Name: Afleiding van hematopoietische stamcellen van muriene embryonale stamcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-02-25T00:00:00.000+00:00
Duration: 22 min 6 s
Description: Leer hoe je hematopoëtische stamcellen afleidt van muizenembryonale stamcellen via embryoid bodies en retrovirale HoxB4-infectie. Dit protocol maakt transplantatie en reconstitutie van het hematopoëtische systeem mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Differentiatie van embryonale stamcellen <ol><li> Verzamel een bijna samenvloeiing fles van embryonale stamcellen (ESC) via een behandeling met trypsine ESC. </li><li> Resuspendeer cellen in 5 ml Differentiatie media en over te dragen aan een niet-gelatine gecoate T25. Incubeer bij 37 ° C gedurende 45 minuten. Ophalen supernatant en het verzamelen van cellen via centrifugeren. Let op: muis embryonale fibroblasten (MEF) van het ESC culturen hechten gemakkelijk aan de niet-gelatine gecoate T25 en dus zijn uitgeput van de cultuur tijdens deze plating stap. Als je niet kweken uw ESC op MEFs, gaat u naar de pre-plaat. </li><li> Resuspendeer MEF-uitgeput ESC in Differentiatie media op 333.333 cells/50 mL. Deze concentratie resulteert in een 100 ml ESC/15. </li><li> Gebruik van multi-channel pipet, plaat ESC op 100 cells/15 mL druppel op 15 cm 2 petri platen. Met een 8-kanaals pipet, moet u in staat om te passen over 18 tot 22 rijen van druppels per plaat (ongeveer 5 ml per plaat). Let op: Voor dit protocol, 2-5 15 cm 2 schotels van druppels is meer dan voldoende moet opleveren 2-5 x 10 6 dagen zes EB-afgeleide cellen. </li><li> Voorzichtig flip platen aan druppels keren. Incubeer bij 37 ° C 5% CO 2 voor 48 uur. </li><li> Pool valt onder voorzichtig schudden platen en over te dragen aan 15 ml conische buis. Spoel borden met 4-6 ml PBS en toe te voegen aan dezelfde 15 ml conische. Opmerking: U kan zich ophopen tot vijf opknoping laten vallen platen. De EBS zal groeien als ze blijven om te differentiëren en als ze te geconcentreerd ze de neiging om grote pollen te vormen. </li><li> Laat gebundeld EBS om zich te vestigen door de zwaartekracht (ongeveer 10 minuten). Aspireren bovenstaande vloeistof zonder storende EBS. Zachtjes hersuspenderen in 10 ml Differentiatie media en transfer naar 10 cm niet-klevende petri plaat. </li><li> Plaats petri plaat op plaat shaker bij 50 rpm en incubeer bij 37 ° C 5% CO 2. </li><li> 24 uur later (dag vier van differentiatie), te wervelen platen concentreren EBS in het centrum van de petrischaal. Zorgvuldig uitwisseling 50% van de media (5 ml) met 5 ml verse Differentiatie Media. Keer terug plaat aan incubator voor twee dagen. </li></ol> EB dissociatie en infectie met MSCV-HoxB4-IRES-GFP <ol><li> Op dag zes van differentiatie, transfer EBS tot 15 ml conische buis. Laat bezinken door de zwaartekracht. </li><li> Aspireren media en resuspendeer in 10 ml PBS. Laat EBS te vestigen door de zwaartekracht. Aspireren PBS. </li><li> Voeg 250 ml dissociatie enzym mix en 1 ml PBS. Incubeer in 37 ° C waterbad gedurende 20 minuten, soms wervelende metro naar enzymen en EBS mix. </li><li> Voeg 8 mL enzym vrij van dissociatie buffer. </li><li> Vermaal mengsel met 5 ml pipet tot de EBS zijn volledig gedissocieerd (ongeveer 10 keer; overmatige pipetteren de dood zal toenemen binnen de EB-afgeleide cellen voorbereiding). <ol><li> Mengsel zal troebel met cellen als EBS dissociëren. </li><li> Het plaatsen van pipetpunt tegen onderkant van conische buis tijdens tritureren zal leiden tot een dwarskracht die sterk zal vergemakkelijken dissociatie. </li></ol></li><li> Verzamel cellen via centrifugeren. </li><li> Resuspendeer EB-afgeleide cellen in 5 ml 10% IMDM en tellen met behulp van trypan blauw uitsluiting Let op: Tussen dag vier en zes dagen van differentiatie, EBS caviteren wat resulteert in een grote hoeveelheid van apoptose en cel death.Thus, op dag zes, ruim 30% van de EB-afgeleide cellen kan kleuren met trypan blauw. </li><li> Resuspendeer EB-afgeleide cellen bij 100.000 cellen / 2 ml van 10% IMDM + virale supernatant zodanig dat een MOI van 5-10 is achieved.Add protaminesulfaat tot een uiteindelijke concentratie van 8 mg / ml. Let op: Bereid genoeg EB / virale supernatant mix tot op het bord vier 6-well platen (uitgaande van 2 ml / putje). </li><li> Plaat 2 ml EB / virale supernatant mix per putje van vier 6 well platen vooraf bedekt met een OP9 stroma cellen (zie hieronder). </li><li> Centrifugeer platen bij 2500 rpm bij kamertemperatuur gedurende 90 minuten. Overdracht platen om incubator bij 37 ° C 5% CO 2. </li><li> 4-6 uur later, oogst supernatans van platen en het verzamelen van alle mogelijke cellen die overblijven in suspensie via centrifugeren. </li><li> Resuspendeer pellet (mag dan klein zijn) in 48 ml 10% IMDM + cytokines. Doseer 2 ml / putje van resuspentie naar de oorspronkelijke vier 6-well platen waarin de infectie was uitgevoerd en supernatant werd verzameld. Let op: altijd voor te bereiden 10% IMDM + cytokines fris op het moment van gebruik. </li><li> Incubeer de platen bij 37 ° C 5% CO 2 gedurende zeven dagen. Kolonies moet duidelijk zijn per dag vier na de besmetting en de grote en goed gevormd door zeven dagen. Een robuuste expansie moet opleveren 40-60 kolonies / goed op dag zeven. </li><li> Op dag zeven na infectie, verzamelen en zwembad alle cellen (inclusief OP9 stroma) van alle putjes door behandeling met trypsine. Let op: NIET supernatant of PBS wast in dienst was tijdens trypsine treatment.At dit punt in de cultuur te verwijderen, kunnen sommige kolonies slechts losjes hechtend en er zijn veel cellen dobber voor deTing in suspension.Collect en het zwembad al wast en supernatant om ervoor te zorgen dat er geen potentieel waardevolle cellen worden verwijderd. </li><li> Resuspendeer cellen in 8 ml vers 10% IMDM + cytokines. Verdeel 2 ml / fles in vier T75 flessen. Voeg een extra 13 ml 10% IMDM + cytokines aan elke kolf. Incubeer bij 37 ° C 5% CO 2 voor drie dagen (een totaal van tien dagen na besmetting). </li></ol> Cultuur en plating van OP9 stroma <ol><li> Onderhouden OP9 stroma volgens standaard protocollen in 20% a-MEM. OP9 cellen zullen de eigenschappen wanneer uitgegroeid tot confluentie. Altijd splitsen bij 80% confluentie op niet meer dan 1:3 splitsen. </li><li> 24 uur voorafgaand aan de infectie van dag zes EB-afgeleide cellen met MSCV-HoxB4-IRES-GFP, plaat 25.000 OP9 cellen / putje van vier 6-well platen in 20% a-MEM. </li></ol> Verzamelen, fractionering en transplantatie <ol><li> Verzamel cellen uitgebreid op OP9 stroma tien dagen via een behandeling met trypsine. Tellen cellen. Let op: Gooi supernatans of PBS wast in dienst tijdens de trypsine behandeling. Op dit punt in de cultuur, kunnen sommige kolonies slechts losjes hechtend en er zijn veel cellen drijven in suspension.Collect en het zwembad al wast en supernatant om ervoor te zorgen dat er geen potentieel waardevolle cellen worden verwijderd. Opmerking: Een goede uitbreiding moet opleveren tussen 40-50 x 10 6 cellen / originele software heeft 6-wells plaat, voor een totaal van 160 tot 200 x 10 6 cellen. </li><li> Cellen kunnen worden gefractioneerd via magnetische kraal selectie of FACS volgens standaard technieken die op dit punt in het protocol. </li><li> Voor transplantatie, leveren cellen via retro-orbitale of staartader injectie om Rag-2/gc gebrekkige ontvangers (met een gewicht tussen 15-22 gram) onderworpen aan een splitsing dosis van 9,25 Gy bestraling van 2,5 uur. uit elkaar. Opmerking: Het is essentieel dat het gewicht van de dieren vallen tussen 15 tot 22 gram op het moment van bestraling. Als ze groter zijn dan 22 gram, zal 9,25 Gy niet een voldoende dosis van de bestraling naar de juiste ablatie te waarborgen en cellen niet bemiddelen redden van dodelijke bestraling en / of inenten van de hematopoietische compartiment. Als verplanten grotere dieren, moet de juiste stralingsdosis experimenteel worden bepaald. </li><li> Een minimale dosis van 2-5 x 10 6 cellen / dier is nodig om te redden garantie van dodelijke straling. Als het fractioneren cellen, injecteren 2-5 x 10 6 cell-equivalenten (bijvoorbeeld als de bevolking van belang 10% van de niet-gefractioneerde pool van cellen vertegenwoordigt, injecteren 2-5 x 10 5 cellen / dier). Opmerking: Als het injecteren van&gt; 2 x 10 6 cellen, Volg bij het ​​injecteren via staartader te teratoom vorming in een baan, die kan ontstaan ​​wanneer grote aantallen cellen zijn retro-orbitaal geleverd te vermijden. </li><li> Onderhouden Rag-2 - / - / gc - / - deficiënt ontvangers in geautoclaveerd kooien. Afhankelijk van de &#39;netheid&#39; van de Dierenverblijf, post-transplantatie dieren kan de toediening van aangezuurd water of Trimethiprim-Sulfasoxazole (Septra) nodig heeft voor de 5 weken na de dodelijke straling. </li><li> Verwachten dat&gt; 90% GFP + ES-afgeleide leukocyten in het perifere bloed 3 weken na de transplantatie. Aanslaan moet multi-lijn, hoewel lymfocyten is bekend dat retrovirale HoxB4-IRES-GFP stilte. </li></ol>

<table><tbody><tr><td>C57Bl/6 Rag-2/gamma-c deficiënte muizen</td><td>Dier</td><td>Taconic Farm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plateschudder</td><td>Instrument</td><td>VWR international</td><td>33998-360</td><td>Orbital Shaker van Ikaworks</td></tr><tr><td>Multikanalspipette</td><td>Instrument</td><td>VWR international</td><td>15000-174</td><td>ePet van BioHit</td></tr><tr><td>ES trypsine</td><td>Reagens</td><td>Invitrogen</td><td>15090-046</td><td>0,25% trypsine in PBS</td></tr><tr><td>Standaard trypsine</td><td>Reagens</td><td>Invitrogen</td><td>25300-062</td><td>0,05% trypsine-EDTA</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>Enzymevrije dissociatiebuffer</td><td>Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>13151-014</td><td></td></tr><tr><td>Dissociatie-enzymmix</td><td>Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>17104-019</td><td>500 mg collagenase IV</td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H2126</td><td>invriezen in aliquots van 500 &amp;mu;L en herhaaldelijk invriezen en ontdooien vermijden.</td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4527</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>10-017CV</td><td></td></tr><tr><td>Protaminesulfaat</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3369</td><td>8 &amp;mu;g/mL</td></tr><tr><td>EB-differentiatiemedium</td><td>medium</td><td></td><td></td><td>Raadpleeg het recept in het bijgevoegde Protocol.doc</td></tr><tr><td>10% IMDM</td><td>medium</td><td></td><td></td><td>Raadpleeg het recept in het bijgevoegde Protocol.doc</td></tr><tr><td>10% IMDM+cytokinen</td><td>medium</td><td></td><td></td><td>Raadpleeg het recept in het bijgevoegde Protocol.doc</td></tr><tr><td>20% anti-MEM</td><td></td><td></td><td></td><td>Raadpleeg het recept in het bijgevoegde Protocol.doc</td></tr></tbody></table>

afleiding van hematopoietische stamcellen van muriene embryonale stamcellen

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Een stamcel is gedefinieerd als een cel met de capaciteit om zowel de zelf-vernieuwing en het genereren van meerdere gedifferentieerde nageslacht. Embryonale stamcellen (ESC) zijn afgeleid van de blastocyst van de vroege embryo en zijn pluripotent in differentiative vermogen. Hun ruime differentiative potentieel heeft hen de focus van veel onderzoek gericht op het afleiden hoe ze te coax te klinisch bruikbare soorten cellen te genereren. De succesvolle afleiding van hematopoietische stamcellen (HSC) van muis ESC is onlangs bereikt en kunnen worden gevisualiseerd in deze video protocol. HSC, misschien wel de klinisch meest uitgebuite cel populatie, worden gebruikt om een ​​groot aantal hematopoietische maligniteiten en aandoeningen te behandelen. Echter, veel patiënten die baat kan hebben bij HSC therapie geen toegang tot geschikte donoren. ESC zou kunnen bieden een alternatieve bron van HSC voor deze patiënten. Het volgende protocol voorziet in een basislijn vanwaar ESC-HSC kan worden bestudeerd en op de hoogte inspanningen om HSC isoleren van menselijke ESC. In dit protocol worden ESC gedifferentieerd embryoid instanties (EBS) voor 6 dagen in de handel verkrijgbare serum vooraf gescreend voor een optimale hematopoietische differentiatie. EBS worden vervolgens gescheiden en geïnfecteerd met retrovirale HoxB4. Geïnfecteerde EB-afgeleide cellen worden uitgeplaat op OP9 stroma, een beenmerg stromale cellijn afgeleid van de Calvaria van M-CSF-/ - muizen, en co-gekweekt in de aanwezigheid van hematopoiese het bevorderen van cytokines voor tien dagen. Tijdens deze co-cultuur, de geïnfecteerde cellen sterk uit te breiden, wat resulteert in de generatie van een heterogene pool van 100s van miljoenen cellen. Deze cellen kunnen vervolgens worden gebruikt om de reddings-en reconstitueren dodelijk bestraalde muizen.

Dit protocol beschrijft de afleiding van transplanteerbare hematopoietische stamcellen uit muis embryonale stamcellen (ESC) en de daaropvolgende injectie in dodelijk bestraalde ontvangende muizen. In het kort, worden ESC gedifferentieerd embryoid lichamen, die vervolgens besmet zijn met retrovirale HoxB4 en co-gekweekt met OP9 stromale cellen en hematopoietische cytokines.

Afleiding van hematopoietische stamcellen van muriene embryonale stamcellen

Een stamcel wordt gedefinieerd als een cel met het vermogen om zowel zichzelf te vernieuwen als meerdere gedifferentieerde nakomelingen te genereren. Embryonale stamcellen (ESC) zijn ...

Als eerste nemen we een concurrente T 25-fles met umsl. Ik ga deze wassen met PBS en voeg vervolgens een paar druppels TR toe. Laat dit een paar minuten inwerken. Ik kan zien dat de cellen loslaten van de plaat, dus het is vrijwel klaar.Oké, nu ga ik de met trypsine behandelde oogcellen verzamelen. Het is raadzaam om de met trypsine behandelde oogcellen heel kort te tritureren om de celkolonies op te breken voordat ze op de UN-plaat worden geplaatst. Deze plaat blijft vervolgens ongeveer 30 tot 45 minuten in de incubator staan. Nu ga ik deze cellen centrifugeren om ze te verzamelen en zal ik het supernatant aspireren.Ik ga over een paar minuten resuspenderen zodat ik dit kan tellen. Dus ik resuspendeer en nu ik geteld heb, neem ik een aliquot. Ik ga deze aliquot aanvullen tot 50 ml; dat geeft me de juiste concentratie om honderd cellen per druppel te krijgen, om er zeker van te zijn dat de cellen in orde zijn. Nu hebben we een reservoir.Schud deze nog een keer kort door en giet ze vervolgens in ons reservoir. Oké, dit is al geprogrammeerd. Zo, dat is gelukt.Nu is het vrij recht. Draai het om en leg het gewoon opzij. Om de paar platen kantel ik het een beetje, zodat het een beetje h

derivation-hematopoietic-stem-cells-from-murine-embryonic-stem

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Het vermogen van menselijke embryonale stamcellen om zichzelf te vernieuwen en te differentiëren in alle celtypen van het lichaam, suggereert dat zij een grote belofte voor zowel de medische toepassingen en als een research tool voor het aanpakken van fundamentele vragen bij ontwikkeling en ziekte vast te houden. Hier bieden wij een beknopte, stap-voor-stap protocol voor de winning van menselijke embryonale stamcellen uit embryo's door immunosurgical isolatie van de binnenste celmassa.

Afleiding van menselijke embryonale stamcellen door Immunosurgery

Een methode om de verdeling van beenmerg hematopoietische stamcellen in flowcytometrie en efficiënt isoleren sterk gezuiverde hematopoietische stamcellen (HSC) analyse beschreven. De isolatie procedure is in hoofdzaak gebaseerd op magnetische verrijking van c-Kit + cellen en cel sortering tot HSCs voor cellulaire en moleculaire studies te zuiveren.

Fenotypische analyse en isolatie van Murine hematopoëtische stamcellen en Lineage-geëngageerde voorouders

Het manipuleren van temporele genexpressie in differentiërende embryonale stamcellen (ESCs) kan worden bereikt met behulp van induceerbare gensystemen. De generatie van deze cellijnen is echter kostbaar en tijdrovend. Dit protocol bereikt snelle expressie van een transgen in differentiërende ES-afgeleide cellen en daaropvolgende analyse van downstream hematopoëtische differentiatie.

Retrovirale infectie van muizen embryonale stamcellijnen Afgeleid embryoiden lichaamscellen voor Analyse van hematopoietische differentiatie

In dit protocol wordt de afleiding van cardiale stamcellen van zowel muis- als menselijke embryonale stamcellen geïllustreerd. Een belangrijke strategie in dit protocol is het verrijken van cardiale stamcellen met middel van flowcytometrie met behulp van fluorescente reporters die in de embryonale stamcellijnen zijn ontworpen.

Afleiding van Cardiac stamcellen uit embryonale stamcellen

Muis embryonale stamcellen kunnen in vitro worden gedifferentieerd tot T-cellen met behulp van het OP9-DL1 co-cultuursysteem. Succes bij deze procedure vereist zorgvuldige aandacht voor reagens/celonderhoud en belangrijke techniekgevoelige stappen. Hier bespreken we deze kritieke parameters en bieden we een gedetailleerd protocol om de adoptie van deze technologie te stimuleren.

Afleiding van T cellen In Vitro Van muis embryonale stamcellen

Hematopoietische stamcellen en progenitorcellen (HSPC) afgeleid van gespecialiseerde (hemogenic) endotheelcellen tijdens de ontwikkeling, maar weinig bekend over het proces waarbij sommige endotheelcellen specificeren bloedvormende worden. We tonen een stroom-cytometrie-gebaseerde methode waarmee gelijktijdige isolatie van hemogenic endotheelcellen en HSPC van muizen embryonale weefsels.

Isolatie van muizen embryonale Hemogenic endotheelcellen

Het hier beschreven protocol beschrijft de inductie van een hemogenetisch programma in muis embryonale fibroblasten via overexpressie van een minimale set transcriptiefactoren. Deze technologie kan worden toegepast op het menselijk systeem om platforms te bieden voor toekomstig onderzoek naar hematopoëse, hematologische ziekten en hematopoietische stamceltransplantatie.

Herprogrammeren muis embryonale fibroblasten met transcriptiefactoren een Hemogenic Program Laten

Hier presenteren we menselijke pluripotente de protocollen van de cultuur van het cel van de stam (hPSC), gebruikt om te onderscheiden van hPSCs in CD34+ hematopoietische progenitorcellen. Deze methode maakt gebruik van fase-specifieke manipulatie van canonieke WNT signalering cellen uitsluitend naar ofwel het definitieve of primitieve hematopoietische programma opgeven.

Regie van differentiatie van primitieve en definitieve hematopoietische progenitorcellen van menselijke pluripotente stamcellen

Dit artikel beschrijft een protocol om efficiënt ontlenen en cultuur pluripotente stamcellijnen uit muis embryo's in het blastocyst stadium.

Afleiding van stamcellijnen uit muis voor inplanting embryo 's

Hier presenteren we methodologie voor de klonale analyse van hematopoietische stamcellen precursoren tijdens lymfkliertest embryonale ontwikkeling. Wij combineren index sortering van afzonderlijke cellen uit de embryonale aorta-gonaden-mesonephros regio met endothelial co celkweek en transplantatie te karakteriseren de fenotypische eigenschappen en het engraftment potentieel van één hematopoietische precursoren.

Klonen analyse van embryonale hematopoietische stamcellen precursoren met eencellige Index sorteren gecombineerd met Endothelial Niche co celkweek

Hier wordt een eenvoudig protocol gepresenteerd voor de gerichte differentiatie van hemogene endotheelcellen van menselijke pluripotente stamcellen in ongeveer 1 week.

Gerichte differentiatie van hemogene endotheelcellen uit menselijke pluripotente stamcellen

Leer hoe je hematopoëtische stamcellen afleidt van muizenembryonale stamcellen via embryoid bodies en retrovirale HoxB4-infectie. Dit protocol maakt transplantatie en reconstitutie van het hematopoëtische systeem mogelijk.

Afleiding van hematopoietische stamcellen van muriene embryonale stamcellen

Meer video's verkennen