van ionkanalen en pacemakers aan de hartfunctie via directe elektrofysiologische readouts.
- Screening: Levert kwantitatieve, reproduceerbare metingen van de hartslag en het potentiaal, waardoor vergelijkingen tussen verschillende verbindingen of genetische condities mogelijk zijn.
- Analytics: Genereert elektrofysiologische gegevens (hartslag, membraanpotentialen, veldpotentialen) waarmee teams de effecten van verbindingen op de elektrische geleiding en contractiliteit kunnen beoordelen.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan bij preklinisch werk door het modelleren van ionische stromingen die ten grondslag liggen aan actiepotentialen, relevant voor de cardiale pathofysiologie bij zoogdieren.
- Bedrijfsbrede hergebruik: Creëert een herbruikbaar platform voor cardiale fenotypering over meerdere projecten heen die betrekking hebben op ionkanaaldoelwitten of genetische ziektemodellen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen bij targetvalidatie door genetische of farmacologische perturbaties te koppelen aan functionele cardiale read-outs.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, schaalbare preparaten die de variabiliteit verminderen en de consistentie tussen teams ondersteunen.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroegtijdige mechanistische gegevens te verschaffen over cardiale risico's gerelateerd aan ionkanalen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van verbindingen mogelijk op basis van cardiale veiligheids- en target-engagementprofielen.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in het hanteren van Drosophila, dissectie en elektrofysiologische registratietechnieken.
- Afhankelijk van microscopie, elektrodemanipulatie en stimulatiehardware voor intracellulaire en veldpotentiaalregistraties.
- Maakt standaardisatie van de dissectietijd, de samenstelling van de zoutoplossing en de elektrodeplaatsing tussen gebruikers en laboratoria noodzakelijk.
- Overwegingen bij aanpassing omvatten soortspecifieke hartanatomie en ionische samenstelling bij uitbreiding naar andere insecten- of ongewervelde modellen.
- Praktische beperkingen omvatten de stabiliteit van de preparatie over tijd en mogelijke weefselschade tijdens dissectie, wat de kwaliteit van de registratie kan beïnvloeden.
