Afleiding van hematopoietische stamcellen van muriene embryonale stamcellen

Als eerste nemen we een concurrente T 25-fles met umsl. Ik ga deze wassen met PBS en voeg vervolgens een paar druppels TR toe. Laat dit een paar minuten inwerken. Ik kan zien dat de cellen loslaten van de plaat, dus het is vrijwel klaar.

Oké, nu ga ik de met trypsine behandelde oogcellen verzamelen. Het is raadzaam om de met trypsine behandelde oogcellen heel kort te tritureren om de celkolonies op te breken voordat ze op de UN-plaat worden geplaatst. Deze plaat blijft vervolgens ongeveer 30 tot 45 minuten in de incubator staan. Nu ga ik deze cellen centrifugeren om ze te verzamelen en zal ik het supernatant aspireren.

Ik ga over een paar minuten resuspenderen zodat ik dit kan tellen. Dus ik resuspendeer en nu ik geteld heb, neem ik een aliquot. Ik ga deze aliquot aanvullen tot 50 ml; dat geeft me de juiste concentratie om honderd cellen per druppel te krijgen, om er zeker van te zijn dat de cellen in orde zijn. Nu hebben we een reservoir.

Schud deze nog een keer kort door en giet ze vervolgens in ons reservoir. Oké, dit is al geprogrammeerd. Zo, dat is gelukt.

Nu is het vrij recht. Draai het om en leg het gewoon opzij. Om de paar platen kantel ik het een beetje, zodat het een beetje heen en weer beweegt.

Oké, dat zijn vijf platen. Ik ga deze nu in de incubator plaatsen. Dit zijn de hangende druppels die we twee dagen geleden hebben geplaatst.

Om te verzamelen schudt u de platen om de druppels op te vangen. Ik ga nu alles verzamelen en ik probeer dit voorzichtig te doen om de EV's niet te veel te verstoren; ik neem vijf of zes ml PBS om de platen te wassen. Daarna laten we deze minstens 10 minuten staan, zodat de EV's door zwaartekracht bezinken.

Zodra u visueel heeft bevestigd dat uw EBS zijn bezonken, verwijdert u het grootste deel van het bovenzicht, maar niet alles, omdat u het proces niet wilt verstoren. Oké. Oké, daarna worden ze geschud tot dag zes. Dit zijn embryoïden die zes dagen geleden zijn voorbereid vanuit mysische embryonale stamcellen; meestal verzamelen we ze door de platen een beetje te draaien.

Wanneer u de platen draait, trekken de cellen naar het midden van de schaal en is het iets gemakkelijker om ze te centreren. Laat de cellen nu door zwaartekracht bezinken naar de bodem van de buis; vervolgens verwijdert u het medium en wast u één keer met 10 ml, 10 tot 12 ml PBS. Oké, we laten deze nu een minuutje wachten.

Nu verwijder ik de P. We voegen 250 µL van onze enzymmix toe, gevolgd door 1 mL, en plaatsen ze vervolgens in een waterbad van 37 °C. Af en toe, misschien een paar keer, kom ik langs om ze kort te tikken om ze te mengen, omdat de EDTA is neergeslagen. We hebben nu deze cel-dissociatiebuffer zonder enzymen die we rechtstreeks van Gibco beziehen.

We voegen ongeveer 8 ml hiervan toe aan elke buis. Vervolgens gebruiken we een pipet van 5 ml om te homogeniseren; terwijl u dit doet om de cellen te dissociëren, zal het mengsel erg troebel worden. Dit is een visuele aanwijzing dat de cellen in het medium worden verspreid. Nu ga ik de cellen tellen via uitsluiting met trypaanblauw. Als u een infectie uitvoert of een MOI berekent, is het zeer belangrijk om de cellen te tellen.

Ik ga nu een grote batch voorbereiden van virus plus medium plus cellen in de juiste concentratie plus proteïnesulfaat. En vervolgens zorg ik dat de cellen — en opnieuw ben ik paranoïde over de cellen buiten de suspensie — ik ben dus altijd voorzichtig en gebruik een kleine hoeveelheid; ik probeer te voorkomen dat er te veel spatten en we centrifugeren op 2.500 rpm.

Ik verzamel nu onze cellen van dag 10; ik bewaar alle wasstappen. Voorheen gebruikte ik PI voor propidiumjodide, maar 7Za is niet zo helder. Hierdoor is er minder overlap tussen de kanalen, wat resulteert in een schoner signaal.

We halen nu de variabele op; dit is een goede manier om volumeverlies in de naald te voorkomen. Ik ben Shannon McKinney Freeman, postdoctoral fellow bij George Families Life Attorney in het Children's Hospital Boston.

Vandaag gaan we bespreken hoe we een transplanteerbare populatie cellen kunnen afleiden uit embryonale stamcellen van muizen, specifiek voor het hematopoëtische systeem. Waarom voeren we dit experiment uit? We weten dat we met dit systeem een populatie cellen uit embryonale stamcellen kunnen afleiden; het oorspronkelijke protocol werd ontwikkeld om cellen te verkrijgen met hematopoëtische stamcelactiviteit, in die zin dat ze in staat waren om muizen te redden na dodelijke bestraling door hun hematopoëtische systeem gedurende een lange periode — de gehele levensduur van het organisme — en in alle lijnen van het perifere bloed te reconstitueren.

Daarom is dit protocol ontwikkeld. We voeren nu verdere experimenten uit om het fenotype te begrijpen van de populatie cellen binnen deze uitgebreide populatie die we verkrijgen en die daadwerkelijk deze hematopoëtische stamcelactiviteit bemiddelen. Omdat we dit nog niet weten; we weten dat de populatie zeer heterogeen is en we weten dat de cel die de muizen daadwerkelijk redt, uiterst zeldzaam is binnen deze celpopulatie.

En we proberen dus in wezen het fenotype te definiëren, zodat we het kunnen zuiveren uit deze zeer heterogene cellen. Vervolgens zijn we vooral geïnteresseerd in het begrijpen hoe het functioneel vergelijkt met een bonafide hematopoëtische stamcel die men uit volledig beenmerg zou kunnen afleiden. Heeft het dezelfde reconstitutiecapaciteit op ontwikkelingsniveau en lijkt het een volwassen beenmerg-HSC te reflecteren?

Of misschien lijkt het meer op een hematopoëtische stamcel. Men zou deze kunnen vinden in de vroege ontwikkeling, bijvoorbeeld in de GM of de foetale lever. Dit is uiteindelijk wat we proberen te begrijpen en we willen deze vragen beantwoorden omdat we uiteindelijk willen dat dit protocol als basis dient voor soortgelijk werk dat we willen uitvoeren met menselijke embryonale stamcellen.

En we hebben het gevoel dat de informatie die we met het wiskundige systeem verkrijgen, weet u maar, van groot nut zal zijn voor die toekomstige experimenten. Ik denk dat er een paar zaken zijn. Ten eerste is het simpelweg een goed in vitro-model, het is een goed in vitro-model voor ontwikkeling.

Ten eerste proberen we de ontwikkeling van hematopoëtische stamcellen te begrijpen. Het is een uitstekend systeem dat zeer minimaal is voor ectopische genexpressie om te onderzoeken hoe deze factoren de ontwikkeling van hematopoëtische stamcellen beïnvloeden. Dat is vanuit een fundamenteel wetenschappelijk perspectief zeer nuttig.

Maar uiteindelijk willen we een vorm van celgebaseerde therapie ontwikkelen die klinisch kan worden ingezet voor het verkrijgen van, u weet, transplanteerbare metabole stamcellen uit menselijke cellen. Maar dat ligt waarschijnlijk nog ver in de toekomst. Eigenlijk hebben we ontdekt dat het moeilijkste deel niet zozeer de afleiding van de cellen zelf is, maar we stelden door zorgvuldige experimenten vast dat er een periode was waarin we problemen hadden om de cellen in onze recipienten te laten reconstitueren.

En wat we uiteindelijk ontdekten was dat we zeer nauwkeurig moesten letten op de ablatie van de ontvangers, omdat deze cellen niet in staat zijn daartoe. Normaal gesproken, wanneer u een transplantatie bij muizen uitvoert met beenmerg-afgeleide cellen, gebruikt u 10 of 11 Gy straling om de muizen te bestralen, en de hematopoëtische stamcellen in het beenmerg zijn prima in staat om de dieren daarvan te redden. Het blijkt echter dat deze populatie cellen die wij expanderen niet in staat is om dieren te redden na een dergelijke hoge dosis ioniserende straling.

Wat we moesten doen, was de bestralingsdosis zeer zorgvuldig afstemmen, waarbij we rekening hielden met de grootte van de dieren. We ontdekten namelijk dat wanneer de dieren te groot waren en we probeerden dezelfde dosis te gebruiken, ze niet effectief genoeg werden geablateerd. Maar als u de dieren onvoldoende bestraalt, zijn de cellen niet in staat om te concurreren met resistentere gastheren.

Toen we eenmaal hadden vastgesteld dat dit een belangrijke variabele was die het voor ons bemoeilijkte om de ab-activiteit van deze cellen te observeren, en we de bestralingsdosis hadden getitreerd en beseften dat de leeftijd en het gewicht van het dier zeer significant zijn, begonnen onze experimenten zeer reproduceerbaar te verlopen. Wat we hebben ontdekt is dat wanneer u dieren gebruikt van ongeveer 20 gram, 15 tot 20 gram, en deze ablateert met 9,25 gray, dit de perfecte dosis lijkt te zijn die deze cellen het voordeel geeft dat ze nodig hebben om de muizen te reconstitueren. Ja, en ik denk dat dit een van de belangrijkste variabelen was.

Het andere, andere, andere belangrijke punt is het aantal cellen dat u injecteert. We hebben ook titraties uitgevoerd onder deze specifieke condities voor het bestralen van ons modelorganisme. We hebben daarnaast de titratie bepaald voor het aantal van deze ongefractioneerde, heterogene poolcellen die we in muizen injecteerden.

En we hebben in essentie vastgesteld dat er een minimale dosis nodig is, ongeveer 2 miljoen tot 5 miljoen cellen, om de dieren te redden. Als er minder dan dat wordt geïnjecteerd, worden de dieren niet gered. En ik denk dat dit duidt op de, waarschijnlijk de zeldzaamheid, weet je, van de cel, die daadwerkelijk de redding bemiddelt binnen dit heterogene compartiment.

Ik denk dus dat de belangrijkste variabelen het aantal geïnjecteerde cellen zijn en het zeker weten dat welk transplantatiemodel u ook gebruikt, u de cellen voldoende heeft behandeld om hen het voordeel te geven dat ze nodig hebben om zich te herstellen, maar niet zoveel dat ze simpelweg niet in staat zijn tot herstel. Dit zijn de belangrijkste variabelen geweest.