Optische opnemen van elektrische activiteit in Guinee-pig Enteric Netwerken met behulp van voltage-gevoelige kleurstoffen

Deze video demonstreert de dissectie en daaropvolgende beeldvorming van elektrisch gestimuleerde preparaten van het enterisch zenuwstelsel met behulp van de voltagesensitieve kleurstof D4-ANEPPDHQ. Een klein segment van de darm wordt genomen van een geëuthanaseerd cavia en gedissecteerd om eerst de submucosa en uiteindelijk de myenterische plexus bloot te leggen voor optische registraties. Elektroden worden geplaatst op het gemonteerde weefsel dat is gekleurd met D4-ANEPPDHQ nadat er een initiële afbeelding met hoge resolutie is vastgelegd.

Optische veranderingen die duiden op elektrische activiteit worden geregistreerd met de hogesnelheidscamera. Tijdens de hogesnelheidsopname wordt elektrische stimulatie toegepast. Het beeld met hoge resolutie wordt vervolgens over de pixelkaart van de hogesnelheidscamera gelegd voor analyse met neuro plex.

Hallo, ik ben Brian Salzberg, directeur van het Laboratory of Cellular Optics, of 'loco', zoals we het noemen, bij de afdeling Neurowetenschappen aan de University of Pennsylvania. Mijn naam is Analia Obide. Ik ben ook lid van het Laboratory of Cellular Optics.

Vandaag tonen we u een procedure voor het registreren van elektrische activiteit uit intacte neurale netwerken van zoogdieren met behulp van spanningsgevoelige kleurstoffen. We gebruiken deze procedure om de neurale connectiviteit binnen en tussen de twee netwerken te bestuderen die het enterische zenuwstelsel vormen, ook wel bekend als het tweede brein of het brein van de darm. Laten we beginnen.

Begin de preparaties van de submucosa en het enterische plexus voor te bereiden door de dunne darm te excideren van een Hartley cavia van 150 tot 200 gram of twee tot drie weken oud, die is geanestheseerd met isofluorane via inhalatie en vervolgens is gedecapiteerd. Verwijder vervolgens de darminhoud door het lumen door te spoelen met een warme, zuurstofrijke M1 99 DM-oplossing. Snijd een darmsegment van acht tot 10 centimeter lang, waarbij u erop let dat de polariteit behouden blijft.

Breng het over naar een met sard gecoate glazen schaal van 10 centimeter met M1 99 DM op kamertemperatuur. Plaats de schaal onder een dissectiemicroscoop met donkerveldverlichting. Open vervolgens met een schaar de mesenteriale rand en gebruik insectenspelden om het darmsegment met de mucosa-zijde naar boven te fixeren.

Het is uiterst belangrijk om een gelijkmatige spanning te handhaven, zodat het weefsel na het vastpinnen een rechthoekige vorm vertoont met regelmatig uitgelijnde rijen slijmvliesplooien, terwijl u fijne Dumont-pincetten met rechte tips in een nagenoeg horizontale positie houdt. Pel het slijmvlies af door de plooi aan één uiteinde van het darmsegment vast te pakken en langs de longitudinale as van het weefsel weg te trekken. Ga door met het scheiden van stroken slijmvlies om de submucosa bloot te leggen, welke de submucosale ganglia en de submucosale vasculatuur bevat.

Maak vervolgens met een zeer fijne schaar een incisie in de submucosale laag, in de richting van de circulaire spiervezels. Til daarna de submucosa zeer voorzichtig op met de fijne pincet, terwijl u de circulaire spier wegdrukt. Pel de laag naar beneden met de schaar en snijd langs de longitudinale randen.

Bevrijd de submucosa van de rest van het preparaat naarmate de scheiding vordert. Maak nu een tweede snee langs de oriëntatie van de circulaire spiervezels op een afstand van 1,5 tot drie centimeter van de eerste snee om de uiteindelijke grootte van het submucosale preparaat te bepalen; het resulterende submucosale segment is 30 tot 50 µm dik en heeft een doorschijnend uiterlijk. Verplaats het naar een andere sylgard-schaal met vers M1 99 DM en spelden het voorzichtig en zonder spanning vast.

Plaats de schaal vervolgens in een zuurstofrijke kamer bij kamertemperatuur voor later gebruik. Het oorspronkelijke darmsegment moet nu ontdaan zijn van het mucosa en submucosa, waardoor de ringvormige spierblootgesteld is. Dit segment wordt nu gebruikt om een myenterisch plexus-preparaat te maken om de myenterische plexus bloot te leggen.

Verwijder zoveel mogelijk van de circulaire spierlaag door met fijne pincetten met een rechte punt vezelbundels van beide zijden van het preparaat weg te trekken. Het blootgelegde myenterische plexus kan niet worden gescheiden van de longitudinale spierlaag en de onderliggende CI. Breng het myenterische plexus-preparaat over naar een nieuwe, met sard gecoate schaal met geoxygeneerde M1 99 M. Zet vervolgens het monster, dat levend spierweefsel bevat, losjes vast met pinnen. Enkele minuten voor het optische experiment wordt het preparaat overgebracht naar een nieuwe, kleinere, met syl guard gecoate schaal die reeds is gevuld met M1 99 DM met twee micromolar nefe om spiercontractie te voorkomen; monteer het monster stevig door voorzichtig meerdere zeer fijne pinnen rond de rand te plaatsen.

Zorg ervoor dat de spanning gelijkmatig is verdeeld en dat het weefsel volledig plat tegen de bodem van de sil guard ligt. De weefselpreparatie is nu klaar voor fysiologische experimenten. Bereid in een glazen vial een staande oplossing van 5 tot 50 µg/mL DAI four A-N-E-P-P-D HQ in M1 99 M met 2 µM nifedipine en bedek deze met aluminiumfolie.

Ethanol uit de stokoplossing moet minder dan 0,5% van de M1 99 DM-oplossing met Nifedipine vormen die het preparaat bedekte; vervang deze door de bereide kleurstofoplossing. Gebruik een voldoende volume van de ladder om het weefsel volledig te bedekken en laat dit na de incubatie 10 tot 30 minuten incuberen bij kamertemperatuur. Was het preparaat met zuurstofrijke M1 99 M plus NEFE door de volledige inhoud van de kamer te vervangen.

Optische registratie van neuronale activiteit in elektrisch gestimuleerde preparaten wordt uitgevoerd met een systeem bestaande uit een rechtopstaande epifluorescentiemicroscoop uitgerust met een image splitter, een precisie hogesnelheidscamera met lage resolutie, een zwart-witcamera met hoge resolutie, een computergestuurde stimulusgenerator en een micromanipulator. Het gehele apparaat is gemonteerd op een actieve trillingsisolatietafel en omgeven door zware akoestische gordijnen en een Mylar-dak om luchttrillingen te minimaliseren. Hoewel beeldacquisitie van beide camera's kan worden uitgevoerd met één computer waarop zowel Neuroplex als Global Lab Image 2 of een andere beeldacquisitesoftware draait, maakt de hier getoonde opstelling gebruik van twee computers die elk een aparte camera aansturen om de optische experimenten te starten.

Plaats de kamer met het gekleurde, uitgespreide monster op de microscooptafel. Aangezien D four A en EPPD HQ membraan-impermanente kleurstoffen zijn die alleen fluoresceren in een lipideomgeving, zouden gezonde neuronen uit een gekleurd enterisch preparaat er bij elke vergroting hoger dan 20 x uitzien als lege ballonnen wanneer ze worden bekeken. Gebruik de filters HQ 5 35 50 voor excitatie, HQ 5 72 LP voor emissie en een 5 65 nanometer dichroïsche spiegel.

Positioneer vervolgens, met behulp van de bediening van de micromanipulator, een lineaire matrix-array-elektrode met meerdere barrels aan het orale uiteinde van het weefsel, waarbij u erop let dat de elektrode het objectief van de microscoop niet raakt. Een lineaire matrix-array met 10 wolfraamelektroden verdeeld over een breedte van één centimeter is in staat om verschillende onafhankelijke neuronale paden te stimuleren en is uitermate geschikt voor het bestuderen van onderling verbonden ganglioncellulaire circuits. Voor de representatieve gegevens hebben we echter een zelfgemaakte stimulerende elektrode met twee aansluitingen gebruikt.

Gebruik kleefwas om een randelektrode aan het tegenovergestelde uiteinde van de kamer te plaatsen voordat er een functionele registratie wordt gemaakt; neem een zwart-witafbeelding met hoge resolutie van het gebied waarvan de elektrische activiteit zal worden geregistreerd om de visualisatie te vergemakkelijken. De grijswaarden kunnen worden omgekeerd zodat fluorescentie donker verschijnt. Om stroomstimulatie toe te passen met behulp van de computergestuurde stimulusgenerator, programmeert u eerst het apparaat door de juiste intensiteit, duur, frequentie en het aantal stimuli te selecteren, evenals de vertraging ten opzichte van het begin van de optische gegevensacquisitie.

Om er zeker van te zijn dat de stimulatie binnen de grenzen van de optische gegevensverwerving plaatsvindt, configureert u de stimulusgenerator als een door neuro plex aangestuurd apparaat. Stel vervolgens de acquisitieparameters in neuro plex in, waarbij u de framerate, het aantal frames en de cameragevinst aangeeft. Om een actiepotentiaal volledig in kaart te brengen, moet de framerate op minimaal 1 kHz worden ingesteld.

Aangezien D four A en E-P-P-G-H-Q een afname in fluorescentie vertonen bij depolarisatie die lineair gerelateerd is aan de spanningsverandering, moet de weergave van de optische signalen in neuro plex worden omgekeerd, zodat de actiepotentialen niet ondersteboven verschijnen. Start de acquisitie. Vergeet niet om vóór elke functionele opname een nieuw zwart-wit beeld met hoge resolutie van elk gezichtsveld vast te leggen.

Zodra de acquisitie is voltooid, gebruikt u neuro plex om de resultaten offline te analyseren. Een gedeelte van het scherm, genaamd page display, toont het ruwe beeld van het preparaat zoals vastgelegd door de 80 by 80 hogesnelheidscamera als een individueel frame. Wanneer de paginamodus is ingesteld op absolute frame superimposed, wordt het met de tweede camera verkregen hoge-resolutiebeeld via neuro plex-displaycommando's over de pixelmap van het ruwe beeld gelegd.

Hiervoor is het nodig om de paginamodus te wijzigen van absolute trace naar traces en een supergeponeerd beeld te selecteren binnen het weergavecommando. Gebruik de muis om individuele pixels of groepen pixels te selecteren uit het beeld dat in de paginagepresentatie wordt getoond. De outputs van deze regio's van interesse verschijnen als traces binnen het trace-weergavescherm, waarbij de grootte van de optische veranderingen die door deze pixels zijn geregistreerd, als functie van de tijd worden weergegeven.

Het inverteren van de grijstonschaal in de afbeelding met hoge resolutie verbetert de visualisatie op het display van de pagina in sporenmodus, en het wordt sterk aanbevolen om een analoge output van de stimulator weer te geven. Selecteer het analoge outputkanaal om dit in het venster voor spoorweergave op te nemen. Deze output geeft de exacte timing aan van de stimuli die tijdens het experiment zijn toegediend.

Om de gegevens als een film te bekijken, gebruikt u de movie-commando's binnen neuro plex om opeenvolgende frames binnen een dataset weer te geven met pseudokleurschalen die zijn aangepast aan de maximale en minimale verandering in fluorescentie-intensiteit. Een ganglion uit een preparaat van een myenterische plexus, gekleurd met DIA four A-N-E-P-P-D-H-Q, werd gefotografeerd met de camera met hoge resolutie en een 60 x objectief. Tijdens de gegevensverwerving werd het preparaat gestimuleerd met een reeks van vijf pulsen bij 40 hertz.

Met een amplitude van 15 milliamps en een duur van 0,5 milliseconden per puls werden vier regio's van belang (ROI's) geïdentificeerd en werden traces gegenereerd om de optische gegevens, gemiddeld over de geselecteerde regio's, weer te geven in de pseudokleur-framevolgorde van de eerste optische responsregio's; membraandepolarisatie die duidt op neuronale activiteit verschijnt als geel tot rood. Deze gegevens wijzen erop dat door stimulatie opgewekte activiteit plaatsvindt in afzonderlijke regio's van elk ganglion, hoofdzakelijk gedragen door passage-axonen. De ROI's twee, drie en vier identificeren individuele neuronen op verschillende afstanden van ROI één.

Figuur twee illustreert bij een 10 x vergroting de anatomische paden waarlangs informatie zich kan voortplanten; de pijlen geven de richting aan die de stimulus volgt om het geïdentificeerde myenterische ganglion te activeren. We hebben u zojuist de componenten getoond van een optische opstelling voor het registreren van elektrische activiteit met spanningsgevoelige kleurstoffen en hoe, wanneer deze technologie wordt toegepast op het enterische zenuwstelsel, dit de mogelijkheid opent om de functionele connectiviteit binnen en tussen twee intacte mammaliaanse netwerken onder het microscoopveld te bestuderen. Bij het gebruik van optische registratietechnologie is aandacht voor detail uiterst belangrijk.

Optische, mechanische en elektrische geluidsbronnen moeten zorgvuldig worden beheerst en de conditie van het preparaat moet nauwgezet worden behouden. Daarom is de beheersing van alle individuele stappen van dit protocol essentieel voor het succesvol behalen van optische opnames. Dat is alles.

Hartelijk dank voor het kijken en veel succes met uw experimenten.