Optische opnemen van elektrische activiteit in Guinee-pig Enteric Netwerken met behulp van voltage-gevoelige kleurstoffen

Deze video demonstreert de dissectie en daaropvolgende beeldvorming van elektrisch gestimuleerde preparaten van het enterisch zenuwstelsel met behulp van de voltagesensitieve kleurstof D-4-ANEPPDHQ. Een klein segment van de darm wordt genomen van een geëuthanaseerd cavia en gedissecteerd om eerst de submucosa en uiteindelijk de myenterische plexus bloot te leggen voor optische registraties. Nadat een eerste afbeelding met een hoge resolutie is vastgelegd, worden elektroden geplaatst op het gemonteerde weefsel dat is gekleurd met D-4-ANEPPDHQ.

Optische veranderingen die duiden op elektrische activiteit worden geregistreerd met de hogesnelheidscamera. Tijdens de hogesnelheidsacquisitie wordt elektrische stimulatie toegepast. De afbeelding met hoge resolutie wordt vervolgens over de pixelkaart van de hogesnelheidscamera gelegd voor analyse met neuro plex.

Hoi, ik ben Brian Salzberg, directeur van het Laboratory of Cellular Optics, of loco, zoals we het noemen, in de afdeling Neurowetenschappen aan de University of Pennsylvania. Mijn naam is Analia Obide. Ik ben ook een lid van het Laboratory of Cellular Optics.

Vandaag tonen we u een procedure voor het registreren van elektrische activiteit uit intacte neurale netwerken van zoogdieren met behulp van spanningsgevoelige kleurstoffen. We gebruiken deze procedure om de neurale connectiviteit binnen en tussen de twee netwerken te bestuderen die het enterische zenuwstelsel vormen, ook wel het tweede brein of het brein van de darm genoemd. Laten we beginnen.

Begin met het voorbereiden van de submucosale en enterische plexus-preparaten door de dunne darm te excideren van een Hartley cavia van 150 tot 200 gram of twee tot drie weken oud, die is geanestheseerd door isofluraan-inhalatie en is gedecapituleerd. Verwijder vervolgens de inhoud van de darm door het lumen te spoelen met een warme, zuurstofverzadigde M1 99 DM-oplossing. Snijd een darmsegment van acht tot 10 centimeter lengte en zorg ervoor dat de polariteit behouden blijft.

Breng het over naar een met sard gecoate glazen schaal van 10 centimeter die kamertemperatuur M1 99 DM bevat. Plaats de schaal op een dissectiemicroscoop met donkerveldverlichting. Open vervolgens met een schaar de mesenteriale rand en gebruik insectenspelden om het darmsegment met de mucosa naar boven te fixeren.

Het is uiterst belangrijk om een gelijkmatige spanning te behouden, zodat het weefsel na het vastpinnen een rechthoekige vorm heeft waarbij de rijen mucosaal VII regelmatig zijn uitgelijnd, terwijl fijne Dumont-pincetten met rechte punten in een bijna horizontale positie worden gehouden. Pel de mucosa door het VII aan één uiteinde van het darmsegment vast te pakken en langs de longitudinale as van het weefsel te trekken. Ga door met het scheiden van stroken mucosa om de submucosa bloot te leggen, welke de submucosa ganglia en de submucosele vasculatuur bevat.

Maak vervolgens met een zeer fijne schaar een insnede in de submucosale laag, in de richting van de circulaire spiervezels. Til daarna de submucosa zeer voorzichtig op met de fijne pincet, terwijl u de circulaire spier wegdrukt. Pel de laag met de schaar af en snijd langs de longitudinale randen.

Bevrijd de submucosa van de rest van het preparaat naarmate de scheiding vordert. Maak nu een tweede incisie in de richting van de circulaire spiervezels op een afstand van 1,5 tot drie centimeter van de eerste snede om de uiteindelijke afmeting van het submucosale preparaat te bepalen; het resulterende submucosale segment is 30 tot 50 µm dik en heeft een spinragachtig uiterlijk. Breng het over naar een andere Sylgard-schaal met vers M1 99 DM en spelden het voorzichtig en zonder spanning vast.

Plaats de schaal vervolgens in een zuurstofkamer bij kamertemperatuur voor later gebruik. Het oorspronkelijke darmsegment moet nu ontdaan zijn van mucosa en submucosa, waardoor de cirkelvormige spierlaag bloot komt te liggen. Dit segment wordt nu gebruikt om een preparaat van het myenterische plexus te verkrijgen om het myenterische plexus bloot te leggen.

Verwijder zoveel mogelijk van de circulaire spierlaag door met fijne pincetten met een rechte punt bundels vezels van beide zijden van het preparaat weg te trekken. De blootgelegde myenterische plexus kan niet worden gescheiden van de longitudinale spierlaag en de onderliggende CI. Breng het preparaat van de myenterische plexus over naar een nieuwe, met sard gecoate schaal met geoxygeneerd M1 99 M. Zet vervolgens het monster, dat levend spierweefsel bevat, losjes vast met pinnen. Enkele minuten vóór het optische experiment wordt het preparaat overgebracht naar een nieuwe, kleinere, met syl guard gecoate schaal die reeds is gevuld met M1 99 DM met twee micromolair nefe om spiercontractie te voorkomen; monteer dit stevig door voorzichtig meerdere zeer fijne pinnen rond de omtrek te plaatsen.

Zorg ervoor dat de spanning gelijkmatig is verdeeld en dat het weefsel volledig plat tegen de bodem van de sil guard ligt. De weefselpreparatie is nu klaar voor fysiologische experimenten. Bereid in een glazen vial een staande oplossing van 5 tot 50 µg/mL DAI four A-N-E-P-P-D HQ in M1 99 M met 2 µM nifedipine en dek deze af met aluminiumfolie.

Ethanol uit de stamoplossing moet minder dan 0,5% van de oplossing van M1 99 DM met nifedipine vormen die het preparaat bedekte; vervang deze door de bereide kleurstofoplossing. Gebruik voldoende volume van de kleurstof om het weefsel volledig te bedekken en laat dit na de incubatie 10 tot 30 minuten incuberen bij kamertemperatuur. Was het preparaat met geoxygeneerde M1 99 M plus NEFE door de volledige inhoud van de kamer te vervangen.

Optische registratie van neuronale activiteit in elektrisch gestimuleerde preparaten wordt uitgevoerd met een systeem dat bestaat uit een rechtopstaande epifluorescentiemicroscoop uitgerust met een beeldsplitter, een precisiecamera met lage resolutie en hoge snelheid, een zwart-witcamera met hoge resolutie, een computergestuurde stimulusgenerator en een micromanipulator. De gehele opstelling is gemonteerd op een actieve trillingsisolatietafel en omgeven door zware akoestische gordijnen en een Mylar-dak om luchtborne trillingen te minimaliseren. Hoewel beeldacquisitie van beide camera's kan worden uitgevoerd met een enkele computer waarop zowel Neuroplex als Global Lab Image Two of een andere beeldacquisitiesoftware draait, maakt de hier getoonde opstelling gebruik van twee computers die elk een afzonderlijke camera aansturen om de optische experimenten te starten.

Plaats de kamer met het gekleurde panned-monster op de objecttafel van de microscoop. Aangezien D four A en EPPD HQ membraanimpermanente kleurstoffen zijn die alleen fluoresceren in een lipideomgeving, zouden gezonde neuronen uit een gekleurde enterische preparaat er bij elke vergroting hoger dan 20 x uitzien als lege ballonnen wanneer ze worden bekeken. Gebruik de filters HQ 5 35 50 voor excitatie, HQ 5 72 LP voor emissie en een 5 65 nanometer dichroïsche spiegel.

Positioneer vervolgens, met behulp van de bediening van de micromanipulator, een lineaire matrixarray-elektrode met meerdere hulsjes aan het orale uiteinde van het weefsel, waarbij u erop let dat de elektrode vrij blijft van het objectief van de microscoop. Een lineaire matrixarray met 10 wolfraamelektroden over een bereik van één centimeter is in staat om verschillende onafhankelijke neurale paden te stimuleren en is zeer geschikt voor het bestuderen van onderling verbonden ganglioncircuits. Voor de representatieve gegevens hebben we echter een zelfgemaakte stimulerende elektrode met twee draden gebruikt.

Gebruik plakwas om een randelektrode aan het tegenovergestelde uiteinde van de kamer te plaatsen voordat er een functionele opname wordt gemaakt; verkrijg een zwart-witafbeelding met een hoge resolutie van het gebied waarvan de elektrische activiteit zal worden geregistreerd om de visualisatie te ondersteunen. De grijswaarden kunnen worden omgekeerd zodat fluorescentie donker verschijnt. Om stroomstimulatie toe te passen met behulp van de computergestuurde stimulusgenerator, programmeert u het apparaat eerst door de juiste intensiteit, duur, frequentie en het aantal stimuli te selecteren, evenals de vertraging ten opzichte van het begin van de optische gegevensacquisitie.

Om er zeker van te zijn dat de stimulatie binnen de grenzen van de optische gegevensverwerving plaatsvindt, configureert u de stimulusgenerator als een neuro plex-gestuurd apparaat. Stel vervolgens de acquisitieparameters in neuro plex in, waarbij u de framerate, het aantal frames en de camerawinst aangeeft. Om een volledige definitie van een actiepotentiaal te verkrijgen, moet de framerate op minimaal 1 kHz worden ingesteld.

Aangezien D four A en E-P-P-G-H-Q een afname in fluorescentie vertonen bij depolarisatie die lineair gerelateerd is aan de spanningsverandering, moet de weergave van de optische signalen in neuro plex worden omgekeerd, zodat de actiepotentialen niet ondersteboven verschijnen. Start de acquisitie. Vergeet niet om vóór elke functionele opname een nieuwe zwart-witafbeelding met hoge resolutie van elk gezichtsveld te maken.

Zodra de acquisitie is voltooid, gebruikt u NeuroPlex om de resultaten offline te analyseren. Een gedeelte van het scherm, genaamd page display, toont het ruwe beeld van de preparaat zoals vastgelegd door de 80 bij 80 high-speed camera als een individueel frame. Wanneer de paginamodus is ingesteld op absolute frame, wordt het met de tweede camera verkregen hoge-resolutiebeeld via NeuroPlex-displaycommando's over de pixelkaart van het ruwe beeld geplaatst.

Hiervoor moet de paginamodus worden gewijzigd van absolute trace naar traces en moet er een supergeponeerd beeld worden geselecteerd binnen het weergavecommando. Gebruik de muis om individuele pixels of groepen pixels te selecteren uit het beeld dat in de paginawaergave wordt getoond. De outputs van deze regio's van belang (regions of interest) verschijnen als traces in het trace-weergavevenster, waardoor de grootte van de optische veranderingen die door die pixels zijn geregistreerd als functie van de tijd zichtbaar wordt.

Het inverteren van de grijswaardenschaal in de afbeelding met hoge resolutie verbetert de visualisatie op de weergavepagina van de trace-modus en het wordt sterk aanbevolen om een analoog signaal van de stimulator weer te geven. Selecteer het analoge uitgangskanaal om dit in het venster van de trace-weergave op te nemen. Deze output geeft de exacte timing aan van de stimuli die tijdens het experiment zijn toegepast.

Om de gegevens als een film te bekijken, gebruikt u de movie-commando's binnen neuro plex om opeenvolgende frames binnen een dataset weer te geven met pseudokleurenschalen die zijn aangepast aan de maximale en minimale verandering in fluorescentie-intensiteit. Een ganglion uit een preparaat van een myenterische plexus, gekleurd met DIA four A-N-E-P-P-D-H-Q, werd gefotografeerd met de camera met hoge resolutie en een 60x objectief. Tijdens de gegevensverwerving werd het preparaat gestimuleerd met een reeks van vijf pulsen bij 40 hertz.

Met elke puls met een amplitude van 15 milliamps en een duur van 0,5 milliseconden werden vier regio's van belang of ROI's geïdentificeerd en werden traceringen gegenereerd om de optische gegevens weer te geven, gemiddeld over de geselecteerde regio's in de pseudokleurframevolgorde van de eerste optische responregio's van membraandepolarisatie, waarbij neuronale activiteit verschijnt als geel tot rood. Deze gegevens geven aan dat door stimulatie opgewekte activiteit plaatsvindt in discrete regio's van elk ganglion, voornamelijk gedragen door passage-axonen. De ROI's twee, drie en vier identificeren individuele neuronen op verschillende afstanden van ROI één.

Figuur twee illustreert bij een 10 x vergroting de anatomische paden waarlangs informatie zich kan voortplanten; de pijlen geven de richting aan die de stimulus volgt om het geïdentificeerde myenterische ganglion te activeren. We hebben zojuist de componenten van een optische opstelling getoond voor het registreren van elektrische activiteit met voltagesensitieve kleurstoffen en hoe, wanneer deze technologie wordt toegepast op het enterische zenuwstelsel, dit de mogelijkheid opent om de functionele connectiviteit binnen en tussen twee intacte zoogdiernetwerken onder de microscoop te bestuderen. Bij het gebruik van optische registratietechnologie is aandacht voor detail uiterst belangrijk.

Bronnen van optische, mechanische en elektrische ruis moeten zorgvuldig worden beheerst en de vitaliteit van het preparaat moet nauwgezet worden behouden. Daarom is beheersing van alle individuele stappen van dit protocol essentieel om succes te behalen bij optische registratie. Dat is alles.

Hartelijk dank voor het kijken en veel succes met uw experimenten.