Technische Cel-permeabel Protein
28 december 2009
Eiwit transductie maakt de directe levering van biologisch actieve eiwitten in cellen. In tegenstelling tot conventionele methoden, zoals DNA-transfectie of virale transductie deze niet-invasieve paradigma maakt zeer efficiënte cellulaire manipulatie in een titreerbare manier te omzeilen cellulaire toxiciteit en het risico van oncogene transformatie door permanente genetische modificatie.
De manipulatie van cellulaire functie kan worden bereikt door middel van de klassieke benaderingen van DNA-transfectie of virale transductie in de afgelopen 15 jaar. Een andere methode ontwikkelde zich. De biologische actieve proteïne van eiwittransductie kan direct in zoogdiercellen worden afgeleverd met behulp van kleine peptiden die zijn gefuseerd met het eiwit van belang, wat de cellulaire opname bevordert.
Aangezien er geen DNA wordt gebruikt, wordt het risico van exertie-agenesie voorkomen. In tegenstelling tot de bovengenoemde klassieke methoden. De eiwittransductie maakt de levering van eiwitten op een titrable manier mogelijk.
Bovendien kunnen kleine celpopulaties evenals niet-delende cellen, zoals postmitotische neuronen, worden gemoduleerd. Om recombinant eiwit op een efficiënte manier tot expressie te brengen, raden we het gebruik van het Paciz-vectorsysteem aan. Het is een modulair vectorsysteem dat bestaat uit een eindterminaal en een C-terminaal variant.
Beide vectoren maken de eenvoudige invoeging van uw gen van belang mogelijk voor de zuiveringsmiddelen. Een histidine-tag wordt geïntegreerd evenals een eiwittransductiedomein. In ons geval is touch van het HI-virus dat de cellulaire opname voor cellulaire verdeling bevordert.
Een nucleair lokalisatie-signaal voltooit de vector om redenen van controle. Fusie-tags kunnen eenvoudig worden verwijderd. Naast de rangschikking van deze tags kan deze een grote invloed hebben op de eigenschappen van de fusie-eiwitten. De invloed op opbrengst en zuiverheid evenals verkoopbaarheid en biologische functie is niet voorspelbaar.
Hallo, mijn naam is Bernard Mus en ik werk in de stamcel-engineeringgroep in het Instituut voor Reconstructieve Neurobiologie in Bond, Duitsland. Hallo, mijn naam is Christoph P en ik ben ook lid van de Hoover Lab. Onze werkgroep exploiteert intensief de eiwittransductietechniek om direct biologisch actief eiwit in verschillende zoogdiercellen af te leveren, en vandaag willen we je door het proces van expressie en zuivering in en uit e coli leiden.
Daarna willen we je laten zien hoe je een permanent fusie-eiwit in celcultuur kunt toepassen om het hele procedure-expressie, zuivering en toepassing te illustreren. We maken gebruik van de site-specifieke recombinatie Cree om genetisch gemodificeerde muis-onic-stamcellen te veranderen. Oké. Oké. Laten we beginnen.
Om de overnachtingscultuur te inocculeren, maken we gebruik van reeds getransformeerde bacteriën die zijn opgeslagen in een glycerolvoorraad bij minus 80 graden Celsius. Deze bacteriën bevatten al de vector die codeert voor decre recombinatie. Met behulp van een pipertip krabben we een kleine hoeveelheid van de bacteriën op de pipertip en laten we deze in de beker vallen die de overnachtingscultuur bevat.
De overnachtingscultuur bestaat uit LB-media aangevuld met glucose bij een eindconcentratie van oh 0,5% en 50 microgram koolzuurinsuline per ml. De beker wordt vervolgens in een incubator geplaatst die op 37 graden Celsius loopt voor de expressie van de site-specifieke Recombinate Cree. We gebruiken pre-oorlog TB-media voor onze grootschalige expressiecultuur.
Om de expressie te versnellen, raden we het gebruik van TB-media aan dat is opgewarmd tot 37 graden Celsius, wat de temperatuur vertegenwoordigt tijdens de expressie van het recombinante eiwit. Vervolgens voegen we glucose toe aan het TB-media bij een eindconcentratie van oh 0,5%. De glucose voorkomt een verhoogde basale expressie van het fusie-eiwit tijdens de groei van de expressiecultuur vóór inductie. Ten slotte wordt ampicilline toegevoegd aan de expressiecultuur bij een eindconcentratie van 100 microgram per ml om een zuivere cultuur te garanderen die alleen de bacteriën bevat die nog steeds het plasmide coderen voor decree-eiwit.
We kunnen nu onze overnachtingscultuur nemen en de expressiecultuur in de verhouding van één op vijftig inoculeren. De bekers worden vervolgens overgebracht naar een incubator die op de temperatuur van 37 graden Celsius loopt. U moet regelmatig monsters nemen om de optische dichtheid te meten gedurende de expressie.
Zodra de cultuur een optische dichtheid van 1,5 heeft bereikt, worden de bacteriën geïnduceerd met een eindconcentratie van oh 0,5 millimolar van IPTG. Na één uur inductie wordt de expressiecultuur overgebracht in buizen en vervolgens geoogst via centrifugatie. Voor dit doel gebruiken we een SLA 3000 rotor.
De centrifuge draait met een snelheid van 5.000 rond per minuut gedurende 10 minuten bij vier graden antegrade. De snat wordt vervolgens weggegooid en de bacteriële pellet kan onbeperkt worden bewaard bij min 20 graden Celsius. De bevroren pellets worden opgelost in lizza-buffer, een appelaat dat overeenkomt met één liter expressiecultuur.
We gebruiken 10 ml lizza-buffer wachten ongeveer 15 minuten totdat de oplossing homogeen wordt. Er wordt vervolgens één milligram lysozym toegevoegd per ML van de suspensie. De oplossing wordt 20 minuten gemengd om het enzym te laten breken van de bacteriën.
Vervolgens wordt Benson Nase toegevoegd in een verdunning van één op duizend gedurende nog eens 15 minuten, wat het DNA zal snijden en resulteert in een niet-viskeuze oplossing. Ten slotte wordt een son ator gebruikt om de lysis van de cellen te garanderen. Het programma draait een anderhalf minuut met een vermogen van 45% na voltooiing van de certificering.
Onthoud om van elke stap hier een monster te nemen, het ruwe lysate of SDS-pagina-analyse van de zuivering. Het is nu heel belangrijk om één ml ijskoud TSB-buffer per ML van de suspensie toe te voegen, omdat decree-eiwit de neiging heeft om te precipiteren in de glycerolvoorraad. Als u deze stap gaat overslaan, wordt de oplossing kort gemengd en de ruwe is nu klaar voor centrifugatie.
Voor dit doel gebruiken we een SS 34 rotor. De centrifuge draait 17.000 RPM gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Als het klaar is, brengt centrifuge Inc het S-supernatant voorzichtig over in verse 50 ml Falcon-buizen.
Voeg nu nikkel anti A-slurry toe aan het supernatant nikkel. Anti A is een cruciaal reagens voor de juiste zuivering van de his
Overzicht
Dit artikel bespreekt eiwittransductie als een methode voor het direct leveren van biologisch actieve eiwitten in zoogdiercellen. In tegenstelling tot traditionele methoden zoals DNA-transfectie, is eiwittransductie niet-invasief en maakt het efficiënte cellulaire manipulatie mogelijk zonder de risico's die gepaard gaan met permanente genetische modificatie.
Belangrijke Studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Eiwitengineering
Achtergrond
- Klassieke methoden voor cellulaire manipulatie omvatten DNA-transfectie en virale transductie.
- Eiwittransductie gebruikt kleine peptiden om de cellulaire opname van eiwitten te verbeteren.
- Deze methode is bijzonder nuttig voor niet-delingscellen, zoals post-mitotische neuronen.
- Het Paciz-vectorsysteem wordt aanbevolen voor efficiënte recombinante eiwitexpressie.
Doel van Studie
- Om het proces van het uitdrukken en zuiveren van eiwitten in E. coli te demonstreren.
- Om de toepassing van cell-permanente fusie-eiwitten in celcultuur te illustreren.
- Om het gebruik van plaatsspecifieke recombinatie voor genetische modificatie van stamcellen te verkennen.
Gebruikte Methoden
- Inoculatie van overnachtelijke culturen van getransformeerde bacteriën.
- Gebruik van LB-media en TB-media voor eiwitexpressie.
- Inductie van eiwitexpressie met behulp van IPTG.
- Zuivering van eiwitten met behulp van nikkelaffiniteitschromatografie.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle expressie van recombinante eiwitten in E. coli.
- Efficiënte zuivering van histidine-getaggede fusie-eiwitten.
- Demonstratie van eiwittransductie in zoogdiercellen.
- Inzichten in de invloed van fusietags op eiwiteigenschappen.
Conclusies
- Eiwittransductie is een haalbaar alternatief voor traditionele genetische modificatiemethoden.
- Het Paciz-vectorsysteem vergemakkelijkt efficiënte eiwitexpressie en zuivering.
- Verder onderzoek is nodig om fusie-eiwiteigenschappen voor specifieke toepassingen te optimaliseren.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Protein transduction enables direct delivery of functional proteins into mammalian cells without genetic modification, offering a titratable and reversible approach for target validation in early discovery. This method supports mechanistic de-risking by allowing rapid interrogation of protein function in disease-relevant systems, including non-dividing cells such as neurons. It provides a scalable platform for assay development and phenotypic screening where genetic tools are limited or undesirable.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of target proteins through direct delivery, supporting hypothesis testing and pathway clarification.
- Operational Value: Provides a titratable system to modulate protein activity in a controlled, dose-dependent manner.
- Predictive Value: Reduces reliance on overexpression artifacts, improving confidence in target engagement and phenotypic outcomes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitatively measurable outputs such as recombination efficiency, enabling robust assay readouts for compound or modulator screening.
- Operational Value: Utilizes standardized purification via histidine tag and nickel affinity chromatography, ensuring reproducibility across batches.
- Scalability: Supports large-scale expression in E. coli using TB media and IPTG induction, facilitating consistent reagent supply for screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Delivers active Cre recombinase to validate loxP-based reporter systems, enabling preclinical assessment of genetic modification efficiency.
- Disease-Relevant System: Effective in post-mitotic neurons and primary cells, supporting target validation in neurologically relevant models.
- Mechanistic De-risking: Allows temporal control of protein activity to distinguish on-target effects from compensatory mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing a chemically inducible, non-genetic tool for target validation, bridging recombinant protein production with functional cellular assays in a scalable format.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven validation of protein function through direct delivery and intracellular activity measurement.
- Screening: Enables standardized, reproducible protein preparation for high-confidence screening of modulators or genetic backgrounds.
- Analytics: Generates quantitative functional readouts (e.g., recombination efficiency via blue-white screening) to compare conditions and guide decision-making.
- Translational Research: Connects in vitro recombination efficiency to preclinical genetic modification outcomes in stem cell models.
- Enterprise Reuse: The Paciz vector system and purification protocol establish a reusable platform for producing diverse cell-permeable proteins across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves target validation confidence by avoiding genomic integration and enabling acute, reversible protein modulation.
- Operational Value: Delivers standardized, purified recombinant protein with consistent activity, reducing variability in functional assays.
- Strategic Value: Increases go/no-go decision accuracy by providing direct functional evidence of target engagement in complex cellular environments.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on functional validation in disease-relevant, non-dividing cell types.
Implementation Considerations
- Requires expertise in recombinant protein expression, purification, and mammalian cell culture for transduction assays.
- Dependent on nickel-affinity chromatography infrastructure and access to IPTG, TB media, and protease inhibitors for lysis.
- Necessitates standardization of transduction conditions (e.g., protein concentration, incubation time) across cell types due to serum sensitivity and variable uptake efficiency.
- Requires optimization of fusion tag arrangement (e.g., TAT, NLS, His-tag) to balance solubility, yield, and biological activity.
- Limited by the need to empirically determine active concentration and incubation duration for each target protein and cell type.
