Microvolume Eiwitconcentratie Bepaling met behulp van de NanoDrop 2000C Spectrophotometer
4 november 2009
Microvolume monsters worden gekwantificeerd door een spectrofotometer systeem dat natuurlijke oppervlaktespanning gebruikt om monsters te behouden zonder het gebruik van cuvetten of haarvaten. Het dynamisch bereik van eiwitconcentraties en de snelheid waarmee ze kunnen worden gemeten zijn sterk verhoogd met deze methode.
NanoDrop-technologie combineert glasvezel en oppervlaktespanning om kleine hoeveelheden monsters zoals nucleïnezuren en eiwitten vast te houden en te meten. Een kleine druppel monster wordt direct op het onderste voetstuk gepipetteerd. Een bovenste optisch voetstuk brengt vervolgens het monster in contact om een kolom te vormen.
Het voetstuk beweegt automatisch om de optimale padlengte aan te passen. Door de padlengte te verkorten, is het niet nodig om verdunningen uit te voeren voor de meeste eiwitmonsters, metingen gebeuren in seconden en de resultaten van het visspectrum worden weergegeven. Hallo, ik ben Lynn Kalhorn in de NanoDrop Laboratories van Thermo Fisher Scientific.
Vandaag zullen we een procedure laten zien voor het bepalen van de eiwitconcentratie met behulp van een innovatieve microvolumespectrofotometer. De NanoDrop 2000 C.De NanoDrop 2000 C spectrofotometer gebruikt een innovatief monsterhoudsysteem dat vertrouwt op de oppervlaktespanning van vloeistoffen om microvolumemonsters tussen twee optische voetstukken vast te houden en te meten zonder het gebruik van cuvettes of capillairen. Het micros-monster wordt direct op de detectieoppervlakte geplaatst en een vloeistofkolom wordt gecreëerd tussen de uiteinden van de optische vezels door oppervlaktespanning.
Deze vloeistofkolom vormt een verticale optische baan. Een xenon-flitslamp zorgt voor de lichtbron en een spectrometer met een lineair CCD-array wordt gebruikt om het licht dat door het monster passeert te analyseren. Het verwijderen van traditionele beveiligingsapparaten zoals cuvettes uit het systeem heeft verschillende voordelen.
Er zijn zeer kleine hoeveelheden monster nodig voor meting. Eén tot twee microliters schoonmaken vereist eenvoudigweg het afvegen van de optische oppervlakken met een laboratoriumdoek en de padlengte verandert automatisch in realtime tijdens de meting. Bovendien maakt het verkorten van de padlengte de meting van hogere concentraties mogelijk, wat effectief het vermogen om verdunningen uit te voeren voor de meeste eiwitmonsters verwijdert.
In gevallen waarin een vet noodzakelijk is, zoals kinetiekstudies, biedt de NanoDrop 2000 C een vetoptie in dezelfde spectrofotometer. Voor dit protocol zullen we de microvolumevoetstokoptie gebruiken om de eiwitconcentratie te bepalen. De eiwit A twee 80-methode is toepasbaar op gezuiverde eiwitten die tryptofaan tyrosine en fenylalanineresiduen of cysteïne cysteïne diss sulfaatbindingen bevatten en absorbentie vertonen bij 280 nanometer.
Om deze procedure te beginnen, selecteert u de eiwit A twee 80-toepassing vanuit het hoofdmenu. Als het golflengte-verificatievenster verschijnt, zorg er dan voor dat de arm omlaag is, selecteer het type monster dat moet worden gemeten in de vervolgkeuzelijst. De standaardinstelling wordt aanbevolen voor de meeste onbekende eiwitmengsels waarin één ABSORBENCIE gelijk is aan één milligram per milliliter.
Bij het meten van een eerder gekarakteriseerd gezuiverd eiwit, kan de massa-extincticiecoëfficiënt of de molaire extinctiecoëfficiënt worden ingevoerd. Om de eiwitconcentratie nauwkeuriger te bepalen, kiest u de concentratie-eenheden uit de vervolgkeuzelijst naast het kleurcoderingsvak. Leg vervolgens een blanco op.
Met behulp van een geschikte buffer is het belangrijk om de buffer te gebruiken waarin het eiwit is gesuspendeerd. De gebruikte buffer moet dezelfde pH en een vergelijkbare ionensterkte hebben als de monsteroplossing. Vanwege de variabiliteit in oppervlaktespanning tussen verschillende eiwitten, raden we aan om twee microliters monsters te laden om een goede kolomvorming te garanderen.
Om te laden raakt de lagretentiepipettip de bodem van het voetstuk terwijl de oplossing wordt uitgedreven om te voorkomen dat de oplossing aan de buitenkant van de pipettip hecht, stuur minder dan de volledige hoeveelheid monster uit om blowout en introductie van luchtbellen in het monster te voorkomen. Zodra het monster is geladen, laat de arm zakken, klik op blanco. Wanneer het blanco is voltooid, veegt u de blanco oplossing van de onderste en bovenste voetstukken.
Met behulp van een droge laboratoriumdoek voordat u een aliquot neemt voor meting, is het belangrijk om ervoor te zorgen dat het monster homogeen is. Meng het monster voorzichtig maar grondig door voorzichtig te vortexen met een middelhoog RPM om microbubbels in de vloeistof te voorkomen. Voer een monster-ID in het juiste veld in.
Laad twee microliters van het eerste monster zoals eerder voor het blanco getoond, laat de arm zakken en klik op meten Wanneer de meting voltooid is, veegt u het monster van de onderste en bovenste voetstukken. Gebruik een droge laboratoriumdoek, meet alle andere monsters op dezelfde manier met een vers twee microliter aliquot monster voor elke meting. Een gewone pluisvrije laboratoriumdoek is vaak voldoende om de optische voetstukken tussen metingen schoon te maken.
De enige oplosmiddel die onverenigbaar is en niet mag worden gebruikt, zijn hydrofluorwaterstofzuuroplossingen en reagentia die oppervlakteactieve stoffen bevatten, kunnen de meetvoetstukoppervlakken onvoorwaardelijk maken in de loop van de tijd, waardoor de vorming van de monstervloeistofkolom wordt voorkomen. Een afvlakking van de druppel op het onderste voetstuk is een indicatie dat het optische oppervlak onvoorwaardelijk is geworden om opnieuw te conditioneren. De voetstukoppervlakken buff ze krachtig met behulp van een laboratoriumdoek of de voorkeursmethode is om het NanoDrop-voetstukreconditioneringsmiddel PR een zoals aangegeven te gebruiken.
Als het monster een ongekarakteriseerd eiwitmengsel, cellysaat of ruw eiwitextract is, raden we aan om een van de vooraf geconfigureerde colormetrische methoden te gebruiken die beschikbaar zijn op de NanoDrop 2000 C.Deze colormetrische methoden omvatten BCAP zes 60 Bradford en Lowy-assays. De BCA-test wordt hier gedemonstreerd. De vereiste reagentia voor de BCA-test zijn aanwezig in het thermos wetenschappelijke pierce reducerende middel compatibele kit BCA, reagens A, B, C, A, reagens B en bovine serumalbumine-standaarden.
We zullen pierce's voorverdunde albumineset als onze standaarden gebruiken, raadpleeg de pierce BCA-literatuur om te bepalen welke teststandaarden geschikt zijn voor uw omstandigheden.
Overzicht
De NanoDrop 2000 C spectrofotometer maakt gebruik van innovatieve technologie om microvolume monsters van eiwitten en nucleïnezuren te meten zonder traditionele cuvetten. Deze methode verbetert de meetnelheid en het dynamische bereik, waardoor een efficiënte bepaling van de eiwitconcentratie mogelijk is.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Biochemie
- Analytische Chemie
- Eiwitanalyse
Achtergrond
- De NanoDrop-technologie maakt gebruik van glasvezels en oppervlaktespanning voor monsterretentie.
- Het maakt directe meting van kleine monstervolumes (1-2 µL) mogelijk.
- Het elimineren van cuvetten vermindert de monstervereisten en opruimtijd.
- Het systeem kan hoge concentraties meten zonder verdunning.
Doel van de studie
- Om de procedure voor het bepalen van eiwitconcentratie met behulp van de NanoDrop 2000 C te demonstreren.
- Om de voordelen van microvolume spectrofotometrie te benadrukken.
- Om richtlijnen te geven voor het effectief gebruik van het apparaat.
Gebruikte methoden
- Monsters pipetteren direct op de optische voet.
- Gebruik van een blanco voor kalibratie met een geschikte buffer.
- Meting van absorbantie bij 280 nm voor eiwitconcentratie.
- Gebruik van colorimetrische assays zoals BCA voor niet-gekarakteriseerde eiwitten.
Belangrijkste resultaten
- De NanoDrop 2000 C biedt snelle en nauwkeurige eiwitconcentratiemetingen.
- Oppervlaktespanning houdt microvolume monsters effectief vast voor analyse.
- Real-time padlengte-aanpassing verbetert de meetnauwkeurigheid.
- Minimale monsteropruiming is vereist tussen metingen.
Conclusies
- De NanoDrop 2000 C is een waardevol hulpmiddel voor eiwitanalyse in onderzoeksomgevingen.
- Het ontwerp vereenvoudigt het meetproces en vermindert monstersverspilling.
- Colorimetrische methoden breiden de toepasbaarheid uit naar verschillende eiwitmonsters.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Microvolume protein quantification addresses the challenge of limited sample availability in early-stage discovery, enabling precise target validation with minimal material. The NanoDrop 2000c enhances predictive confidence by delivering rapid, reproducible concentration data without dilution, supporting go/no-go decisions in lead identification. Its real-time path length adjustment and broad dynamic range improve assay standardization across discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of purified protein samples using A280 absorbance for rapid assessment of expression and purity.
- Operational Value: Reduces sample consumption to 1-2 µL, preserving precious material for downstream assays.
- Predictive Value: Supports functional target validation by providing accurate concentration inputs for activity and binding studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates preparation of standardized protein inputs for biochemical and cell-based assays via precise quantification.
- Operational Value: Eliminates cuvette use and dilution steps, accelerating assay setup and improving reproducibility.
- Scalability: Enables high-throughput readiness through rapid measurement and simple wipe-clean protocol between samples.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports biomarker alignment by enabling quantification of protein standards and samples in BCA-based assays.
- Preclinical Model Relevance: Ensures accurate dosing in functional studies by providing reliable concentration data for lysates and extracts.
- Risk-Adjusted Advancement: Reduces mechanistic ambiguity in target engagement studies through precise protein normalization.
Pipeline & Workflow Integration
The NanoDrop 2000c fits within the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical evaluation, supporting consistent protein quantification across stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling accurate normalization of protein samples in pathway and interaction studies.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible protein inputs for enzyme, binding, and functional screens.
- Analytics: Provides quantitative A280 and colorimetric readouts that allow comparison across conditions and samples.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical work via reliable quantification in BCA assays for standard curves and sample analysis.
- Enterprise Reuse: Functions as a shared, reusable platform for protein quantification across multiple projects and teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing variability in protein input quantification.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through automated path length adjustment and minimal sample handling.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by minimizing sample waste and accelerating measurement timelines.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization through reliable concentration data for go/no-go decisions in lead optimization.
Implementation Considerations
- Requires basic laboratory training in pipetting and sample handling for microvolume techniques.
- Depends on access to a NanoDrop 2000c spectrophotometer and compatible laboratory wipes for surface maintenance.
- Necessitates cross-team standardization on blanking procedures and buffer matching for accurate results.
- Involves adaptation considerations for viscous or surfactant-containing samples that may affect surface tension-dependent column formation.
- Includes practical limitations such as incompatibility with hydrofluoric acid and surfactant-rich reagents that can degrade optical surfaces over time.
