Het meten van de Induced Membraan Voltage met Di-8-ANEPPS

Voor een bioloog is een cel de bouwsteen van het leven die een aantal verschillende organellen bevat; elk hiervan voert specifieke taken uit die samen de cel in staat stellen zijn vitale functies te vervullen. Vanuit een elektrisch perspectief is de interne structuur echter niet van groot belang, en de cel kan worden beschouwd als een geleidend cytoplasma omsloten door een isolerend membraan en omringd door een geleidende buitenomgeving. Een kleine onbalans in de ionenconcentraties, waarbij de overschot-ionen zich dicht bij het membraan ophopen, resulteert in de rustmembraanspanning.

Het plaatsen van een cel in een elektrisch veld veroorzaakt een lokale herverdeling van lading aan beide zijden van het membraan. Dit resulteert in de geïnduceerde membraanspanning, die wordt opgeteld bij de rustspanning en verdwijnt zodra het veld wordt uitgeschakeld. Bij eenvoudige celvormen kan de geïnduceerde membraanspanning analytisch worden berekend voor een bolvormige cel.

Dit wordt bepaald door de vergelijking van Schwan, die stelt dat de spanning proportioneel is aan de veldsterkte en de celgrootte, en de cosinusfunctie langs het membraan volgt. Bij complexere celvormen kan de geïnduceerde spanning aanzienlijk afwijken van de cosinusfunctie en moet deze ofwel numeriek worden bepaald met behulp van een krachtige computer, of experimenteel met behulp van een potentiaalmetrische kleurstof. Een van de potentiaalmetrische kleurstoffen die hiervoor veelvuldig wordt gebruikt, is di-electric AIPs.

Een snelle kleurstof met excitatie- en emissiespectra die afhankelijk zijn van de membranespanning, AIPs worden sterk fluorescent wanneer ze aan het membraan gebonden zijn, waarbij de verandering in fluorescentie-intensiteit proportioneel is aan de verandering in membranespanning. Deze video toont het protocol voor het meten van de geïnduceerde membranespanning met behulp van D AIPs. In dit voorbeeld worden Chinese hamsterovariumcellen gebruikt; plaat de cellen in kamers met 100.000 cellen per kamer.

Incubeer de cellen in hun kweekmedium in HAMF 12-medium, aangevuld met foetaal kalfsserum, L-glutamine en antibiotica, gedurende twee tot vier uur om aanhechtende cellen met een bolvormige vorm te verkrijgen, of 16 tot 20 uur om enkele aanhechtende cellen met complexere vormen te verkrijgen. Bereid een stockoplossing van 10 million MO DiBAC₄(3) voor door het in de oorspronkelijke vial op te lossen in DMSO. Sommige cellijnen kunnen extra saponine vereisen om de incorporatie van de kleurstof in het membraan te vergemakkelijken. Overbreng één milliliter Spinner's modificatie van het minimum essential medium (SMEM) naar een EOL-buis, voeg 2,5 µL van 20% saponine en drie µL van 10 mM DiBAC₄(3) toe.

Dit levert een laadoplossing op die ongeveer 30 micromolar diet aaps en 0,05% of onic bevat. Vervang het cultuurmedium in de kamer door de laadoplossing. Plaats de kamer gedurende 10 minuten in de koelkast bij een temperatuur van vier graden Celsius.

Om de internalisatie van de kleurstof via het plasmamembraan na het kleuren grotendeels te remmen, wordt de overtollige kleurstof voorzichtig meerdere keren weggespoeld met puur SMEM. Laat tot slot 1,5 milliliters SMEM in de kamer achter. De cellen worden waargenomen met een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een olie-immersieobjectief, een monochromator en een CCD-camera.

Stel in de acquisitiesoftware de excitatiegoelengte in op 419 nanometer en kies een banddoorlaatfilter ingesteld op ongeveer 605 nanometer, hoewel dit hier niet is toegepast. Diet aaps maakt ook ratio-metingen van de membraanspanning mogelijk. Plaats de kamer met cellen op de microscooptafel, positioneer de elektroden onderin de kamer en sluit deze aan op de pulsgenerator.

In dit voorbeeld wordt een vierkante puls gegenereerd met een amplitude van 35 volt en een duur van 50 milliseconde. Met behulp van een DC-spanningsbron en een door een microprocessor aangestuurde schakelaar wordt de puls afgegeven aan een paar elektroden, waardoor er een elektrisch veld tussen hen ontstaat en de membraanspanning wordt geïnduceerd. De afgifte van de puls moet worden gesynchroniseerd met de beeldacquisitie.

Zoek de cellen van belang en pas voor elke puls een enkele elektrische puls of een reeks pulsen toe. Neem twee fluorescentiebeelden op: het controlebeeld direct vóór de puls en het pulsbeeld tijdens de puls, vanwege de lage respons van de kleurstof. De veranderingen in de fluorescentie zijn moeilijk te onderscheiden en worden pas duidelijk na het verwerken van de beelden voor elke puls.

Trek de achtergrond af in zowel het controlebeeld als het pulsbeeld. Kies een cel en stel het interessegebied zo in dat dit overeenkomt met het membraan. Meet de fluorescentie langs dit gebied in het controle- en pulsbeeld en draag de waarden over naar een spreadsheet voor elke puls.

Trek de controledata af van de pulsdata en deel het resultaat door de controledata om de relatieve fluorescentieveranderingen te verkrijgen. Als er een reeks pulsen wordt toegepast, kunnen de relatieve veranderingen die voor elke puls zijn bepaald, worden gemiddeld. Voor een betrouwbaardere meting kunnen de relatieve fluorescentieveranderingen worden omgezet in de geïnduceerde membraanspanning.

Met behulp van een kalibratiecurve kan een ruwe schatting van deze curve uit de literatuur worden verkregen, maar voor een hogere nauwkeurigheid moet deze voor elke specifieke opstelling worden gemeten. Zet de spanning uit tegen de relatieve booglengte. De curve kan tevens worden gladgestreken met behulp van een geschikt filter voor sferische cellen.

De resulterende grafiek benadert een cosinus, in overeenstemming met de vergelijking van Schwan. Voor complexere celvormen levert dezelfde procedure ingewikkelder ruimtelijke verdelingen van de membraanspanning op.