Genetische studies van het menselijk DNA Repair eiwitten met behulp van gist als een model-systeem

WRN-plasmiden worden gedigesteerd met de restrictie-endonucleasen SelI en MluI, waarna de fragmenten via gelzuivering worden geïsoleerd. Deze expressievectoren met gedigesteerde SelI-tot-MluI WRN-fragmenten worden vervolgens geligeerd in de SelI- en MluI-sites van de gistvector. Het multicopie-plasmide bevat tevens een TRP1-selectiemarker.

W Rrn-constructen worden via standaardprotocollen getransformeerd in gist en transformanten worden geselecteerd op synthetische complete glucosemedia zonder tryptofaan. Individuele transformanten worden vervolgens uitgestreken op synthetische complete glucosemedia zonder tryptofaan en platen worden geïncubeerd vanaf de masterplaat. Om het herstel van het fenotype van trage groei in WRN-getransformeerde SGS1 top drie dubbelmutante stamtransformanten te analyseren, worden deze uitgestreken op platen met glucose of galactose.

Om het effect van WRN-expressie op de HU- en MMS-gevoeligheid te analyseren, wordt er spotting uitgevoerd om de celcyclusverdeling van WRN-expresserende gistcellen te bepalen. Er wordt DAPI-kleuring uitgevoerd. De expressie van WRN in de heterologe gastheer wordt geanalyseerd via Western blot-analyse.

Hallo, ik ben Robert Broch van de sectie DNA-helicases in het laboratorium voor moleculaire gerontologie bij het National Institute on Aging, een van de instituten van de National Institutes of Health. Hallo, ik ben Monica Agarwal, eveneens van de sectie DNA-helicases in het laboratorium voor moleculaire gerontologie bij het National Institute on Aging. Het begrijpen van de rollen van menselijke DNA-reparatie-eiwitten en genetische routes is een aanzienlijke uitdaging voor veel onderzoekers.

Genetische studies in zoogdiersystemen zijn beperkt gebleven door een gebrek aan gemakkelijk beschikbare hulpmiddelen, waaronder mutante genetische cellijnen, reguliere expressiesystemen en geschikte selecteerbare markers. Vandaag tonen we u procedures waarbij gist als modelsysteem wordt gebruikt om de moleculaire en cellulaire functies van een DNA-ontwindingsenzym, bekend als een helicase, te onderzoeken bij het voorkomen van vroegtijdige veroudering. Wij gebruiken deze procedures in ons laboratorium om de rol van het menselijke burner-genproduct genetisch te karakteriseren, dat defect is in DNA-herstel en het behoud van genomische stabiliteit bij deze aandoening van vroegtijdige veroudering.

Het Werner-syndroom is een van de vijf humane RecQ-familie helicasen in gist. Er is slechts één benoemde sgs1-stam om de rol van het humane Werner-eiwit in de respons op replicatiestress te bestuderen. We hebben het effect van Werner-expressie in een gist-mutante achtergrond op diverse biologische eindpunten onderzocht.

Laten we beginnen. Aangezien we gist als heterologe gastheer zullen gebruiken, is onze eerste stap het kloneren van het menselijke Werner-gen of de variant daarvan in een gistvector. Werner-plasmiden werden gedigesteerd met de restrictie-endonucleasen SalI en MluI, waarna de gezuiverde fragmenten werden geligeerd in de SalI- en MluI-sites van de gist-expressievector die onder regulatie staat van een galactose-induceerbare promoter.

Het multi-copy plasmid bevat tevens een TRP1-selectiemarker. Deze Werner-expressieplasmiden worden vervolgens getransformeerd in de geschikte tryptofaan-auxotrofe giststammen die in deze studie worden gebruikt. De transformanten worden geselecteerd door de suspensie uit te platen op synthetisch compleet glucosemedium.

Incubeer de platen zonder tryptofaan bij 30 °C gedurende drie tot vier dagen totdat de kolonies verschijnen. Zodra de kolonies zijn gegroeid, worden individuele transformanten uitgestreept op synthetische complete glucosemedia en worden de platen drie tot drie dagen bij 30 °C geïncubeerd. De gemuteerde giststammen die het menselijke weer-gen en de varianten daarvan tot expressie brengen, worden vervolgens onderzocht op cellulaire fenotypes met de technieken die in de volgende secties worden gedemonstreerd.

De top drie-mutant vertoont een ernstig groeidefect. Echter onderdrukt een mutatie in het SGS1-gen het fenotype van trage groei van de top drie-mutant. Om het effect van Werner-expressie op de groei van wild-type SGS1- of SGS1-top drie-stammen te onderzoeken, werden de betreffende stammen met de vector of het Werner-expressieplasmid uitgestreken op synthetische complete mediumplaten zonder tryptofaan, maar met 2% glucose of 2% galactoses als positieve controle. Het effect van SGS1-expressie werd bepaald door de platen twee dagen bij 30 °C te incuberen.

Wildtype- en SGS1-mutante stammen getransformeerd met de vector of Werner vertonen geen verschil in hun groeipatroon. Echter, de met Werner getransformeerde SGS1 top three-dubbelmutante stam groeit significant langzamer dan de met vector getransformeerde SGS1 top three-dubbelmutante stam om de functionele vereisten van Werner voor het herstel van het langzame groeifenotype te beoordelen. In de sgs1 top three-achtergrond werden sgs1 top three-stammen getransformeerd met Werner katalytische domeinmutanten uitgestreept op synthetische complete platen zonder tryptofaan, bevattende ofwel 2% glucose of 2% galactose, gedurende twee dagen.

Incubatie van de Werner-exonuclease-mutant, aangeduid als E 84 A, herstelt het fenotype van trage groei zoals bij Werner, wat aantoont dat exonuclease-activiteit niet vereist is voor het herstel van het fenotype van trage groei bij de top drie. De Werner-helicase-mutant groeit goed, wat aantoont dat Werner-helicase-activiteit wel vereist is voor het herstel van het fenotype van trage groei bij de top drie. Om het vermogen van Werner om de groeisnelheid van sgs te beïnvloeden te bepalen.

Strijk een van de top drie stammen met lagere eiwitexpressieniveaus, sgs1 top drie stammen getransformeerd met de vector Werner of sgs1, uit op synthetische complete platen zonder tryptofaan, maar met toenemende concentraties galactose. Incubeer alle platen twee dagen bij 30 °C. Werner en de Werner-exonucleasen mutant herstellen het top drie slope-fenotype bij alle galactose-niveaus.

Echter, Werner-helicase-mutanten doen dat niet. Er is aangetoond dat de SGS1 top-drie dubbelmutant minder gevoelig is voor het DNA-alkylerende middel methylemethansulfonaat (MMS) of de replicatieremmer hydroxyureum (HU) dan de top-drie enkelmutant. Om het effect van Werner-expressie op de MMS- en HU-gevoeligheid van SGS1- of SGS1 top-drie-stammen te bepalen, worden giststammen die zijn getransformeerd met de vector of Werner als controle gekweekt in synthetisch compleet raffinosemedium zonder tryptofaan bij 30 °C.

Gebruik een wild-type ouderstam getransformeerd met de vector; herentoleer alle culturen in synthetisch compleet raffinosemedium zonder tryptofaan en kweek deze bij 30 °C tot de vroege logfase. Wanneer de culturen zich in de vroege logfase bevinden, bereid dan tienvoudige seriële verdunningen tot 10.000-voudig van deze stammen met behulp van synthetisch compleet medium zonder tryptofaan. Spot vier µL van elke verdunning op synthetisch compleet GAL-medium platen zonder tryptofaan die 10 mM HU of 0,0025% MMS bevatten. Incubeer de platen gedurende vier dagen bij 30 °C. Een SGS1-TOP3 dubbele mutant die getransformeerd is met wild-type SGS1.

Eén vertraagt in de late SG twee fase van de celcyclus, wat resulteert in een haltervormige morfologie. In tegenstelling hiermee voltooien wild-type gisten de celdeling, waardoor er minder haltervormige cellen overblijven om de celcyclusdistributie van de Werner-getransformeerde sgs one top drie stam te bestuderen. Kweek eerst logaritmisch groeiende culturen van de volgende stammen in synthetisch compleet RAF-medium zonder tryptofaan bij 30 °C gedurende de nacht.

Transformeer SGS one top drie met vector Werner of SGS one en de vector-getransformeerde wildtype ouderstam; herentoleer de culturen bij een OD van 0,05. Laat de culturen na herentolering groeien tot een OD van 0,5 en oogst deze door centrifugatie. De Werner-expressie wordt vervolgens geïnduceerd door galactose toe te voegen in een concentratie van 2%. Laat de culturen zes uur lang groeien bij 30 °C.

Oogst na zes uur de culturen en verzamel de cellen door middel van centrifugatie. Breng de culturen na centrifugatie over naar microcentrifugebuisjes en was de cellen eenmaal met PBS. Fixeer de cellen vervolgens gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur in 70% ethanol; was de gefixeerde cellen na afloop tweemaal met PBS en resuspendeer de cellen in XPBS.

Plaats de celsuspensie op een objectglas en voeg vector shield toe. Montage medium met DAPI in een concentratie van 1 µg/mL. Onderzoek de objectglazen onder een XI Saxo vert-microscoop om te zoeken naar cellen met haltervormige kernen, wat kenmerkend is voor gistcellen in de SG2-fase van de celcyclus.

Om de expressie van het Werner-eiwit of de variant daarvan in getransformeerde SGS one- of SGS one top three-giststammen te bepalen, worden de stammen eerst zes uur lang gekweekt in medium met galactose om de expressie van het Werner-eiwit te induceren. Nadat de cellen door centrifugatie zijn geoogst, worden ze gewassen met PBS en opnieuw gesuspendeerd.

Een alkalische lysisbuffer. Kook de cellen vijf minuten, clarificeer vervolgens door centrifugatie en neutraliseer met één molar zoutzuur. Deze lysaten zijn nu klaar voor elektroforese in 8 tot 16% polyacrylamide SDS-gels om het expressieniveau van het Warner-eiwit te bepalen onder invloed van variërende concentraties galactose.

Induceer eerst de culturen gedurende zes uur met variërende galactoseconcentraties. Oogst vervolgens de cellen door middel van centrifugatie en resuspendeer deze in puffer met protease-remmers. Voeg glaskralen van 425 tot 600 microns toe aan het mengsel en lyseer de cellen door één minuut op hoge snelheid te vortexen, gevolgd door één minuut koelen op ijs.

Herhaal dit in totaal acht keer. Centrifugeer vervolgens het resulterende homogenaat vijf minuten lang bij 15, 000 Gs en verzamel de supernatante fractie. Nadat de hoeveelheid eiwit in de lysaatfracties is gemeten met de Bradford-methode, worden gelijke eiwitconcentraties gescheiden op 8 tot 16% polyacrylamide SDS-gels. De expressie van Werner wordt vervolgens bepaald via Western blot voor de Werner-expressie in sgs.

Sgs1-top3 herstelt het fenotype van langzame groei van top3, zoals te zien is op deze foto's. Sgs1-top3-stammen getransformeerd met vector Werner of sgs1 werden uitgestreken op een SC-tryptofaanplaat die 2% glucose of 2% galactose bevat. De galactose-geïnduceerde expressie van Werner zorgt ervoor dat de sgs1-top3-stam langzamer groeit.

In tegenstelling hiermee is de wild-type ouderstam of de met Werner getransformeerde SGS one-stam niet beïnvloed in de groei, wat aangeeft dat de vertraagde groei die door Werner wordt veroorzaakt specifiek is voor de sgs. One top three-achtergrond. Wanneer SGS one top three-stammen die getransformeerd waren met varianten van Werner werden uitgestreken op SC-tryptofaanplaten die enkel 2% glucose of 2% galactose bevatten.

De exonuclease-deficiënte Werner was nog steeds in staat om het fenotype van trage groei te herstellen. Dit bewijst dat de ATPase-helicase-activiteit van Werner, maar niet de exonuclease-activiteit, vereist is om het fenotype van trage groei van top three te herstellen. In een SGS one top three achtergrond herstelde Werner het fenotype van trage groei van SGS one top three over het gehele bereik van de GAL-concentratie.

Deze resultaten geven aan dat het herstel van het fenotype van langzame groei in de sgs one top three mutante achtergrond plaatsvindt bij lage expressieniveaus van het Werner-eiwit. Wanneer logaritmisch groeiende culturen van sgs, one top three stammen getransformeerd met Werner of varianten daarvan in tienvoudige seriële verdunningen werden gespot op SC-tryptofaanplaten met glucose of galactose en MMS of HU, observeerden we dat Werner-expressie de gevoeligheid voor MMS en HU van de SGS one top three stam verhoogde. Bovendien vereist dit effect op de MMS- en HU-gevoeligheid in de SGS one top three achtergrond de helicase-activiteit van Werner ATP, maar niet de exonuclease-activiteit.

Ten slotte herstelt de expressie van Werner ook de karakteristieke SG two delay van top three, zoals blijkt uit de verhoogde populatie grote butted cellen. In de sgs one top three mutantcellen die Werner tot expressie brachten. In vergelijking met sgs, one top three cellen getransformeerd met vectorcellen werden gekleurd met Dabi.

Om de kernen te visualiseren; de pijlen geven de expressie van Werner in ongedeelde kernen aan. In de getransformeerde sgs werden de bovenste drie cellen geïnduceerd door de aangegeven galactoseconcentraties toe te voegen, waarna de cellen zes uur na inductie werden geoogst. Gelijke hoeveelheden totaal cellysaat werden geladen op 8 tot 16% polyacrylamide SDS-gels, gevolgd door western blot-detectie met behulp van een anti-Werner-antilichaam.

We hebben u laten zien hoe u de cellulaire fenotypen kunt onderzoeken die geassocieerd zijn met gedefinieerde gistmutant-achtergronden om de cellulaire en moleculaire functies van het menselijke leergen te verduidelijken, bemiddeld door de katalytische activiteiten en eiwitinteracties ervan. Gist kan worden gebruikt als modelorganisme om de functies van het gen in gedefinieerde pathways te bestuderen. Bij het uitvoeren van deze procedures is het belangrijk om een geschikte gistmutant-achtergrond te selecteren om de rol van het onderzochte gen in gedefinieerde pathways te kunnen onderscheiden.

Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.