Een snelle High-throughput Methode voor Mapping Ribonucleoproteins (RNP's) op de menselijke pre-mRNA

Om de bindingsplaatsen van ribonucleaire eiwitten op pre-mRNA's in kaart te brengen, begint u door te tegelen over het aangewezen gebied van het pre-mRNA van belang in ramen van 30 nucleotiden en synthetiseer de getegelde oligo's op een array. De oligo's worden afgekookt van de array en bezinken samen met een RNP van belang. De totale startpool wordt gelabeld met SCI drie en de gebonden pool wordt gelabeld met SCI vijf, en beide worden toegepast op de detectiearray.

De array wordt vervolgens gescand en de feature-extractiesoftware wordt gebruikt om de resultaten te interpreteren.Zouten. Hallo, ik ben Kate Watkins van het laboratorium van Will Fair brother in de MCB-afdeling van Brown University. Vandaag zal ik u een snelle en goedkope procedure laten zien voor het bepalen van de precieze locatie van een RNA-eiwitcomplex op pre-mRNA in het lab, rere syntheseer pre-mRNA als een pool van overlappende oligonucleotiden.

Deze pool kan vervolgens worden gescheiden in een gebonden en vrije fractie door co-immunoprecipitatie en vervolgens geanalyseerd door een microarray. Hoewel deze procedure veel toepassingen heeft, gebruiken we het om meerdere splicingfactoren en hun rol en alternatieve splicing te bestuderen. Dus laten we beginnen.

Om deze procedure te beginnen, gebruikt u de uc SC-genoombrowser om bepaalde genen, splice-juncties of andere gebieden van belang te downloaden waaruit de pre-mRNA-pool kan worden ontworpen. Selecteer de vensters van belang, tegel vervolgens computationeel over ze met een leeslengte van 30 nucleotiden en een overlapping van 20 nucleotiden zodat elke oligo met 10 nucleotiden van de vorige verschuift. Nu de 30 nucleotiden lange oligo's zijn gedefinieerd, flankeer ze met universele primersequenties.

Dien de oligo's in bij Agilent voor afdrukken op een aangepaste oligonucleotide microarray. Zodra de microarray aankomt, begint u met het herstellen van de DNA-oligo's van het oppervlak door de arraydekslide in een arrayhybridisatiekamer te plaatsen en voorzichtig 500 microliter gedeïoniseerd water op de slide te pipetteren. Plaats de microarrayslide met de voorkant naar beneden op de dekslide zodat de labels op elke slide naar elkaar kijken en zorg ervoor dat u luchtbellen vermijdt die het oligoherstelproces kunnen verstoren.

Sluit de hybridisatiekamer en draai hem een nacht lang op 99 graden Celsius in een hybridisatieoven. De volgende dag verwijdert u voorzichtig de array uit de kamer en zuigt u het water af, dat nu de oligo's bevat die van het arrayoppervlak zijn bevrijd. Plaats de pool van vrijgekomen oligo in een 1,5 milliliter einorbuis en soniceer om potentiële klonten te breken bij 50% amplitude drie keer gedurende drie tot vijf seconden pulsen per keer. Vervolgens versterkt u de pool door middel van low-cycle PCR met universele primers met een T-promotor aan het einde.

Het aantal vereiste cycli kan variëren, afhankelijk van de efficiëntie van oligoherstel. Vermijd overversterking, die zichtbaar is als een gesmeurde band op een acrylamidegel. Gebruik ten slotte de mega short script kit van Amon om RNA te transcriberen.

Beëindig de transcriptiereactie door fenylchloroformextractie van het RNA, gevolgd door ethanolprecipitatie met natriumacetaat en ook glycoblue als drager. Breng de RNA-pellet weer in suspensie in 105 microliter TE-buffer. Om de concentratie van het RNA nauwkeurig te bepalen.

Gebruik ribogroen om een standaardcurve te genereren. Meet vervolgens met behulp van een fluorescentieplatelezer. De RNA-pool is nu klaar voor co-immunoprecipitatie om de pull-down te starten.

Bereid eerst de magnetische kralen voor door protein A en protein G dyna-kralen in een een-op-een-verhouding te combineren tot een eindvolume van 50 microliter per reactie. Concentreer de kralen op één plek met behulp van een magnetische scheidingstand om het supernatant te verwijderen. Was vervolgens twee keer met een gelijk volume van koud één XPBS na de tweede wasbeurt.

Breng de kralen weer in suspensie in een gelijk volume van koud één XPBS en voeg twee nanogram van het antilichaam perion toe. Deze hoeveelheid kan variëren afhankelijk van het antilichaam, dus experimenteren kan nodig zijn om de optimale omstandigheden te vinden om het antilichaam aan de kralen te binden. Incubeer de mengsels een nacht lang bij vier graden Celsius op een roterend platform.

In de ochtend voegt u twee microgram per reactie van gesonifieerde gist-totaal-RNA toe om niet-specifieke binding te blokkeren en draait u gedurende nog eens 30 minuten bij vier graden Celsius. Zodra de blokkeerstap is voltooid, gebruikt u opnieuw de magnetische rek om het supernatant te verwijderen. Was vervolgens de kralen twee keer met koud één XPBS waarbij het PBS van de tweede wasbeurt in de buis achterblijft. Pipetteer 50 microliter van het kralenmengsel in nieuwe buisjes.

Eén buisje voor elke co-IP-reactie. De kralen zijn nu klaar voor de co-ip. Bereid vervolgens de mastermix voor door de RNA-oligo-pool te combineren met nucleair cellextract.

Neem als RNP-bron een 50 microliter aliquot van de mastermix als een totaal monsterbescherming. Primers, die RNA-versies van de universele primers zijn, kunnen worden toegevoegd om eiwitbinding aan de primersequentie of het introduceren van secundaire structuur in het RNA te voorkomen. Om de co-immunoprecipitatie te starten, verwijdert u het supernatant van de kralenaliquots en suspendeert u de kralen opnieuw in 120 microliter van de resterende mastermix. Wieg de reacties bij vier graden Celsius gedurende één tot twee uur.

Aan het einde van de incubatie kan een kleine Eloqua, inclusief de kralen, worden verwijderd uit elk co-ip. Voor aanvullend testen van bindingsefficiëntie of specificiteit, plaatst u de resterende reacties op de magneet en verwijdert u het supernatant. Volg met één tot twee wasbeurten met koud één XPDS.

Het RNA dat aan het antilichaam op de kralen is gebonden via de RNP is het IP-monster. Breng de IP-kralen weer in suspensie in 50 microliter 1% SDS in 0,1 XTE-buffer en verwarm de monsters gedurende 15 minuten bij 65 graden Celsius. Om het RNA te elueren, verwijdert u het supernatant, dat nu het RNA bevat dat eerder aan de kralen was gebonden en schoon door fenylchloroformextractie, gevolgd door een ethanolprecipitatie, breng de pellet we