Monitoring Heart Functie in larvale Drosophila melanogaster Voor Fysiologische Studies
16 november 2009
We presenten verschillende manieren om de hartfunctie in de larve van Drosophila te monitoren voor het beantwoorden van vragen over de functie van gap junctions, ionkanaalmutaties, modulatie van pacemakeractiviteit en farmacologische studies.
Drosophila zijn genetisch gezien zeer geschikt voor onderzoek naar de ontwikkeling en functie van het hart en de onderliggende pacemakeractiviteit. Deze procedure laat zien hoe preparaten van zowel intacte als gedisseceerde larven worden gemaakt en hoe de hartslag wordt gemonitord. Het gedisseceerde preparaat maakt daarnaast registraties van extracellulaire of intracellulaire potentialen mogelijk om de functie van ionkanalen verder te bestuderen.
Hoi, ik ben Robin Cooper, docent bij de afdeling Biologie aan de University of Kentucky. Vandaag zullen mijn studenten, Ann Cooper, Kyla Ryman, Matt Ward en Easter Boku, u verschillende procedures laten zien om de hartslag in Drosophila-larven te monitoren. De volgende methode zonder fixatie wordt de 'mierenboerderij' genoemd omdat de larven binnen één brandvlak worden gevisualiseerd.
Voor de beste visualisatie van de larven dient een dissectiemicroscoop te worden gebruikt met een 2x basisobjectief en een 0,5x buisobjectief voor de beste ruimtelijke resolutie en vergroting over een rechthoek van 1 centimeter bij 0,5 centimeter. Foto's en video's kunnen worden opgenomen via een camera op een oculairhouder. Om met deze methode te beginnen, plaatst u een larve met een dunne laag voedsel ertussen tussen twee objectglazen.
De objectglazen worden op een afstand van 1 tot 1,5 millimeter gehouden met plastic spacers aan alle vier de zijden. Kantel het preparaat gedurende enkele minuten tussen 20 en 45 graden om de larve aan te moedigen de kop naar beneden gericht te houden. Stel de microscoopspiegel in voor het beste contrast van het hart of de twee tracheae om de hartslag te observeren.
De lijmmethode is een permanente montage om larven op een glazen objectglas vast te zetten. Om te beginnen met de lijmmethode, plaats men een schoon dekglas bovenop een glazen objectglas. Breng een kleine druppel secondelijm aan op een hoek van het dekglas.
Spoel de larven vervolgens af met water. Om overtollig voedsel te verwijderen, absorbeert u de vloeistof met een tissue of de hoek van een papieren handdoek. Zodra de larve grondig is afgespoeld, pakt u deze voorzichtig op met schone pincetten en plaatst u deze op het objectglas, uit de buurt van het dekglas, onder de microscoop; oriënteer de larve op zijn buik.
De maag vertoont vage horizontale groeven met fijne zwarte haren. De rugzijde van de larven moet naar boven gericht zijn en vertoont twee strepen, wat de trachea zijn. Gebruik een tweede set pincetten die uitsluitend is bestemd voor het hanteren van de lijm, neem een kleine hoeveelheid van de druppel aan het uiteinde van het objectglas en breng dit aan op de hoek aan de tegenovergestelde zijde.
Gebruik een minimale hoeveelheid, net genoeg om de punt van de pincet te bedekken. Pak het dier op en plaats het op de lijm, terwijl u ervoor zorgt dat het met de buikzijde naar beneden op de zwarte opening blijft.
De haken moeten zich op of nabij de rand van het dekglas bevinden, samen met de mondhaken en de bruine spiraal. Ze mogen de lijm niet raken. Druk de larve voorzichtig plat.
Om een testsubstantie toe te dienen, is het raadzaam om met een spuit kleine druppels nabij de kop van de larve te dispenseren. Observeer de hartslag door het aantal keren te tellen dat de spiralen per minuut pulseren. Voor langere observaties kunnen larven ter plaatse gevoed en bevochtigd worden om uitdroging te voorkomen; om een dissectieplaat te maken die onder de microscoop bruikbaar is, gebruikt u een scalpel om een gat van twee centimeter diameter in het midden van een stuk magneettape te snijden en plakt u dit op een objectglas.
Gebruik dissectiepinnen die zijn gebogen en op paperclips zijn gelijmd om het vastzetten te vergemakkelijken. Plaats tijdens de dissectie een intacte larve in het derde stadium op de dissectieplaat. Met de dorsale zijde naar boven moet de trachea door de cuticula zichtbaar zijn.
Plaats twee spelden in de larven aan weerszijden van de mondhaken en nog twee spelden aan weerszijden van de spiralen. Voeg vervolgens zoutoplossing toe om de larven vochtig te houden. Maak daarna een horizontale incisie bij het coddle-uiteinde, gevolgd door een longitudinale snede die langs de spiralen richting de kop van het dier moet lopen.
Til één dorsale speld op en haak deze onder de cuticula. Gebruik de speld om het weefsel te spreiden. Open de lichaamsholte.
Herhaal dit bij de andere drie spelden. Zodra het dier is vastgezet, worden de ingewanden verwijderd, waarbij u er zorg voor draagt de trachea of het hart niet te beschadigen. Sommige structuren, waaronder de hersenen en enkele vetlichamen, zijn aan het hart bevestigd en kunnen het beschadigen wanneer ze worden verwijderd.
Laat het preparaat drie tot vijf minuten rusten in een HL drie zoutoplossing na de dissectie; intracellulaire en veldregistraties worden in dit preparaat uitgevoerd terwijl farmacologische middelen direct op het hart worden aangebracht. De totale tijd voor deze dissectiestap is drie tot zes minuten. Om elektrische pacing uit te voeren, moeten eerst focale elektroden worden gemaakt; om een focale elektrode te maken, wordt een glaselektrode over een heating element gehaald voor vlampolijsting en om een geleidelijke buiging van ongeveer 45 graden te maken. Monteer een focale elektrode, gevuld met HL drie zoutoplossing op kamertemperatuur, in de manipulator met de punt naar beneden gericht.
Zorg ervoor dat de stimulatiedraad de zoutoplossing in de elektrode raakt en dat de stimulator is uitgeschakeld. Bevestig een verse hartdissectiepreparaat op de microscoop. Plaats de aarddraad in de zoutoplossing.
Zorg ervoor dat u de pinnen niet aanraakt en de preparatie niet verstoort. Houd de focus op de elektrode terwijl u de manipulator gebruikt om deze naar beneden in de zoutoplossing te bewegen. Positioneer, zodra deze zich in de zoutoplossing bevindt, de tip van de elektrode met het lumen plat tegen het hart, zodat deze het hart licht aanraakt.
Zodra de elektrode is geplaatst, stelt u de frequentie van de stimulator in op twee hertz met het voltage op de laagste stand. Zet de stimulator aan. Stem de frequentie af op ongeveer drie hertz en verhoog langzaam het voltage totdat de hartslag versnelt om overeen te komen met het ritme van de stimulator.
Het ritme kan nu via de stimulator worden gemanipuleerd. Er kunnen verbindingen worden toegevoegd om te zien of deze de contractie of elektrische geleiding beïnvloeden. Om veldpontentiaalmetingen uit te voeren, vult u een macro-patch-registratie-elektrode met badmedium en plaatst u deze in een manipulator op een compound-microscoop.
Sluit de elektrode aan op een versterker en een registratiesysteem. Gebruik de manipulator om het lumen van de elektrode boven het hart van een dissectiepreparaat te laten zakken dat aan de microscoop is bevestigd. Raak het hart zeer lichtjes aan met de tip van de elektrode.
Veldregistraties kunnen nu worden uitgevoerd om veldpotentialen uit een ander gebied van het hart vast te leggen. Til de punt van de elektrode voorzichtig op en verplaats deze met de manipulator naar een nieuw gebied, en voer vervolgens opnieuw de veldpotentiaalregistraties uit. Maak nauwkeurige monitoring van de frequentie en duur van de elektrische signalen in het hart mogelijk om de transmembraanpotentialen van larvale myocyten te meten.
Zorg er eerst voor dat het lumen van een scherpe elektrode, gevuld met drie molair kaliumchloride, plat tegen het hart ligt onder een hoek van ongeveer 45 graden ten opzichte van de verticale as. Wanneer de elektrode correct is gepositioneerd, raakt u het hart voorzichtig aan met de elektrodepunt en tikt u de punt in een cel. De elektrode kan opnieuw worden gebruikt mits deze niet is gebroken.
Intracellulaire registraties maken het mogelijk om de ionische basis van het actiepotentiaal en de karakteristieke vormen van de potentialen te meten om de effecten van ionkanaalmutaties of kanaalmodulatoren te onderzoeken. We hebben u zojuist laten zien hoe u hartregistraties uitvoert, alsook hoe u intracellulaire potentialen en veldpotentialen meet. U kunt deze technieken gebruiken om hartafwijkingen, farmacologische manipulaties en genetische veranderingen te bestuderen.
Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om niet aan een gerelateerde structuur te trekken die aan het hart is bevestigd en om niet te hard te drukken met de focale elektrode. Let bij de lijmmethode er daarnaast op dat de mond of de bol niet wordt dichtgeplakt. Dat is alles.
Bedankt voor het kijken en veel succes met de experimenten.
Overzicht
Dit artikel presenteert methoden voor het monitoren van de hartfunctie bij Drosophila-larven, met een focus op de beoordeling van gap junctions, ionkanaalmutaties en pacemakeractiviteit. De technieken omvatten zowel intacte als gedisseceerde preparaten voor gedetailleerde analyse.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Fysiologie
- Genetica
Achtergrond
- Drosophila zijn waardevol voor het bestuderen van de hartontwikkeling en -functie.
- Inzicht in de pacemakeractiviteit is essentieel voor het begrijpen van de cardiale fysiologie.
- De functie van ionkanalen kan worden beoordeeld via diverse experimentele opstellingen.
- Farmacologische studies kunnen de effecten van verschillende verbindingen op de hartfunctie onthullen.
Doel van de studie
- Om technieken aan te tonen voor het monitoren van de hartslag in Drosophila-larven.
- Om de effecten van farmacologische middelen op de hartfunctie te onderzoeken.
- Om een gedetailleerde methodologie te bieden voor zowel intacte als gedissecteerde preparaten.
Gebruikte methoden
- Methode voor onbelemmerde visualisatie met behulp van een dissectiescoop.
- Lijmmethode voor permanente montage van larven op objectglazen.
- Dissectietechnieken voor toegang tot het hart en de trachea.
- Elektrische pacing en veldpotentiaalmetingen om de hartactiviteit te beoordelen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle monitoring van de hartslag in verschillende larvale preparaten.
- Aangetoonde effecten van farmacologische agentia op hartcontracties.
- Biedt een duidelijk protocol voor dissectie en elektrodeplaatsing.
- Toont de haalbaarheid aan van het gebruik van Drosophila voor cardiale studies.
Conclusies
- Drosophila-larven zijn effectieve modellen voor het bestuderen van de hartfunctie.
- De beschreven methoden kunnen worden aangepast aan uiteenlopende experimentele behoeften.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op deze technieken om de cardiale fysiologie verder te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Modellen van het hart van Drosophila-larven maken mechanische risicoreductie van ionkanaal- en pacemakerfuncties mogelijk in de vroege ontdekkingsfase, wat de validatie van targets voor hartgerelateerde pathways ondersteunt. De preparatie biedt kwantitatieve, reproduceerbare read-outs van de hartslag en elektrische activiteit, wat de ontwikkeling van assays voor compound-screening vergemakkelijkt. Dit systeem biedt een genetisch hanteerbaar, ziekterelevant model om het potentieel van translationele biomarkers en het voorspellend vertrouwen bij de identificatie van lead-compounds te beoordelen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen met betrekking tot ionkanaalfunctie en pacemakeractiviteit te onderzoeken in een genetisch toegankelijk systeem.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door directe toepassing van farmacologische middelen op het blootgelegde hart mogelijk te maken.
- Voorspellende waarde: Levert kwantitatieve metingen van de hartslag en membraanpotentialen om target-engagement en padmodulatie te beoordelen.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gestandaardiseerde, kwantificeerbare resultaten (hartslag, veldpotentialen, intracellulaire registraties) voor een betrouwbare evaluatie van verbindingen.
- Operationele waarde: Maakt reproduceerbaarheid van assays mogelijk via gedisseceerde preparaten die een gecontroleerde blootstelling aan verbindingen en omgevingsbeheersing mogelijk maken.
- Schaalbaarheid: Gedisseceerde hartpreparaten kunnen worden gebruikt voor adaptaties in multi-well formaten om medium-throughput screening te ondersteunen.
Translationeel en preklinisch onderzoek
- Translationele relevantie: De preparatie van het larvale hart dient als een ziekterelvant systeem om ionische dysfuncties te modelleren die geassocieerd zijn met specifieke genen die gelinkt zijn aan hartziekten bij zoogdieren.
- Mechanistische risicoreductie: Maakt het mogelijk om de ionische basis van actiepotentialen en de effecten van ionkanaalmutaties of modulatoren te onderzoeken, waardoor mechanistische ambiguïteit wordt verminderd.
- Predictieve continuïteit: Ondersteunt de afstemming van translationele biomarkers door larvale elektrofysiologie te koppelen aan bekende ionische mechanismen in hogere organismen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot leadidentificatie en biedt mechanistische inzichten die bijdragen aan de preklinische risicobeoordeling.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypotheseonderzoek naar de bijdragen van ionkanalen en pacemakers aan de hartfunctie via directe elektrofysiologische readouts.
- Screening: Levert kwantitatieve, reproduceerbare metingen van de hartslag en het potentiaal, waardoor vergelijkingen tussen verschillende verbindingen of genetische condities mogelijk zijn.
- Analytics: Genereert elektrofysiologische gegevens (hartslag, membraanpotentialen, veldpotentialen) waarmee teams de effecten van verbindingen op de elektrische geleiding en contractiliteit kunnen beoordelen.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan bij preklinisch werk door het modelleren van ionische stromingen die ten grondslag liggen aan actiepotentialen, relevant voor de cardiale pathofysiologie bij zoogdieren.
- Bedrijfsbrede hergebruik: Creëert een herbruikbaar platform voor cardiale fenotypering over meerdere projecten heen die betrekking hebben op ionkanaaldoelwitten of genetische ziektemodellen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen bij targetvalidatie door genetische of farmacologische perturbaties te koppelen aan functionele cardiale read-outs.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, schaalbare preparaten die de variabiliteit verminderen en de consistentie tussen teams ondersteunen.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroegtijdige mechanistische gegevens te verschaffen over cardiale risico's gerelateerd aan ionkanalen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van verbindingen mogelijk op basis van cardiale veiligheids- en target-engagementprofielen.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in het hanteren van Drosophila, dissectie en elektrofysiologische registratietechnieken.
- Afhankelijk van microscopie, elektrodemanipulatie en stimulatiehardware voor intracellulaire en veldpotentiaalregistraties.
- Maakt standaardisatie van de dissectietijd, de samenstelling van de zoutoplossing en de elektrodeplaatsing tussen gebruikers en laboratoria noodzakelijk.
- Overwegingen bij aanpassing omvatten soortspecifieke hartanatomie en ionische samenstelling bij uitbreiding naar andere insecten- of ongewervelde modellen.
- Praktische beperkingen omvatten de stabiliteit van de preparatie over tijd en mogelijke weefselschade tijdens dissectie, wat de kwaliteit van de registratie kan beïnvloeden.
