Denaturerende gradiënt Gel Elektroforese (DGGE)

Hallo, mijn naam is Celeste Peterson en ik ben een fellow aan de Harvard University waar ik onderzoek doe naar microbiële biofilmgemeenschappen. Ik breng de bacteriële gemeenschappen in kaart door naar hun 16S rRNA-sequentie te kijken en te analyseren hoe deze sequentie in de loop van de tijd en in de ruimte verandert. Om dit te bereiken, maak ik gebruik van DGGE.

Dit is geen normale acrylamidegel; deze moet op 60 °C worden gehouden tijdens de run en de buffer moet continu worden gepompt. Daarom gaan we de buffer ongeveer een uur opwarmen tot deze 60 °C is, waarna we de run kunnen starten. Nu ga ik deze plaat wassen met een verdunde uc-oplossing, terwijl ik controleer op onzuiverheden, en dan spoelen we het af.

Alles wat daarmee te maken heeft kan regelmatigheden veroorzaken. Het is belangrijk om al het water weg te vegen. Daarom plaats ik, bij het samenstellen van de gel, die chip aan de buitenkant van de gel.

De gel bevindt zich dus tussen deze twee glasplaten en de chip bevindt zich aan de buitenkant, zodat deze de gel ertussen niet beïnvloedt. Nu ga ik de gel in deze klemmen monteren, waarna ik ze samenknijp en vastdraai door naar rechts te draaien. Zoals bij elke gel is het belangrijk om te controleren of de onderkant vlak is.

Om lekken te voorkomen, draaien we de gel nu om en plaatsen we deze hier om hem met de pakking af te sluiten. Het is bij deze stap belangrijk dat de platen precies uitgelijnd zijn met de pakking. De knoppen aan de zijkant worden vervolgens ingedrukt om de afdichting vast te zetten.

Dit is een spuit van 30 ml. Dit onderdeel en dit onderdeel worden meegeleverd met de Bio-Rad kit en worden op deze manier bevestigd. Dit is uitsluitend bedoeld om het overtollige water in de buisjes te verwijderen.

Plaats de slang op de gel om de gel te laden. Plaats eerst een adapter in de slang en vervolgens een naald met die kleine adapter, en zet deze precies in het midden van de gel, net onder het onderste glas. Daarna gaat deze draadadapter in de lange slang en wordt deze verbonden met twee spuiten die de oplossingen met hoge en lage dichtheid bevatten.

Dit zijn vooraf bereide oplossingen. In de blauwe heb ik een kleurstof toegevoegd om aan te geven dat dit de meest denaturerende oplossing is, en dit is de minst denaturerende oplossing, de oplossing met de lage dichtheid. Ze bevatten alle benodigde componenten.

En nu ga ik het maken, eigenlijk maak ik er wekelijks twee keer zoveel. Zodra de temperatuur is bereikt, heeft u ongeveer vijf tot zeven minuten om de gel te vullen voordat de kolommen stijgen. We vullen nu de spuit met de oplossing.

Ik ga het vullen met ongeveer 15 µL van de oplossing. Om vervolgens eventuele luchtbellen te verwijderen, houd ik het ondersteboven en knijp ik er voorzichtig in totdat de bovenste luchtbel verdwenen is. Nu gaat dit kleine schroefje hier in deze groef.

Deze adapter wordt uitgelijnd met deze klem, waarna deze met een C-klem zeer stevig wordt vastgezet. Vervolgens wordt deze slang aan de spuit bevestigd. Dezelfde procedure wordt uitgevoerd aan de andere zijde met de matrix met hoge dichtheid waar de afgifte plaatsvindt.

Vervolgens zal ik dit wiel in een gestage beweging met de klok mee draaien. Eerst zal de blauwe oplossing naar buiten stromen, omdat deze de hoogste concentratie heeft, en deze zal het onderste deel van de gel vormen. Na een tijdje zal de kleurloze oplossing de gel beginnen te vullen en zal de gradiënt worden gevormd.

Houd het moment vlak op een hoek en zodra u klaar bent met het gieten van de gel, spoelt u uw buisjes onmiddellijk uit omdat ze zullen polymeriseren. Daar gaat de groep. Druk vervolgens naar beneden. Dus dit kleine stukje, en aan de andere kant doe ik hetzelfde. Oké.

Hoi, mijn naam is Celeste Peterson en ik ben een fellow aan de Harvard University waar ik microbiële biologische gemeenschappen bestudeer. Ik maak profielen van de bacteriële gemeenschappen door te kijken naar hun 16S rRNA-sequentie en hoe deze sequentie in de loop van de tijd en in de ruimte verandert. Hiervoor maak ik gebruik van DGGE.

DGE staat voor denaturerende gelelektroforese. In essentie is het idee dat er een gradiënt aanwezig is en dat het DNA, terwijl het door deze gradiënt beweegt, denatureert. Hierdoor zullen verschillende soorten op verschillende punten langs de gradiënt stoppen.

Zo vormt het een vingerafdruk van de verschillende soorten seksiness in de gemeenschap. Het doel van mijn experiment is dus om vast te stellen wie er in de gemeenschap aanwezig zijn en hoe dit in de loop van de tijd en in de ruimte verandert. Ik kan de seksiness DDD-gel draaien, vervolgens de banden uitsnijden en de soorten identificeren die in elke gemeenschap vertegenwoordigd zijn.

Een van de grootste uitdagingen bij het maken van een DDG-gel is het bepalen van de meest geschikte gradiënt. Dit is iets waarvoor geëxperimenteerd moet worden om per specifieke gemeenschap vast te stellen welk type gradiënt optimaal is. De gradiënt die ik vandaag gebruik is 35 tot 55% urea.

Een van de grootste problemen die bij deze techniek kunnen optreden, is het ontstaan van uitgesmeerde banden (smears) in de lanes. Ik heb gemerkt dat, om wat voor reden dan ook, een van de beste oplossingen is om de gels gedurende een zeer lange tijd te laten lopen, waardoor de smears verdwijnen. Vandaag gebruik ik het voor algemene bacteriële gemeenschappen, maar dit kan ook worden toegepast op een specifieke bacteriefamilie om te zien hoe deze in de loop van de tijd veranderen; dat levert doorgaans zeer schone gels op.

Met DDGE kunt u ook mutaties in enkelvoudige genen onderzoeken.